Мейоз является процесс развития, в которой формируются гамет через один раунд репликации ДНК и двух раундов хромосома сегрегации. Используя технику для подготовки meiotic хромосома спреды могут рассматриваться млекопитающих мейоз. Здесь мы демонстрируем способ подготовки поверхности распространение ядра от мыши сперматоцитах.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Подготовка Meiotic хромосомы спреды от мыши Spermatocytes
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Млекопитающих мейоз представляет собой динамичный процесс развития, который происходит в зародышевых клеток и могут быть изучены и характеризуется. С помощью метода распространения ядер на поверхности слайдов (а не снижается их с высоты), мы показываем оптимизированный технику на мыши сперматоцитах, который был впервые описан в 1997 году. Этот метод широко используется в лабораториях для изучения млекопитающих мейоз, потому что он дает множество высокого качества ядер претерпевает подэтажи профаза I. семенных канальцев, сначала помещаются в гипотонический раствор к набуханию сперматоцитах. Затем сперматоцитах выпускаются в раствор сахарозы для создания суспензии клеток, ядер распространяются на фиксатор пропитанной стеклянных скольжениях. После иммуноокрашивания разнообразия белков уместны meiotic процессов может быть проверен. Например можно легко визуализировать белков синаптонемного комплекса, трехстороннюю структуру, которая соединяет хромосомы осей/ядер гомолог вместе. Meiotic рекомбинации белки, которые участвуют в ремонте двухнитевые разрывы ДНК, гомологичная рекомбинация, также может быть immunostained для оценки прогрессирования профазе I. Здесь мы опишем и продемонстрировать в деталях техника широко используется для изучения млекопитающих мейоза в сперматоцитах от несовершеннолетних или взрослых самцов мышей.
Введение
Мышей широко используются как организм модель для изучения мейоза у млекопитающих. Можно оценить как нормальные процессы развития, так и дефекты, которые происходят во время мейоза. Сроки и прогрессии характерных особенностей, которые происходят в профазе I и подэтажи, а также множество специфических белков, участвующих в процессах решающее значение для регулирования мейоз можно охарактеризовать в дикого типа и мутантов мышей. Несколько специализированных процессов, которые происходят во время мейоза, который учился в деталях (обзор в Генделя и Schimenti1). К ним относятся формирование ДНК двухручьевой перерыв (DSB) и ремонт, рекомбинации, формировании синаптонемного комплекса и хромосомы сегрегации.
Важным аспектом изучения meiotic процессов является возможность изучения ядер, содержащий гомологичных хромосом, которые разрешаются визуально и оптически лучше различать и идентифицировать подэтажи профаза I. профазе I состоит из 5 подэтажи которые характеризуются конкретные функции, включая формировании синаптонемного комплекса (SC). СК является трехсторонняя белка эшафот, что позволяет сопряжения и ДНК двухручьевой перерыв ремонт гомолог. Во время leptonema гомолог выровнять изложенные осевой элементы СК. Затем вложения центральных элементов синаптонемного комплекса во время zygonema облегчает спаривания и физической связи (Синапсис) между парами гомолог. Во время pachynema Синапсис гомолог становится полным и ДНК кроссоверы формируются из ремонта выберите населения двухнитевые разрывы ДНК через гомологичная рекомбинация. SC дизассемблирует во время diplonema, позволяя гомолог desynapse, но остаются прикрепленными на их центромеры и на участках ДНК кроссоверы. Наконец, во время diakinesis, гомолог recondense и происходит переход к метафазы1.
Исторически, поверхность распространение meiotic хроматина принесли несколько ядер, особенно тех, кто с ранних стадиях профазе I2. В результате эти методы были изменены для улучшения разделения клеток тканей (то есть яички или яичников), методика распространения meiotic хроматина, а доходность meiotic ядер высокого качества для оценки2,3, 4. Кроме того, этот метод оказался полезным в сохранении ядерного и хроматина связаны белков в ядрах meiotic как свидетельствуют опубликованные immunolocalization методы5,6,7. Таким образом, метод первоначально описано Питерс2 и продемонстрировали здесь урожайности многих отдельных взрыв Сперматоцит ядер, содержащие гомолог переживает leptotene, zygotene, pachytene, diplotene и diakinesis подэтажи профаза я.
