Методическая статья

Обнаружение и обогащение редких антиген-специфических B Клетки для анализа фенотипа и функции

11.8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/55382

⸱

16 февраля 2017 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Immunology and Microbiology, University of Colorado School of Medicine, 2Department of Microbiology, Immunology, and Pathology, Colorado State University, 3Barbara Davis Center for Childhood Diabetes, University of Colorado School of Medicine, 4Department of Biomedical Research, National Jewish Health

В этой статье

Краткое содержание

Простой, но эффективный метод, который использует магнитные наночастицы для обнаружения и обогащения антиген-реактивных В-клеток для функционального и фенотипического анализа описан.

Аннотация

B клетки, реагирующие со специфическим антигеном, обычно встречаются с частотой <0,05% лимфоцитов. На протяжении десятилетий исследователи искали методы выделения и обогащения этих редких клеток для изучения их фенотипа и биологии. Эти подходы неизбежно основаны на принципе, согласно которому В-клетки распознают нативный антиген с помощью рецепторов клеточной поверхности, которые являются репрезентативными по специфичности антител, которые в конечном итоге будут секретироваться их дифференцированными дочерними антителами. Возможно, наиболее очевидный подход к проблеме включает использование фторхром-конъюгированных антигенов в сочетании с флуоресцентно-активируемой сортировкой клеток (FACS). Однако полезность этих методов ограничена частотой ячеек и достижимой скоростью анализа и изоляции с помощью электронной сортировки. Описан новый метод обогащения редких антиген-специфичных В-клеток с использованием магнитных наночастиц, который приводит к высокопродуктивному обогащению антиген-реактивных В-клеток из больших исходных клеточных популяций. Этот метод позволяет улучшить мониторинг фенотипа и биологии антигенреактивных клеток до и после встречи с антигенами in vivo, например, после иммунизации или во время развития аутоиммунных заболеваний.

Введение

Лимитирующего разведения анализ частоты предшественника клеток секретирующих антитела показали, что В-клетки, реакционноспособные в отношении конкретного антигена, обычно возникают на частоте от 0,05 до 0,005% в обычном репертуаром, в зависимости от статуса вакцинации и размер / количество эпитопов, присутствующих на антиген. Низкая частота этих клеток затрудняет для изучения изменений в их статусе в процессе развития иммунных реакций, таких как после вакцинации или воздействие чужеродного антигена, или во время развития аутоиммунитета. Ранее исследователи провели изоляцию антиген-реактивных В - клеток с использованием методик , начиная с антигенным покрытием пластин или адсорбенты колонки, к покрытым антигеном клеток сбросу красной крови, флуоресценцией сортировка клеток 1, 2, 3, 4, 5, 6. Thougч эти методы были успешными в деле выявления и выделения антиген-реактивных В-клеток, результаты варьировались с точки зрения доходности, чистоты и масштабируемости. Недавно мы разработали новый метод, как обнаружить и обогащать редкие B субпопуляций лимфоцитов с использованием магнитных наночастиц. Метод позволяет обогащение с относительно высоким выходом и чистотой из крупных исходных популяций, и совместим с анализом ответов на антиген. Обогатив из популяций клеток в суспензии, метод устраняет ограничения, связанные с геометрией пластинок, покрытых антигеном или столбцов, а также ограничить пропускную способность. И наконец, так как обогащенные клетки остаются связанными с антигеном и флуоресцентным репортером, они могут быть дополнительно очищен с помощью FACS-сортировкой. Как описано в настоящем документе, мы использовали этот подход для исследования периферической крови столбнячный анатоксин-реактивным В-клеток до и после иммунизации человеческих субъектов, а также аутоантигенов-реактивный В-клетки пациентов с различными autoimmune расстройства, в том числе сахарный диабет 1 типа, базедова болезнь, и болезнь Хашимото 7. Метод одинаково хорошо работает в мыши и человека, а также совместим с анализом антиген-реактивных В-клеток из различных тканей (рукопись в процессе подготовки).

