Простой, но эффективный метод, который использует магнитные наночастицы для обнаружения и обогащения антиген-реактивных В-клеток для функционального и фенотипического анализа описан.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Обнаружение и обогащение редких антиген-специфических B Клетки для анализа фенотипа и функции
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
B клетки, реагирующие со специфическим антигеном, обычно встречаются с частотой <0,05% лимфоцитов. На протяжении десятилетий исследователи искали методы выделения и обогащения этих редких клеток для изучения их фенотипа и биологии. Эти подходы неизбежно основаны на принципе, согласно которому В-клетки распознают нативный антиген с помощью рецепторов клеточной поверхности, которые являются репрезентативными по специфичности антител, которые в конечном итоге будут секретироваться их дифференцированными дочерними антителами. Возможно, наиболее очевидный подход к проблеме включает использование фторхром-конъюгированных антигенов в сочетании с флуоресцентно-активируемой сортировкой клеток (FACS). Однако полезность этих методов ограничена частотой ячеек и достижимой скоростью анализа и изоляции с помощью электронной сортировки. Описан новый метод обогащения редких антиген-специфичных В-клеток с использованием магнитных наночастиц, который приводит к высокопродуктивному обогащению антиген-реактивных В-клеток из больших исходных клеточных популяций. Этот метод позволяет улучшить мониторинг фенотипа и биологии антигенреактивных клеток до и после встречи с антигенами in vivo, например, после иммунизации или во время развития аутоиммунных заболеваний.
Введение
Лимитирующего разведения анализ частоты предшественника клеток секретирующих антитела показали, что В-клетки, реакционноспособные в отношении конкретного антигена, обычно возникают на частоте от 0,05 до 0,005% в обычном репертуаром, в зависимости от статуса вакцинации и размер / количество эпитопов, присутствующих на антиген. Низкая частота этих клеток затрудняет для изучения изменений в их статусе в процессе развития иммунных реакций, таких как после вакцинации или воздействие чужеродного антигена, или во время развития аутоиммунитета. Ранее исследователи провели изоляцию антиген-реактивных В - клеток с использованием методик , начиная с антигенным покрытием пластин....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Выделение человека МНПК
- Собрать 30-50 мл крови с использованием гепаринизированной трубки забора крови.
Примечание: Количество крови используется, зависит от конкретного экспериментального вопроса и частоты в крови антиген-специфических В-клеток, представляющих интерес. Гепаринизированной крови может быть обработан немедленно или качали осторожно в течение ночи при комнатной температуре в течение обработки на следующий день. Задержка в обработке очень мало влияет на эффективность обогащения и связана с минимальной потерей жизнеспособности. - Смешайте цельной крови 1: 1 со стерильным, при комнатной температуре магния и кальция свободной фо....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Анализ чистоты, выход, и сложите обогащения с помощью проточной цитометрии
Популяции, обогащенные, как описано выше, неизбежно содержат загрязняющие клетки, которые не связаны стрептавидином далеко красно-флуоресцентный краситель, но попавшие в матрице. Эти примеси могут быть удалены из обогащенных населения путем FACS-сортировкой. Для оценки чистоты обогащенных популяций, ворота на живых клетках на основе прямого и бокового расс.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Здесь мы опишем метод для достижения выделения и обогащения антигенсвязывающих В-клеток из периферической крови человека. Метод легко применимы к мышам и в других тканях, таких как селезенка и лимфатические узлы, а также совместим с пост-обогатительной анализа клеточного фенотипа и функции (рукопись в процессе подготовки).
Пользователь должен быть осведомлен о ряде переменных, которые могут повлиять на успех этой процедуры. Из опыта мертвые клетки имеют тенденцию придерживаться магнитных шар.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Благодарности
Эта работа была поддержана грантами от JDRF (1-2008-994, 27-2012-450) и Национальных институтов здравоохранения (R01DK096492-05, R21AI124488-01, T32OD012201 и F30OD021477).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Антиген представляющий интерес | вариабельный | вариабельный | Не менее 100 г легко биотинилируется; При использовании белка старайтесь использовать белок, который был валидирован методом ИФА. Он должен быть носителем Без белка. |
| Биотин для маркировки; e. EZ link Sulfo-NHS-LC-Biotin | Thermo Scientific | 21335 | Биотин выпускается в различных составах, таких как содержащие различную длину спейсеров, поэтому тип используемого должен быть определен исследователем |
| Streptavidin-Alexa Fluor 647 | Invitrogen | S21374 | Может получить у других поставщиков. |
| Anti-Cy5/Anti-Alexa Fluor 647 Микрогранулы | Miltenyi Biotech | 130-091-395 | |
| LS | Колонки Miltenyi Biotech | 130-042-401 | |
| Ручные сепараторы MACS | Miltenyi Biotech | Вариативный | |
| формальдегид | Разбавленный до 2% PBS; необязательно, если для последующего анализа требуются живые клетки | ||
| PBS без кальция и магния | |||
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
| Цельная кровь в гепаринизированных пробирках | |||
| для сбора FACS буфер (PBS + 1% BSA + 0,01% азид натрия) | |||
| Разделительный буфер (PBS + 0,5% BSA + 2 мМ ЭДТА) | |||
| 50 мл конические пробирки | |||
| 15 мл конические пробирки | |||
| 1,5 мл пробирки Eppendorf Поверхностный | |||
| маркер реактивные антитела, Fc Block, различительное окрашивание живых/мертвых, при необходимости | |||
| расходные материалы ELISPOT, при необходимости |
Ссылки
- de Wildt, R. M., et al. A new method for the analysis and production of monoclonal antibody fragments originating from single human B cells. J Immunol Methods. 207 (1), 61-67 (1997).
- Edelman, G. M., Rutishauser, U., Millette, C. F.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Больше статей
Обогащение магнитными наночастицамисортировка клеток с помощью флуоресцентно-активированного клеточного сортерамононуклеарные клетки периферической кровисвязывание биотинилированного антигенаантителоконъюгированное со стрептавидиномблокирование Fc$\gamma$-рецепторовцентрифугирование в градиенте плотностисепарация на магнитной колонкеантиген анатоксина столбняка
