Упорядочение одноклеточного TCR изоляции и поколения ретровиральных векторов для In Vitro и In Vivo выражение человека TCRs

Краткое содержание

Текущий протокол сочетает в себе одну ячейку в паре человека TCR альфа и бета-цепи последовательности с рационализированы поколения ретровиральных векторов совместим с in vitro и in vivo выражения TCR.

Аннотация

Хотя, было разработано несколько методов для секвенирования парных Т-клеток рецепторов (TCR) альфа и бета-цепи от одного Т-клеток, никто до настоящего времени были способствуют вниз по течению в vivo функционального анализа гетеродимерами TCR. Мы разработали более протокол, основанный на двухэтапный мультиплекс вложенные PCR, что приводит к продукт PCR, который охватывает весь переменной регионах человека TCR альфа и бета-цепи. Выявляя места уникальные ограничения и включения их в праймеры PCR, мы сделали продукт PCR совместимы с прямым югу клонирования в шаблон антиретровирусные вектор. Результате антиретровирусного лечения конструкции кодирует химерных человека/мышь TCR с мыши Внутриклеточный домен, который функциональных клеток мыши или в в естественных условиях моделей мышей. В целом протокол, описанные здесь сочетает клеток человека одной паре TCR альфа и бета-цепи идентификации с обтекаемый поколения ретровиральных векторов, легко могут быть приспособлены для выражения TCR in vitro и in vivo . Видео и сопроводительные материалы призваны дать весьма подробное описание Одноячеистый PCR, таким образом, чтобы критические шаги можно избежать последовали и потенциальные ловушки. Кроме того мы предоставляем подробное описание клонирования шаги, необходимые для создания вектора выражения. Как только освоил, вся процедура от одной ячейки к TCR выражение сортировки может быть выполнена в течение короткого периода продолжительностью две недели.

Введение

Т-клеточных рецепторов (TCR) диктует решение судьбы Т-клеток во время разработки, установившемся/гомеостаза и антигенной стимуляции в периферии^1,2,3. Недавнее расширение глубоких технологий виртуализации обнаружила ранее underappreciated TCR разнообразия в антиген Т-клеток конкретных ответов. TCR разнообразия предполагает потенциал для функционально широкий Т-клеток ответов. Для того, чтобы интегрировать анализ репертуар последовательности TCR с TCR функциональных анализов, последовательности подходов должны быть призваны быть совместимы с экспериментальных систем и в естественных условиях модели используются для последующего функционального анализа выберите TCRs. Мы разработали эффективный подход для человека TCR последовательности изоляцию и рационализированы югу клонирования в совместимы с TCR выражение HLA-очеловеченное мышей⁴вектор TCR шаблон химерных человека и мыши. Изоляции соответствующего альфа и бета-цепи гетеродимерная TCRs требует амплификации PCR обеих цепей из одной клетки. Хотя, несколько одноклеточных TCR клонирования протоколы были разработаны и использованы, никто до настоящего времени были легко совместим с высокой пропускной способностью обтекаемый прямого клонирования неизвестных Vα/Vβ TCRs в ретровиральных векторов необходимых для повторного выражения в естественных условиях ^4,5,6,7. Предыдущие исследования использовали два основных подхода, либо выборочно дополнить ограниченную часть TCR, достаточных для экстраполяции последовательность, или усилить весь TCR последовательности^{4,5,6 , 7}. ниже по течению функционального анализа последовательностей TCR, полученные через первый подход требует дорогостоящих в silico Ассамблеи и de novo строительство TCR. В то время как второй подход обеспечивает полную последовательность TCR, регионе человека постоянно не совместим с в vivo выражение клонированного TCRs в моделях мыши. Наш подход разработан специально для совместимости с в vivo функционального анализа TCRs в моделях мыши. Мы разработали эффективный и рациональный Одноячеистый PCR протокол, который позволяет для прямого югу клонирования PCR фрагментов в векторные выражения шаблона.