В своем базовом формате одноядерные клетки периферической крови инкубируют с биотинилированным антигеном вместе с антителами к антигенам клеточной поверхности, необходимые для фенотипического анализа. Этот этап маркировки с последующей промывкой и фиксации, а также добавлением стрептавидина , соединенный с дальним красным-флуоресцентный краситель для обнаружения биотинилированного-связывания антигена клеток (рисунок 1). Предыдущие исследования выявили антиген-специфических В - клеток аналогичным образом , но при использовании антигенов , непосредственно конъюгированное с флюорохромом 8, 9, 10, 11. Несмотря на то, что это достойноподход, использование биотинилированных антигенов в сочетании с стрептавидином дает большее усиление сигнала (следовательно , более четко разграничить связывания и необязательных клеток), в частности , когда антигены малы 12, 13, 14. Дополнительным фактором является использование стрептавидина вместо авидин, так как стрептавидин дегликозилирован, уменьшая неспецифическое связывание. Кроме того, мы используем далеко-красно-флуоресцентный краситель в качестве флуорохрома из-за его светостойкости, квантовый выход (яркость) и его небольшой размер (~ 1,3 кД). Белковые флуорохромы , такие как фикоэритрин (~ 250 кДа) и аллофикоцианин (~ 105 кДа) 15 не являются оптимальными , поскольку они потенциально содержат много антигенные эпитопы. Использование небольшого органического флуоресцентного красителя, состоящего из одного эпитопа, например, дальнего красного флуоресцентного красителя, уменьшает сложность населения изолированной клетки.

После того, как клетки биотинилированного-аntigen и далеко-красно-флуоресцентный краситель адсорбированная-стрептавидин, они обогащены с использованием анти-далеко-красно-флуоресцентный краситель-конъюгированные магнитные наночастицы. Одиночные наночастицы не обнаруживаются большинством цитометров и , следовательно , не должны быть удалены до очистки с помощью FACS сортировки и последующих анализов 16. Магнитный отбор антиген-специфичных В-клеток обогащает население интерес, устраняя затраты времени и средств сортировки редких событий с использованием проточного цитометра.

Ниже мы покажем, репрезентативные результаты от обогащения столбняк-анатоксина специфических В-клеток от субъекта до и через семь дней после столбняка повторной иммунизации. Мы выбрали это конкретное применение в качестве примера для того , чтобы продемонстрировать способность этого метода обогащать антиген-специфические В - клетки после острой стимуляции в естественных условиях. В сочетании с проточной цитометрии, этот метод способен обогащать и дифференцирующей антиген-специфической наивным, памяти, иplasmablast В-клетки и позволяет исследователю следить за изменениями в их частоте с течением времени. Кроме того, мы включаем другой возможный вниз по течению анализа, например, анализа ELISPOT, который демонстрирует , что клетки сохраняют способность секретировать антитела следующего обогащения. Другое применение этого метода может включать в себя адоптивную передачу обогащенных клеток в организм хозяина. Ранее мы показали, клетки сохраняют способность действовать в качестве антиген-представляющих клеток на антиген-специфических Т-клеток после выделения и передачи информации (данные не показаны). Следовательно, существует целый ряд возможных последующих анализов, которые могут быть связаны с методом, который вместе информирующее понимание антиген-специфического иммунного ответа. Мы описали метод ниже, включая элементы управления, чтобы определить общий выход, чистота, клеточную специфичность и откидные обогащения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Выделение человека МНПК