Методика подготовки поверхности распространение ядер (также называется хроматином распространение анализ) широко используется для изучения мейоза в областях репродуктивного здоровья и ячейки биологии. Слайды, содержащие поверхности распространение ядер может быть впоследствии immunostained с антителами к протеинов интереса или подвергнут Серебряный пятнать и затем анализируются с помощью микроскопии. Метод аналогичен для мужчин и женщин мышей, хотя для самок мышей2были описаны изменения. Важно, чтобы не overmince семенных канальцев. Ядра должны также распространяться таким образом, чтобы после гомолог иммуноокрашивания и связанные протеины отчетливо видны с микроскопией. Поверхность распространение ядра может быть подготовлен в течение нескольких часов и либо immunostained немедленно или температуре-80 ° C для максимум 3 недели до оттаивания и иммуноокрашивания. Однако оптимальные результаты получаются лучше всего для некоторых белков если иммуноокрашивания выполняется немедленно или в течение 2 недель подготовки поверхности распространение ядер. Слайды можно immunostained с стандартным протоколом, с использованием антител для протеинов интереса, следуют инкубации с конъюгированные для флуоресцентных белков вторичные антитела или красители, а затем образ с флуоресцентной микроскопии8. На послеродовом день 15-21 существует достаточно ткани на пару семенников дикого типа приносить слайды 6-10, и старых мышей (включая взрослых) даст больше слайдов. Однако мышей дикого типа 6 недель и старше также даст более пост meiotic клетки (то есть сперматид) на слайдах, после иммуноокрашивания. Кроме того все подэтажи профаза я можно наблюдать в отношении несовершеннолетних и взрослых мышей. Яички от мужчины на послеродовых дней 10 до 15 принесет много больше leptotene и zygotene клеток. Мышей старше послеродовой дня 14-15 принесет больше pachytene и diplotene ядер.
Здесь мы опишем и продемонстрировать широко используется метод подготовки поверхности распространение ядра от мыши сперматоцитах.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все методы, связанные с мышей использовать высокие этические и благополучия и были утверждены институциональный уход животных и использования Комитетом на колледж медицины университета Дрексел.
1. Подготовка решений и инструментов, необходимых
- Подготовьте гипотонический извлечения буфер (иврит) в 50 мл сверхчистого лаборатория качества воды, рН 8,2-8.4 (таблица 1). Сделать решение свежий каждый раз, держать на льду и использовать в течение 2 ч подготовки спреды; Это необходимо для оптимизации сокращения и протеазы, препятствующих деятельности DTT и PMSF, соответственно. Для каждой пары яичках мыши используйте 10 мл Евр.
- Приготовляют раствор сахарозы 100 мм (свежий каждый раз), добавив 0,342 г сахарозы в 10 мл сверхчистого лаборатории класс воды. Отрегулируйте пэ-аш до 8.2
- Приготовляют раствор фиксаторные (1% параформальдегида (PFA), 0,15% Тритон X-100, рН, скорректированы 9.2 с 1 N HCl или N 1 NaOH) свежие ежемесячно и хранить его при комнатной температуре в защищенном от света. Разбавить 16% коммерчески доступных PFA начальный запас до 4% в 1 X PBS для использования в качестве рабочей, а затем хранить аликвоты 4% при температуре-20 ° C.
- Чтобы подготовить фиксирующие решение, добавить 10 мл 4% раствора PFA и 600 мкл 10% Тритон X-100 до 30 мл ПБС, хорошо перемешать и скорректировать рН 9.2 с 1 N HCl или N 1 NaOH. Фиксаторные решение Храните в 50-мл Конические трубки, завернутые в фольгу при комнатной температуре (для не более чем 4 недели).
- Подготовить Вымойте решения (в то время, как слайды сушки последние 30 минут) с фото-Flo 200: 0.4% фото-Flo 200/PBS (320 мкл фото-Flo 200 в 80 мл ПБС) и 0,4% фото-Flo 200/dH2O (160 мкл фото-Flo 200 в 40 мл воды класса сверхчистого лаборатории). Используйте опарник Coplin 50 мл, заполнены с 40 мл растворов для стирки 10 или меньше слайды одновременно.
- Подготовьте следующие документы: 1 пара хирургические ножницы (надрезать кожу), 1 пара штрафа отзыв хирургические ножницы (надрезать брюшины), 2 пары прямо штрафа отзыв щипцов (чтобы вскрыть из каждого яичка), 1 прямой край лезвия (для надрезать каждого яичка), 2 пары Изогнутый пинцет наконечник (для иммобилизации каждого яичка и выжать из семенных канальцев), баночки по 50 мл Coplin, тефлон печатных 3 кольцо слайды, 1 скальпеля с размер 11 лезвия, увлажненные камеры, Петри 100 x 15 мм, Постоянный маркер штрафа отзыв или карандаш и Шейкер вращающейся платформе.