Наш подход использует весьма чувствительной реакции PCR мультиплекс вложенных, которая выполняется в два этапа. В первый мультиплекс реакции шаг бассейн 40 праймеров для всех V-бета-цепи и бассейн 44 праймеров для все, что V-альфа-цепи используются для усиления TCR альфа или бета-TCR без предварительного знания о последовательности (Таблица 1). Форвард грунт имеет адаптер последовательность, которая включена в 5' продукта PCR. Обратный грунт на основе постоянной региона TCR. Мы определили места уникальные ограничения, которые отсутствуют от человека переменной или перекрестка TCR регионов и включили их в обновленным TCRα и TCRβ грунты (рис. 1). В втором вложенных реакции грунт, определенных для адаптера последовательности и вложенного обратного грунт в регионе постоянно используются для дальнейшего усиления TCR цепи с повышенной точностью (Таблица 1, рис. 1). После изоляции одной ячейки, два раунда ПЦР (первая реакция с бассейном праймеров Vα и Vβ и второй с праймерами адаптер) результат ПЦР продукта, который может быть непосредственно югу клонирован в шаблон антиретровирусные вектор. Окончательный TCR конструкция будет кодировать в одном открытом чтения рамке (ORF), человека переменной регионах, в сочетании с постоянной регионов мыши соединены «самостоятельно расщепления» последовательности белка, P2A (hVα-mCα-P2A-hVβ-mCβ)⁸. P2A последовательность была использована в нескольких системах и были тщательно протестированы специально для выражения TCRs^8,9,10,11. Хотя, после перевода, придает большую часть останков P2A последовательности C-конечная альфа-цепи соединены гибкими компоновщик, в то время как последовательность сигнала цепи бета-версия имеет дополнительные пролина, эта модификация не пагубно влияет на функции TCR. Регионе постоянный мыши используется в конструкции вместо человека во избежание потенциальных изменены взаимодействий с сигнальных компонентов нисходящего потока при вновь выразил в клетки мыши. Один ORF приведет к стехиометрическим отдельные выражения альфа и бета-цепи^9,11. Текущий протокол основан на реагенты и подходы, которые широко доступны и призвана осуществляться на рациональной и эффективной основе. Хотя специально для анализа TCRs от самореактивных Т-клеток, причастны аутоиммунный диабет мы использовали этот метод, мы ожидаем, что этот протокол может быть широко применяется для идентификации и функциональной оценки человеческого TCRs для аутоиммунная epitopes, рака эпитопов или ответы на патогенные микроорганизмы и вакцин.

Протокол

1. определять популяции клеток T интерес.

Примечание: антигена конкретных распространения в сочетании с красителем деление клеток (например, Карбоксифлуоресцеина succinimidyl эфира, CFSE) могут использоваться для изоляции Т-клеток, основанный на их распространение в ответ на антигенной стимуляции. Если начиная с получения, 7-дневный в vitro расширение должно быть достаточно для выявления конкретных малочисленностью населения CFSE антигена ¹².

1. Получения смеси с MHC-согласованной фидер клетки и этикетка с 5 мкм CFSE деление клеток красителя 1:1.
2. Плита 2-2,5 x 10 ⁵ клеток на хорошо в 96-луночных раунд дно культура пластины в 200 мкл 10% FCS полный RPMI СМИ.
   Примечание: Полный RPMI содержит 2 мм l глютамином, пируват натрия 1 мм, 100 мкм MEM заменимые аминокислоты, 5 мм HEPES, 5,5 × 10 ^{− 5} единиц 2-меркаптоэтанол, 100 мл U ^{− 1} пенициллин и 100 мкг мл ^{− 1} стрептомицин.
3. Стимулировать клетки с 25 мкм пептид антигена.
4. На четвертый день культуры, тщательно удалить и заменить 100 мкл СМИ.
   Примечание: Более оптимальный подход для идентификации антиген специфические клетки T является использование пептида HLA тетрамера ¹³. Тетрамер окрашивание позволяет одновременной оценки антигена специфику, а также HLA-ограничение.

2. Настроить одну ячейку Сортировка.