  1. Собрать 30-50 мл крови с использованием гепаринизированной трубки забора крови.
    Примечание: Количество крови используется, зависит от конкретного экспериментального вопроса и частоты в крови антиген-специфических В-клеток, представляющих интерес. Гепаринизированной крови может быть обработан немедленно или качали осторожно в течение ночи при комнатной температуре в течение обработки на следующий день. Задержка в обработке очень мало влияет на эффективность обогащения и связана с минимальной потерей жизнеспособности.
  2. Смешайте цельной крови 1: 1 со стерильным, при комнатной температуре магния и кальция свободной фосфатно-солевом буфере (PBS).
  3. В 50 мл стерильной коническую пробирку, добавляют 10 мл при комнатной температуре раствора в градиенте плотности. Хранить открываемые градиент плотности бутылки в темноте при температуре 4 ° С, но нагреться до комнатной температуры перед использованием.
  4. Если возможно установить пипеток пистолет к медленной установке и / или применять очень мало, но последовательное, триггер давление медленнослой 30-35 мл разведенной крови на верхней части градиента плотности, стараясь не смешивать два.
    Примечание: Размещение наконечника пипетки против края 50 мл коническую при добавлении разведенной крови поможет обеспечить постоянный стабильный поток.
  5. Центрифуга при 400 х г в течение 30 мин при температуре 20 ° С с тормозом выключен.
  6. Снимите верхний слой, который содержит плазму и тромбоциты, стараясь не нарушить слой мононуклеарных клеток ниже.
  7. С помощью стерильной пипетки, собирают слой мононуклеарных клеток (охристые пальто) и поместить в отдельную стерильную 50 мл коническую трубку.
  8. Добавить PBS к клеточной суспензии до объема 50 мл. Центрифуга при 400 х г в течение 10 мин при температуре 20 ° С с тормозом.
  9. Удалить супернатант и ресуспендируют осажденные клетки в 10 мл PBS. Граф клеток и определения жизнеспособности с помощью гемоцитометра или автоматического счетчика клеток.
  10. Ресуспендируют клетки в 10 7 клеток / мл и место на льду до готовности для дальнейшей обработки.