- Место премиум незаряженных precleaned матовым конец стеклянных скольжениях вертикально в 50 мл Coplin кувшин наполнен фиксирующие решения до использования.
Примечание: Карандаш является предпочтительным, если слайды будут использоваться впоследствии в процедуры, требующие этанола, например флуоресценции в situ гибридизация.
- Место премиум незаряженных precleaned матовым конец стеклянных скольжениях вертикально в 50 мл Coplin кувшин наполнен фиксирующие решения до использования.
2. Сперматоцит ядер распространения
- Усыпить мужчины мыши согласно институциональных руководящих принципов (например, шейки матки дислокации с или без CO2 удушья).
- Использование P10 - P20 мужчины для оценки meiotic клетки в первой волне сперматогенеза; Мы постоянно используем P15 - P17 мужчин для получения клеток от всех подэтажи профаза I. предоставляемые взрослых яичек клетки от профаза, я тоже, но они также принесут более postmeiotic клеток, таких как сперматид.
- Урожай и весят семенников (запись парных весов); затем поместите их в чашку Петри, содержащие несколько капель холодной HEB, чтобы держать их влажными.
- Держите яички против нижней части блюдо с щипцы изогнутые наконечник и использовать прямой край лезвия бритвы, чтобы сделать небольшой вертикальной средней линии разреза через капсула яички. Пока все еще держащ яички против нижней части блюдо с одной щипцами, используйте второй набор изогнутый кончик щипцами или прямой край лезвия Осторожно выжать семенных канальцев от семенников.
- Поместите трубочки в 15 мл Конические трубки, содержащие 10 мл холодного HEB, заботясь, чтобы избежать положить куски капсулы в трубу. Повторите эти шаги с вторым яичком.
- Инкубируйте очищенные семенных канальцев в коническую пробирку, содержащую HEB на льду за 30-60 мин, в зависимости от размера яичек. Инкубировать семенных канальцев с пару семенников, весом 30 мг или менее 30 мин, трубочки с пару семенников, весом 31-50 мг за 30-45 минут и больше яичек на 60 минут. Не изменяйте значения времени для одного яичка.
Примечание: Оптимальной инкубации время может варьироваться в зависимости от опыта экспериментатора, реагентов, используемых, и мышей анализируются. - В то время как семенных канальцев инкубации в евр, используйте маркер или карандаш для обозначения матовое концы precleaned слайдов с помощью мыши, номер, номер слайда и дата. Затем поместите предварительно очищенных слайды в Coplin jar, содержащий фиксирующие решения.
- После инкубации Налейте трубочки и HEB чистой Петри и отдельные трубочки в приблизительно 3 мм диаметром сгустки. Каждый куст дает 2 горки и количество слайдов принесли зависит от размера яичек.
Примечание: Мы получаем 8 слайдов от дикого типа и 6 слайды из subfertile Chtf18-null P16 яичек (которые меньше благодаря снижению числа meiotic и митотического зародышевые клетки8). Ожидается, что один взрослый яички, весом 100 мг и более будет приносить 16 слайдов. - 23 место мкл раствора сахарозы 100 мм в одно кольцо тефлон печатных, 3 кольцо слайд и добавить один комок семенных канальцев в кольцо. Затем с помощью Изогнутый пинцет Совет провести комок, нежно фарш трубочки с лезвием размер 11 до тех пор, пока решение становится мутным.
Примечание: Не overmince как это приведет к фрагментации хромосом. Обратите внимание, что фрагментарный хромосом может быть также свидетельствует о черепашки фенотип. - Удаление мусора, еще 23 мкл раствора сахарозы и использовать микропипеткой, чтобы мягко Пипетка смеси вверх и вниз несколько раз, чтобы помочь отдельных клеток в суспензии.
- Удалить слайд, замачивания в Coplin jar, содержащий фиксирующие решения и наклона слайд над банку, так что один богатый капли собирает в нижнем углу слайда.
- Накапайте 20 мкл суспензии клеток сахарозы из кольца тефлон печатных 3 кольцо сползания фиксирующие капелька на премиум матовое стекло и пипетки подвески вверх и вниз 2 - 3 раза.
Примечание: Фиксирующие капелька должно быть достаточно большой объем, так что добавление 20 мкл суспензии клеток сахарозы к нему позволяет охват через весь слайд, когда смесь распределяется (см. ниже 2.11).
- Накапайте 20 мкл суспензии клеток сахарозы из кольца тефлон печатных 3 кольцо сползания фиксирующие капелька на премиум матовое стекло и пипетки подвески вверх и вниз 2 - 3 раза.