1. Выполнять все процедуры в капот или указанного района бесплатно усиливается шаблона. Аликвота реагентов, чтобы избежать загрязнения, очистить все рабочие поверхности и, если это возможно, оборудование с 10% отбеливателем до установки ПЦР. Использовать фильтр советы, RNAse и DNAse бесплатно реагентов и пластмасс во всех ПЦР и вектор клонирования шаги. Основные реагенты можно найти в Таблице материалов.
   Примечание: Мультиплексной ПЦР реакция очень чувствительна, и низкий уровень загрязнения может привести к усиливается продукт.
2. Формирования обратной транскрипции Мастер микс, объединяя 10 x реакции RT буфера, 25 X дНТФ, 9 U RT фермента, 0,01% Тритон-X, 0.7 АБС битор РНКазы U и 383 Нм каждого RT-TCR праймера (перечислены в таблице 1), в стерильной дозирования водохранилище. Для каждой пластины 96-луночных составляют достаточно мастер смесь для 10 дополнительных реакций (всего 106), чтобы компенсировать потерю жидкости во время закупорить. Приведены в таблице 2 для реакции компонентов и суммы по хорошо.
3. Подготовка семейство PCR 96-луночных пластина для ячеек, сортировка по дозирования 6 мкл обратной транскрипции мастер смеси в скважины с многоканальные пипетки. Держите пластины на льду или в блоке холодной.
4. Ярлык клетки с антителами к ячейке поверхностных маркеров (например, CD4 и CD3, или CD8 и CD3, каждая на 2 мкг/мл, в сочетании с деление клеток красителя или Тетрамер окрашивание).
5. Сортировка Т-клеток в одной ячейки в колодец, пропуская двенадцатой строке, которая будет служить в качестве отрицательного контроля.
   Примечание: Эффективность такого рода будет зависеть от точной коллекции пластины выравнивание пластина держателя, а также сохранение клеток и пластин при низкой температуре до cDNA реакции. Коллекции пластины должны храниться на льду во все времена, за исключением во время сортировки, когда они устанавливаются в пределах охлаждения пластины. Не все сортировщики оснащены Температура регулируемой пластины держателя; Однако настоятельно рекомендуется использовать один. После сортировки, как правило, занимает около 10-15 мин на пластину, есть увеличение потенциала для РНК деградации, если плита не поддерживается при низкой температуре.
6. Как позитивный элемент, добавить большее количество клеток (100 клеток) вручную с пипеткой в одной из скважин на данном этапе. Кроме того, ранее изолированные РНК из пула клеток может использоваться как положительный контроль 10 нг на колодец.
   Примечание: Пипетка очищенный управления РНК с точностью и ухода во избежание перекрестного заражения других скважин и ложных положительных результатов.
7. Уплотнение пластины с липкой пленкой и спина вниз на 1000 x g 5 мин на 4 ° C.
8. Немедленно транскрибировать РНК в cDNA, инкубации пластину на 25 ° C в течение 10 мин, 37 ° C за 45 мин и 85 ° C в течение 10 мин
   Примечание: Для обеспечения эффективной реакции PCR, рекомендуется, что первая реакция PCR выполняться в тот же день. Кроме того, транскрибируется пластины может храниться в-80 ° C до 2 месяцев.

3. Выполняют мультиплекс вложенные ПЦР

Примечание: Подготовьте все мастер смеси в чистый шаблон свободно OBLASTь, чтобы избежать загрязнения.