2. Окрашивание клеток

  1. Удалить 1-2 х 10 6 клеток для каждой компенсации флуоресценции / управления FMO необходимо, если это применимо. Центрифуга остаток клеток при 400 мкг в течение 10 мин при 4 ° C с тормозом.
  2. Ресуспендируют клеток в стерильном отфильтрованном, холодного буфера FACS (PBS + 1% бычьего сывороточного альбумина (БСА) + 0,01% азида натрия) при 3-6 х 10 7 клеток / мл (удалить в 1,5 мл центрифужную пробирку). Убедитесь в том, что буфер FACS холодно и держать его на льду в течение всей процедуры окрашивания.
    1. Разделите популяцию клеток в четвертями (AD) при оптимизации анализа. Используйте фракцию А для обогащения антиген-специфических В-клеток, представляющих интерес, используют части В и С для определения специфичности обогащения / окрашивания (см 2.5 и 2.6 ниже), а также использовать фракцию D, чтобы определить частоту и количество антиген-специфических клеток в необогащенной населения для того, чтобы рассчитать доходность и откидные обогащения.
  3. Добавить человека FcγR блокировки повторноагент фракции AD на льду для предотвращения связывания антител с рецепторами Fc.
    Примечание: Следуйте инструкциям производителя для соответствующих условий.
  4. Добавить Флуорохром-конъюгированные антитела к клеточной поверхности антигены, представляющие интерес для фракций АД в течение 30 минут на льду в темноте, стараясь не включать флуорохромии, которые могут перекрестно реагировать с анти-далеко-красно-флуоресцентных антител красителя в сочетании с магнитными наночастицами.
    Примечание: К ним относятся конъюгатов антитело к ближней ИК флуоресцентного красителя, Cy5, Cy5.5 и Cy7. Любые жизнеспособность пятна, которые добавлены должны быть совместимы с использованием закрепителя. Если не намерен анализировать клетки с использованием FACS, но определить частоту секретирующих антитела, например, с помощью ELISPOT, поверхность окрашивание антителами ненужно.
  5. Чтобы проверить специфичность анализа, инкубировать фракция В с достаточным количеством немеченого антигена в течение 30 мин на льду, таким образом, что большинство рецепторов с аффинностью, по крайней мере,10 -6 М блокируются.
    Примечание: Как правило, хорошая начальная концентрация является 50-100 - кратный избыток количества антигена считается достаточной 2.6 ниже (например , 50-100 мкМ). Это должно блокировать любые В-клетки с высоким сродством к непомеченная антигена для связывания с биотинилированным антигеном, который добавляют на стадии 2.6 ниже, что позволяет подтвердить специфичность клеток, обогащенных. Этот шаг может быть завершена в сочетании с шагом 2.4 выше.
  6. Добавить биотинилированный антиген фракциях А, В и D. инкубировать на льду в течение 30 мин.
    Примечание: Концентрация биотинилированного антигена следует титровать, чтобы определить оптимальное количество, необходимое для обеспечения адекватного обнаружения и разделения связывания клеток с неспецифическими байстэндер клеток. Как правило, хорошая отправная концентрация для теста составляет 1-5 мкМ.
    Примечание: Для получения фракций А и D, этот шаг может быть сделано одновременно с шагом 2.4 выше. Для фракции B, этот шаг должен быть сделан после шага 2.5 (мытья в betwееп шаги не требуется).
  7. Опустить биотинилированный антиген из фракции С, чтобы определить любое связывание В-клеток в других реагентов в протоколе, например, стрептавидином дальнего красного флуоресцентного красителя и магнитных шариков.
  8. Промыть клетки дважды суспензии клеток в 1 мл холодного FACS буфера на 5 х 10 7 клеток и центрифугировали при 400 х г в течение 5 мин при 4 ° C.
  9. После окончательной промывки разбавленной концентрированной суспензии клеток в 1 мл 2% -ного формальдегида на 5 х 10 7 клеток , и пусть сидят в темноте на льду в течение 5 мин.
    Примечание: фиксирование клеток в этой точке, что обеспечивает биотинилированный антиген остается связанным с BCR для оставшихся процедуры. Для получения жизнеспособных клеток - для нисходящего анализа, например, в ELISPOTs или приемными передачи, пропустить шаг фиксации.
  10. Промыть клетки дважды 1 мл холодного FACS буфера на 5 х 10 7 клеток и центрифуге при 400 мкг в течение 5 мин при температуре 4 ° С. Ресуспендируют в 1 мл холодного FACS буфера на 5 х 107 клеток.
  11. Добавить 1-2 мкг стрептавидин-далеко-красно-флуоресцентный краситель / мл и инкубируют на льду в течение 20 мин в темноте. Титрование количества стрептавидина для каждого приложения.
  12. Промыть клетки дважды 1 мл холодного FACS буфера на 5 х 10 7 клеток и центрифуге при 400 мкг в течение 5 мин при 4 ° C. Подготовка фракции D завершается в данный момент, поскольку он не будет проходить обогащение с использованием магнитных шариков.
    Примечание: Этот образец будет использоваться для определения частоты и количества антиген-специфических В-клеток в образце. Это будет использоваться для определения выхода и сложите обогащением достигается за счет обогащения.

3. Магнитный Наночастицы на основе Обогащение

  1. Ресуспендируют клеток образцов AC в 1 мл холодного буфера разделения (PBS + 0,5% БСА + 2 мМ ЭДТА) на 5 х 10 7 клеток и проходят через фильтр 40 мкм , чтобы устранить любые комки , которые могут засорить колонну.
  2. Добавить Anti-далеко-красно-флуоресцентные наночастицы красителя Anti-Cy5 /. Foг оптимальных результатов, концентрация наночастиц должна подбираться для каждого использования, но является хорошей отправной точкой является 50 мкл суспензии на 5 × 10 7 клеток / мл. Поворот в темноте при 4 ° С в течение 10 мин.
  3. Промыть два раза с помощью 1 мл буфера холодного разделения при 400 х г в течение 5 мин при 4 ° C. Ресуспендируют клеток в 1 мл холодного буфера разделения на 5 х 10 7 клеток.