- Медленно наклоните слайд в сторону напротив капли для распространения суспензию клеток по длине слайда. Затем медленно наклоните слайд обратно для распространения суспензию клеток вдоль ширины слайда, чтобы покрыть ее полностью. Избегайте распространения подвески над той же области слайда более чем один раз иначе клетки будут пересекаться друг с другом.
- Сразу же место слайд квартиру в камере увлажненные и повторить шаги 2.8 до 2,11 до все кусты семенных канальцев были использованы для делать слайды. Важно не для перемещения увлажненные камеры во время процесса сушки, чтобы избежать перекрытия клетки и разрыву.
- Разрешить слайды для инкубации в камере покрыты увлажненной при комнатной температуре в течение 2,5 ч, так что они высыхают медленно и не полностью. Высокая влажность и медленного высыхания на этом этапе важно обеспечить надлежащее распространение хроматина. Затем снять крышку камеры и позволить слайды высохнуть полностью дополнительные 30 мин.
- Слайды (спина к спине или узором зигзаг) в опарник Coplin содержащих 0,4% раствор ПБС фото-Flo 200/1 и мыть дважды, слайды 5 мин, нежно агитацию Coplin банку на платформе вращение шейкер. Использовать свежие решения для каждого мыть и хранить слайды из разных мышей в отдельных банках для каждого из стирок.
- Вымойте слайды в Coplin jar, содержащий 0,4% фото-Flo 200/dH2O решение для 5 мин один раз во время агитацию.
- Удалить слайды из Coplin jar (последний мыть), тщательно протрите края и дно слайды, чтобы удалить лишнюю жидкость и место слайды на угловой, почти вертикально позиции для просушки. Экспериментатор, который владеет в этот метод может обрабатывать и подготовка поверхности распространение ядер из 4 или 5 мышей в один день.
- После высыхания (15-20 мин), процесс слайды сразу для иммунофлюоресценции пятнать или магазина на-80 ° С в плотно закрытой слайд ящик, защищенном от света для максимум 3 недели (в зависимости от оцениваемой; белков-мишеней оптимальные результаты могут быть получены при Витражи же день или в течение 2 недель).
- При температуре-80 ° C, затем позволяют слайды, чтобы прийти к комнатной температуре и мыть в опарник Coplin содержа 1 ПБС или блока за 5 мин до окрашивания.
Примечание: Многие различные иммунофлюоресценции пятная протоколы обеспечит хорошие результаты; обратитесь к Берковиц et al. для протокола иммуноокрашивания8.
- При температуре-80 ° C, затем позволяют слайды, чтобы прийти к комнатной температуре и мыть в опарник Coplin содержа 1 ПБС или блока за 5 мин до окрашивания.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Способность этого метода для предоставления большого количества поверхности распространяться ядер, содержащие нетронутыми гомолог зависит от трех основных факторов: 1) соответствующие инкубации время семенных канальцев в гипотонический буфера (т.е. Евр.) для получения адекватного пополнили Сперматоцит ядра, которые лопаются, но не разрушаются от длительного инкубации в евр, 2) micropipetting сахарозы капельки клеток для получения суспензию ядра, которые не сгруппировать вместе, и 3) кажды...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Для получения большого количества ядер Сперматоцит хорошо спред, хорошее качество, наиболее важные шаги настоящего Протокола включают соответствующие инкубации время семенных канальцев в евр, соответствующие фарша из семенных канальцев, и техника, используемых для Суспензию клеток сахарозы распространился фиксирующие покрытием слайды. Мы инкубировать семенных канальцев от семенников дикого типа мужчин, начиная от послеродового день 15 до совершеннолетия в Евр 45 мин, а яички от соответствующе возрасте Chtf18-nul...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют ничего сообщать.
Благодарности
Авторы признают технической помощи Abigail Харрис. Они также признают Паула Коэн и Ким Holloway для помогая оптимизировать протокол подготовки поверхности распространение ядра от мыши сперматоцитах. Авторы также признательны критических чтении рукописи, Карен Schindler.