1. Воссоздать каждой переменной региона грунт до 100 мкм с DNAse и РНКазы бесплатно H ₂ O. Затем объединить 20 мкл каждого из 44 Праймеры для создания пула грунтовка V-альфа. Для создания V-бета-грунтовка бассейн объединить 20 мкл каждого из 40 V-бета праймеры плюс 80 мкл DNAse и РНКазы бесплатно H ₂ O. Primer последовательности, перечислены в таблице 1. После объединения, концентрация каждого праймера в смеси составляет 2.3 мкм.
2. Восстановить грунты постоянном регионе до 100 мкм Стоковый раствор с DNAse и РНКазы свободной H ₂ O. развести грунты постоянном регионе 10 мкм рабочего раствора и Алиготе для использования.
3. Подготовить два отдельных мастер смеси для TCR-альфа- и бета-TCR амплификации. Генерировать основной смеси путем объединения 5 X буфер, 80 мкм дНТФ, 3% ДМСО, 2 мкм грунтовка бассейн (конечная концентрация 46 Нм для каждого праймера), 200 Нм TCR-постоянн региона обратный грунтовка, 1 U ДНК-полимеразы и DNAse и РНКазы бесплатно H ₂ O (Таблица 2 < / сильные >). Для каждой пластины 96-луночных, составляют достаточно мастер смесь для 10 дополнительных реакций (всего 106), для того, чтобы компенсировать потерю жидкости во время закупорить.
   Примечание: Расчеты основаны на окончательный объем ПЦР 25 мкл в колодец, где 22,5 мкл мастер смесь ПЦР сочетается с 2,5 шаблон cDNA мкл.
4. Держите пластины с cDNA на льду или в блоке холодной. Используйте многоканальный для Пипетка 22,5 мкл TCR-бета-реакции в новую плиту 96-луночных ПЦР. Затем используйте многоканальный для передачи 2,5 мкл cDNA в пластину ПЦР.
5. Использовать многоканальный для Пипетка 22,5 мкл TCR альфа реакции непосредственно в пластину, содержащий оставшуюся часть cDNA.
6. Печать пластины с клей, нежно вихря и спин вниз на 1000 x g 5 мин на 4 ° C.
7. Запуск мультиплексной ПЦР реакции с следующие циклы: 5 мин при 95 ° C, после чего 34 циклов 20 s при 95 ° C, 30 s на 54 ° C и 1 мин при 72 ° C, а затем 7 мин в 72 ° C.
8. Носить из вложенных реакции PCR в окончательный объем 25 мкл, используя 2.5 мкл мультиплексной ПЦР смеси в качестве шаблона.
   1. Восстановить внутренние и адаптер грунтовки до 100 мкм с DNAse и РНКазы бесплатно H ₂ O. сделать 10 мкм аликвоты для рабочих акций.
   2. Подготовить два отдельных мастер смеси для TCR-альфа- и бета-TCR амплification. Mix 5 X буфер, 25 X DNTP, 3% ДМСО, 200 Нм вперед адаптер грунт, 200 Нм обратный вложенных грунт, 1 U ДНК-полимеразы и ДНК-полимеразы и свободной от нуклеиназы H ₂ O для окончательного объема 22,5 мкл (Таблица 2). Для каждой пластины 96-луночных, составляют достаточно мастер смесь для 10 дополнительных реакций (всего 106), чтобы компенсировать потерю жидкости во время закупорить.
      Примечание: В второй использования реакции PCR 5 X PCR буфера содержащий краситель загрузки для облегчения загрузки геля агарозы.
   3. С помощью многоканальный, Пипетка мастер смеси для TCR альфа- и бета-TCR реакции в 22,5 мкл в колодец в два новых 96-луночных ПЦР планшетов.
   4. В 2,5 мкл за хорошо добавить мультиплексной ПЦР реакции шаблона.
      Примечание: Оставшиеся первой реакции PCR должны быть опечатаны и температуре 20 ° C до служить источником дополнительных шаблонов, если это станет необходимым (см. Шаг 4.3 Примечание).
   5. Уплотнение пластины, вихревой мягко и спин вниз на 1000 x g 5 мин на 4 ° C.
   6. Запускать вложенные реакции PCR с следующие циклы: 5 мин при 95 ° C, после чего 34 циклов 20 s при 95 ° C, 30 s на 56 ° C и 1 мин при 72 ° C, а затем 7 мин на 72 ° C.
   7. Запуск 5 мкл окончательной реакции вне на агарозы 1% гель содержащий бромид ethidium (включая отрицательный и положительный контроль скважины).
      Примечание: Ожидается группы должны работать на около 500 bp размер. Реакция пример показан на рисунке 2.
   8. Очистить оставшуюся часть вторая реакция (20 мкл) с использованием формата 96-луночных комплект очистки ПЦР, элюировать с 15 мкл 70 ° C H ₂ O на колодец и выполнять Сэнгер последовательности. Используйте соответствующие TCR альфа или бета-TCR адаптер вперед грунтовка для виртуализации (Таблица 1).
      Примечание: Последовательности могут быть проанализированы с программным обеспечением онлайн доступны иммуногенетики.