4. Магнитная Обогащение с помощью LS или LD столбцов

  1. Поместите три LS или LD столбцов в магнитном поле магнитного сепаратора и добавляют 3 мл буфера для разделения смачивать столбцы (см описание товара, чтобы определить, какой тип колонки лучше всего подходит). Разрешить все 3 мл пройти через колонку и выбросить после сбора.
    Примечание: Несмотря на то, разделение магнитных наночастиц меченых клеток может быть осуществлено с использованием любого одного из магнитных устройств разделения, которые являются коммерчески доступными, лаборатория была наиболее успешной с использованием колонок LS, в ТЕСКО доходности, чистоты и эффективности обогащения.
  2. Поместите три 15 мл конические пробирки меченые "Фракция А / (В) / (С) негативный", для отрицательно выбранных ячеек в столбце. Добавьте магнитная частица меченых клеток к их соответствующей колонке и позволяют весь объем, чтобы пройти.
  3. Добавьте 3 мл буфера холодного разделения на вершине, и это позволит пройти через колонку и повторить с 2 мл. Сбор отрицательно отобранных клеток и отложите на льду.
  4. Удалить столбец из магнитного поля и место на вершине 15 мл коническую пробирку с надписью "Фракцию А / (В) / (С) положительные", для положительно отобранных клеток.
  5. Заполните колонки в верхнюю приблизительно 6 мл буфера для разделения и немедленно погрузить этот объем через колонку, чтобы собрать клетки, которые, связанные с магнитным полем с помощью прилагаемого плунжера.
  6. Для повышения чистоты, позитивно отобранной клетки могут быть дополнительно обогащен с использованием второй чистый столбец, повторяя процеДюре.
  7. Спин оба отрицательно и положительно отобранных фракций при 400 х г в течение 10 мин при 4 ° С и подвесить в желаемом конечном объеме. Продолжайте вниз по течению анализа, такие как FACS, ELISPOT или приемному передачи.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Анализ чистоты, выход, и сложите обогащения с помощью проточной цитометрии

Популяции, обогащенные, как описано выше, неизбежно содержат загрязняющие клетки, которые не связаны стрептавидином далеко красно-флуоресцентный краситель, но попавшие в матрице. Эти примеси могут быть удалены из обогащенных населения путем FACS-сортировкой. Для оценки чистоты обогащенных популяций, ворота на живых клетках на основе прямого и бокового расс...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Здесь мы опишем метод для достижения выделения и обогащения антигенсвязывающих В-клеток из периферической крови человека. Метод легко применимы к мышам и в других тканях, таких как селезенка и лимфатические узлы, а также совместим с пост-обогатительной анализа клеточного фенотипа и функции (рукопись в процессе подготовки).

Пользователь должен быть осведомлен о ряде переменных, которые могут повлиять на успех этой процедуры. Из опыта мертвые клетки имеют тенденцию придерживаться магнитных шар...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантами от JDRF (1-2008-994, 27-2012-450) и Национальных институтов здравоохранения (R01DK096492-05, R21AI124488-01, T32OD012201 и F30OD021477).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Антиген представляющий интересвариабельныйвариабельныйНе менее 100 г легко биотинилируется; При использовании белка старайтесь использовать белок, который был валидирован методом ИФА. Он должен быть носителем  Без белка.
Биотин для маркировки; e. EZ link Sulfo-NHS-LC-BiotinThermo Scientific21335Биотин выпускается в различных составах, таких как содержащие   различную длину спейсеров, поэтому тип используемого должен быть определен исследователем
Streptavidin-Alexa Fluor 647InvitrogenS21374Может получить у других поставщиков.
Anti-Cy5/Anti-Alexa Fluor 647 МикрогранулыMiltenyi Biotech130-091-395
LSКолонки Miltenyi Biotech130-042-401
Ручные сепараторы MACSMiltenyi BiotechВариативный
формальдегидРазбавленный до 2% PBS; необязательно, если для последующего анализа требуются живые клетки
PBS без кальция и магния
Ficoll-Paque PLUSGE Healthcare17-1440-02
Цельная кровь в гепаринизированных пробирках
для сбора FACS буфер (PBS + 1% BSA + 0,01% азид натрия)
Разделительный буфер (PBS + 0,5% BSA + 2 мМ ЭДТА)
50 мл конические пробирки
15 мл конические пробирки
1,5 мл пробирки Eppendorf Поверхностный
маркер реактивные антитела, Fc Block, различительное окрашивание живых/мертвых, при необходимости
расходные материалы ELISPOT, при необходимости