Эта работа была поддержана NIH R01 GM106262 для K.M.B.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Photo-Flo 200 | Kodak | 1464510 | |
| 16% параформальдегида (водный раствор формальдегида) | Электронная микроскопия Sciences | RT 15710 | Развести 16% раствор в 4% оборотных материалах с 1X PBS и заморозить аликвоты при -20 °°; C |
| Тефлоновые печатные предметные стекла с 3 кольцами | Электронная микроскопия Sciences | 63418-11 | |
| Стеклянные стекла премиум-класса без заряда с матовым торцом | Несколько коммерческих брендов | Очистите предметные стекла в этиловом или изопропиловом спирте и дайте им высохнуть перед использованием; наклейте предметные стекла на матовый конец перманентным маркером или карандашом в зависимости от последующего использования предметных стекол | |
| Хирургические ножницы (острые и тупые кончики) | Инструменты | для тонкой науки14001-12 | Разные марки похожего типа будут работать |
| Хирургические ножницы с тонким наконечником (острые кончики) | Инструменты для тонкой науки | 14058-11 | Разные марки аналогичного типа будут работать |
| Прямые щипцы с тонким наконечником | Инструменты для тонкой науки | 11050-10 | Разные марки аналогичного типа будут работать |
| Изогнутые щипцы со средним наконечником | Fisher | 16100110 | Разные марки аналогичного типа будут работать |
| Ручка скальпеля | Fine Science Tools | 10003-12 | Разные марки аналогичного типа будут работать |
| Мышь анти-SYCP3 | Abcam | ab97672 | Использование в 1:300 |
| Антицентромерный белок (полученный из сыворотки пациента CREST человека) | Антитела Инкорпорированные | 15-234-0001 | Использование в 1:50 |
| Увлажненная камера | Мы используем квадратные посуды для культуры Nunc 500 см2/лунка с увлажненной бумагой полотенца | ||
| Широкопольный микроскоп с эпифлуоресценцией | Leica микросистемы | Любая стандартная модель | |
| Банки Coplin | Несколько коммерческих марок | емкостью 50 мл; диаметр 40 мм (1,6 дюйма), вмещает 10 предметных колец (спина к спине) | |
| Чашки Петри Несколько | коммерческих марок | диаметром 100 x 15 мм, полистирол стерильный необработанный |
Ссылки
- Handel, M. A., Schimenti, J. C. Genetics of mammalian meiosis: regulation, dynamics and impact on fertility. Nat Rev Genet. 11, 124-136 (2010).
- Peters, A. H., Plug, A. W., van Vugt, M. J., de Boer, P. A drying-down technique for the spreading of mammalian meiocytes from the male and female germline. Chromosome Res. 5, 66-68 (1997).
- Counce, S. J., Meyer, G. F. Differentiation of the synaptonemal complex and the kinetochore in Locusta spermatocytes studied by whole mount electron microscopy. Chromosoma. 44, 231-253 (1973).
- Speed, R. M. Meiosis in the foetal mouse ovary. I. An analysis at the light microscope level using surface-spreading. Chromosoma. 85, 427-437 (1982).
- Ashley, T., et al. Dynamic changes in Rad51 distribution on chromatin during meiosis in male and female vertebrates. Chromosoma. 104, 19-28 (1995).
- Baker, S. M., et al. Involvement of mouse mLh1 in DNA mismatch repair and meiotic crossing over. Nat Genet. 13, 336-342 (1996).
- Plug, A. W., Xu, J., Reddy, G., Golub, E. I., Ashley, T. Presynaptic association of Rad51 protein with selected sites in meiotic chromatin. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 5920-5924 (1996).
- Berkowitz, K. M., et al. Disruption of CHTF18 causes defective meiotic recombination in male mice. PLoS Genet. 8, e1002996(2012).
- Gomez, R., et al. Sororin loads to the synaptonemal complex central region independently of meiotic cohesin complexes. EMBO Rep. 17, 695-707 (2016).
- Brooker, A. S., Berkowitz, K. M. The roles of cohesins in mitosis, meiosis, and human health and disease. Methods Mol Biol. 1170, 229-266 (2014).
- McNicoll, F., Stevense, M., Jessberger, R. Cohesin in gametogenesis. Curr Top Dev Biol. 102, 1-34 (2013).
- Rankin, S. Complex elaboration: making sense of meiotic cohesin dynamics. FEBS J. 282, 2426-2443 (2015).
- Holloway, J. K., Sun, X., Yokoo, R., Villeneuve, A. M., Cohen, P. E. Mammalian CNTD1 is critical for meiotic crossover maturation and deselection of excess precrossover sites. J Cell Biol. 205, 633-641 (2014).
- La Salle, S., Sun, F., Handel, M. A. Isolation and short-term culture of mouse spermatocytes for analysis of meiosis. Methods Mol Biol. 558, 279-297 (2009).
- Wiltshire, T., Park, C., Caldwell, K. A., Handel, M. A. Induced premature G2/M-phase transition in pachytene spermatocytes includes events unique to meiosis. Dev Biol. 169, 557-567 (1995).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