4. Югу клонирование альфа и бета-цепи ПЦР.

Примечание: бассейн вперед грунты, используются в первой реакции, и обратный грунтовки в второй реакции PCR используются для включения места ограничения. Таким образом, полученные альфа и бета-цепи ПЦР продукты готовы быть последовательно югу клонированных в шаблон антиретровирусные вектор ( рис. 1).

1. Дайджест очищенный ПЦР продукты из бета-версии вложенных реакции с BstbI и MfeI (Таблица 3).
   Примечание: Не превышайте 5 мкг Вставка.
2. Параллельно, дайджест вектора шаблона с BstbI и MfeI (Таблица 3). Используйте 1-2 мкг вектора шаблона в TCR. Запустите переваривается вектора на геле агарозы и изолировать более крупные группы (~ 7500 bp). Очищение вектора с гель комплект очистки ДНК.
   Примечание: Во время энзима ограничения обзору, мышиных TCR-бета-переменная область шаблона удаляется, позволяя для добавления человека TCR-бета переменной региона.
3. Очистить переваривается продукты PCR, используя комплект для очистки ПЦР.
   Примечание: Проверка возможности очистки ДНК столбцов, включенных в комплект; При необходимости используйте несколько столбцов. Минимальное количество очищенной вставки, необходимых для успешного лигирование реакции составляет 50 нг в минимальной концентрации 10 нг/мкл. Если сумма очищенный вставка не достаточно для успешного перевязки, второй реакции PCR может быть повторен.
4. Лечения вектора шаблона с 10 U CIP фермента за 1 ч при 37 ° C для предотвращения самолигирование, следуют тепловой инактивации 10 мин на 75 ° C. очистить ДНК с комплектом очистки ПЦР (Таблица 3).
5. Ligate TCR-бета вставки и вектор с помощью ДНК лигаза в общем объеме 20 мкл на 6 Молярная избыток вставки для 30 мин при комнатной температуре.
   Примечание: В общей сложности, реакции перешнуровки должен содержать около 150 нг ДНК (Таблица 3).
6. Для преобразований, Смешайте 8 мкл реакции перешнуровки с 80 мкл химически компетентных E.coli DH5α клеток (Таблица материалов) и инкубировать на льду на 30 мин теплового шока при 42 ° C для 45 s. добавить 500 мкл супер Оптимальное бульон с Catabolite подавления (S.O.C.) средний и встряхнуть для 1,5 ч при 37 ° с.
7. Пластина из 250 мкл бактериальной культуры на ампициллин, содержащих агар пластины Lysogeny бульон (LB). Инкубировать пластину на ночь (~ 16 h) при 37 ° с.
8. Следующий день выбрать бактериальных колоний и расти их в 3 мл LB носитель, содержащий ампициллина на ночь. Изолировать плазмида ДНК, используя комплект для очистки плазмида ДНК.
9. Подтверждают успешное включение бета-цепи небольших испытаний-дайджест с энзимами ограничения BstbI и MfeI. В 12 томе µL общая реакция объедините 200-500 мкг плазмидной ДНК, 0,25 мкл каждого фермента и 10 X буфер фермента (Таблица 3). Запуск реакции вне на геле агарозы 1%, содержащие бромид ethidium подтвердить размер вставки группы (~ 500 bp).
10. После подтверждения наличия insert, последовательность TCR-бета-раздел вектора использование IRES обратный грунтовка (Таблица 1).
11. После подтверждения последовательности TCR-бета-вставки, выполните аналогичный процесс для вставки альфа-переменной региона. Дайджест очищенных продуктов ПЦР из альфа-вложенные реакции и созданный Вставка TCR-бета, содержащий вектор, с SnaBI и SacII.
    Примечание: Во время энзима ограничения обзору, мышиных TCR альфа переменная область шаблона удаляется, позволяя для добавления человека переменной региона TCR альфа.
12. Ligate альфа вставляет в TCR векторов кодирования соответствующий бета переменной региона с помощью ДНК лигаза в общем объеме 20 мкл на 6 Молярная избыток вставки для 30 мин при комнатной температуре.
    Примечание: В общей сложности, реакции перешнуровки должен содержать около 150 нг ДНК (Таблица 3).
13. Для преобразований, Смешайте 8 мкл реакции перешнуровки с 80 мкл химически компетентных E.coli DH5α клеток (Таблица материалов) и инкубировать на льду на 30 мин теплового шока при 42 ° C для 45 s. добавить 500 мкл S.O.C. Средний и встряхнуть для 1,5 ч при 37 ° с.
14. Пластина из 250 мкл бактериальной культуры на ампициллин, содержащих агар пластины Lysogeny бульон (LB). Инкубировать пластину на ночь (~ 16 h) при 37 ° с.
15. Следующий день выбрать бактериальных колоний и расти их в 3 мл LB носитель, содержащий ампициллина на ночь. Изолировать плазмида ДНК, используя комплект для очистки плазмида ДНК.
16. Для подтверждения успешного включения альфа-цепи небольших испытаний дайджест с энзимами ограничения SnaBI и SacII. В 12 томе µL общая реакция объедините 200-500 мкг плазмидной ДНК, 0,25 мкл каждого фермента и 10 x буфер фермента (Таблица 3). Запуск реакции вне на геле агарозы 1%, содержащие бромид ethidium подтвердить размер вставки группы (~ 500 bp).
17. После подтверждения наличия insert, последовательность TCR альфа раздел вектора с использованием MSCV2-вперед грунт (Таблица 1).
18. После проверки последовательности альфа-цепи, проверьте полный TCR вставки путем sequencing грунтом TCR-бета реверс и IRES-реверс (Таблица 1).