Ссылки

  1. de Wildt, R. M., et al. A new method for the analysis and production of monoclonal antibody fragments originating from single human B cells. J Immunol Methods. 207 (1), 61-67 (1997).
  2. Edelman, G. M., Rutishauser, U., Millette, C. F. Cell fractionation and arrangement on fibers, beads, and surfaces. Proc Natl Acad Sci U S A. 68 (9), 2153-2157 (1971).
  3. Haas, W., Schrader, J. W., Szenberg, A. A new, simple method for the preparation of lymphocytes bearing specific receptors. Eur J Immunol. 4 (8), 565-570 (1974).
  4. Kenny, J. J., Merrill, J. E., Ashman, R. F. A two-step centrifugation procedure for the purification of sheep erythrocyte antigen-binding cells. J Immunol. 120 (4), 1233-1239 (1978).
  5. Snow, E. C., Vitetta, E. S., Uhr, J. W. Activation of antigen-enriched b cells. I. Purification and response to thymus-independent antigens. J Immunol. 130 (2), 607-613 (1983).
  6. Egeland, T., Hovdenes, A., Lea, T. Positive selection of antigen-specific B lymphocytes by means of immunomagnetic particles. Scand J Immunol. 27 (4), 439-444 (1988).
  7. Smith, M. J., et al. Loss of anergic B cells in prediabetic and new-onset type 1 diabetic patients. Diabetes. 64 (5), 1703-1712 (2015).
  8. Hulbert, C., Riseili, B., Rojas, M., Thomas, J. W. B cell specificity contributes to the outcome of diabetes in nonobese diabetic mice. J Immunol. 167 (10), 5535-5538 (2001).
  9. Woda, M., Mathew, A. Fluorescently labeled dengue viruses as probes to identify antigen-specific memory B cells by multiparametric flow cytometry. J Immunol Methods. 416, 167-177 (2015).
  10. Nair, N., et al. Optimized fluorescent labeling to identify memory B cells specific for Neisseria meningitidis serogroup B vaccine antigens ex vivo. Immun Inflamm Dis. 1 (1), 3-13 (2013).
  11. Amanna, I. J., Slifka, M. K. Quantitation of rare memory B cell populations by two independent and complementary approaches. Journal of immunological methods. 317 (1-2), 175-185 (2006).
  12. Scheid, J. F., et al. A method for identification of HIV gp140 binding memory B cells in human blood. Journal of immunological methods. 343 (2), 65-67 (2009).
  13. Doucett, V. P., et al. Enumeration and characterization of virus-specific B cells by multicolor flow cytometry. Journal of immunological methods. 303 (1-2), 40-52 (2005).
  14. Malkiel, S., et al. Checkpoints for Autoreactive B Cells in Peripheral Blood of Lupus Patients Assessed By Flow Cytometry. Arthritis Rheumatol. , (2016).
  15. Pape, K. A., Taylor, J. J., Maul, R. W., Gearhart, P. J., Jenkins, M. K. Different B cell populations mediate early and late memory during an endogenous immune response. Science. 331 (6021), 1203-1207 (2011).
  16. Abts, H., Emmerich, M., Miltenyi, S., Radbruch, A., Tesch, H. CD20 positive human B lymphocytes separated with the magnetic cell sorter (MACS) can be induced to proliferation and antibody secretion in vitro. Journal of immunological methods. 125 (1-2), 19-28 (1989).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Fc gamma

Похожие статьи