5. Проверка поверхности выражения TCR клеток и специфичность.

Примечание: HEK293T клетки используются для проверки успешного TCR цепи паринг и клеток поверхности выражение ( Рисунок 3А) ⁸. Пептид-MHC Тетрамер окрашивания могут также выполняться на transfected клеток HEK293T для тестирования для удержания антигенной специфичности пост TCR гена изоляции ( рис. 3B).

1. Пластина, HEK293T клетки культуры ткани 12-ну плит на 1 х 10 ⁵ ячеек на скважину в 1 мл полный DMEM СМИ содержащих 5% FCS, и культура ночь в 37 ° C. пластины из достаточно клетки были назначены отдельные колодцы для каждого нового TCR , элемент управления шаблона TCR вектор, CD3 вектора только, контролировать TCR вектора только и не transfected хорошо.
   Примечание: Transfection с полностью мыши шаблон TCR вектор (РКРТ pMIA) в сочетании с mCD3εγδζ-pMIG вектор, РКРТ pMIA вектор в одиночку, и mCD3εγδζ-pMIG вектора только используются в качестве положительной и отрицательной контроля.
   Примечание: Полный DMEM содержит 2 мм L-глютамином, 1 мм пируват натрия, 100 мкм Non-essential аминокислоты, 5 мм HEPES буфера, 5.5 x 10 ^-5 единиц 2-меркаптоэтанол, 100 ед/мл пенициллина/стрептомицина.
2. Следующий день, transfect клетки с 1 мкг химерных вектор h/РКРТ pMIA, 1 мкг мыши CD3εγδζ-pMSCVII-GFP (pMIG) вектор и реагент на основе липосом трансфекции, следуя инструкциям производителя.
3. Для каждого TCR, добавить 6 мкл Реагента трансфекции комнатной температуре 100 мкл, DMEM сыворотки бесплатно. Кратко вихрь и инкубации при комнатной температуре 15 мин
4. В отдельных 1,5 мл трубки объединить 1 мкг TCR-pMIA вектора с 1 мкг мыши CD3εγδζ-pMSCVII-GFP (pMIG) вектор, или 1 мкг каждого вектора отдельных элементов управления.
5. Dropwise, добавить решение реагент/DMEM трансфекции в пробирки, содержащие дна вектора. Инкубации при комнатной температуре 15 мин
6. Dropwise, добавить решение реагент/DMEM/ДНК transfection клетки HEK293T. Аккуратно нажмите пластину для смешивания. Инкубируйте на 37 ° C в течение 24 ч.
7. После 24 h заменить СМИ и сохранить клетки в культуре для дополнительных 24 h.
8. Удалить клетки от плиты, энергичные закупорить и пятно клетки с анти мыши антитела CD3 (2,5 мкг/мл) для проверки поверхности выражение химерных TCR подачей cytometry.
9. Для того чтобы сравнить CD3 выражение между ячейками, которые были transfected на аналогичный уровень строба анализ на клетки, выражая аналогичные высокий уровень флуоресцентные репортер молекул (GFP для CD3 комплекса и Аметрин для вектора выражения TCR). Оптимально, анализ должен быть закрытого GFP + Аметрин + клеток в течение 10 ⁴ – 10 ⁵ интенсивности флуоресценции ( рис. 3A).
   Примечание: Уровень CD3 выражения в клетках transfected с химерных конструкции должны быть сопоставимыми с управления мышью (исходный шаблон) вектор ( рис. 3A). Сгенерированный TCR ретровиральных векторов совместимы с системами в vivo выражение как описано ⁴.

Результаты

Эффективность реакции PCR мультиплекс вложенные проверяется на шаге 3.2.7 (рис. 2), запустив из 5мкл второй реакции на геле агарозы. В среднем эффективность усиления TCR-бета, как ожидается, составит около 80%, в то время как эффективность реакции TCR альфа обычно ниже, около 50%⁴. Только парные TCR-альфа и TCR-бета-цепи могут быть использованы для выражения TCR; Однако все продукты PCR может виртуализации для получения последовательно...

Обсуждение

В текущем протоколе мы описываем эффективный метод для одной ячейки TCR амплификации и последующей югу клонирования парных TCR альфа и бета-цепи в шаблон антиретровирусные выражение вектор. Хотя, были разработаны несколько Одноячеистый PCR протоколы, никто до настоящего времени были совместимы с немедленной югу клонирования в выражении vector. В большинстве случаев частичная последовательность охватывающих высоко вариабельные CDR3 регионах усиливается, с достаточно последовательности экстраполировать переменной региона. ...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
CFSE	eBioscience	5	мМ
античеловеческий CD4 (OKT4) BV421	Biolegend	317433	2 мг/мл
античеловеческого CD3 (OKT3) PerCP/Cy5.5	Biolegend	317336	2 мг/мл
антимышиный CD3 AF647	Biolegend	100322	2,5 мг/мл
Ингибитор рекомбинантной РНКазы биотехнологический grd 2,5KU	VWR	97068-158	0,7 U
Прикладные биосистемы Высокоэффективный набор кДНК RT	Инвиртоген	4368814	9 Ед (фермент RT)
NF-H2O: вода без нуклеазы 1000 мл	Invirtogen	AM9932
Gotaq ДНК-полимераза 2500U	VWR	PAM3008	1 U
96 Луночная полуюбка ПЦР-планшет	Phenix	MPX-96M2
MicroAmp Прозрачная адгезивная пленка	ТермоФишер
Ультрачистая агароза	Инвиртоген	15510-027
SnaBI	Биолаборатории Новой Англии	R0130	15 U (вставка) 30 U (вектор)
SacII	New England Biolabs	R0157	40 U (вставка) 80 U (вектор)
MfeI	New England Biolabs	R3589S	40 U (вставка) 80 U (вектор)
BstBI	New England Biolabs	R0519	40 U (вкладыш) 80 U (вектор)
Кишечная фосфатаза теленка (CIP)	Биолаборатории Новой Англии	M0290S	10 U
Quick ligase	Биолаборатории Новой Англии	M2200S
Wizard Plus minipreps системы очистки ДНК	Promega	A1460
Wizard Plus системы очистки ДНК midipreps	Promega	A7640
Набор для очистки и концентратора ДНК-25	Genesee Scientific	11-304C
ZR-96 Набор для очистки и концентратора ДНК-5	Genesee Scientific	11-306A
Набор для экстракции геля QIAquick	Qiagen	28704
Набор для очистки ПЦР	QIAGEN	28104
Эффективность субклонирования DH5a Компетентные клетки	ТермоФишер
Реагент Transit LT-1 1 мл (реагент для трансфекции)	Mirus
BD FACS Aria II (сортировщик)	BD
BD Fortessa (проточный цитометр)	BD