Методическая статья

Получение нечеловеческих приматов ткани головного мозга для предварительного внедрения иммуногистохимии и электронной микроскопии

DOI:

10.3791/55397

⸱

3 апреля 2017 г.

 , 
1Centre de recherche de l'Institut universitaire en santé mentale de Québec, Department of Psychiatry and Neuroscience, Université Laval, 2Centre de recherche du CHU Sainte-Justine

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы предлагаем простой, недорогой и эффективный по времени протокола к химически исправить примата ткани мозга с акролеина фиксатором, что позволяет для длительного хранения, который совместим с предварительно встраивание иммуногистохимии для просвечивающей электронной микроскопии.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Несмотря на все технические достижения на световом уровне микроскопии, электронная микроскопия остается единственным инструментом в нейробиологии, чтобы изучить и охарактеризовать ультраструктурные и морфологические детали нейронов, такие как синаптические контакты. Хорошее сохранение мозговой ткани для электронной микроскопии может быть получено строгими методами крио-фиксация, но эти методы являются весьма дорогостоящими и ограничить использование иммунноокрашивания, что имеет решающее значение для понимания связности определенных нейронных систем. Методы замораживания-замещения, были разработаны, чтобы обеспечить сочетание крио-фиксации с иммунноокрашивания. Однако воспроизводимость этих методологических подходов, как правило, опирается на дорогостоящих устройствах замораживания. Кроме того, достижение надежных результатов с этой техникой очень отнимающее много времени и навыки вызова. Следовательно, традиционный химически фиксированный мозг, в частности, с акролеином фиксатором, остается методом времени эффективного и недорогим, чтобы объединить электронмикроскопии с применением иммуногистохимии. Здесь мы предоставляем надежный экспериментальный протокол, используя химическую фиксацию акролеин, что приводит к сохранению примата ткани головного мозга и является совместимым с предварительно встраивание иммуногистохимии и просвечивающей электронной микроскопическое исследование.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Световая микроскопия, в том числе конфокальной и двухфотонной микроскопии, оказалась эффективным инструментом для изучения в естественных нейронных процессов, среди прочего , 1, 2. Несмотря на то, типичное пространственное разрешение на (LM) уровне световой микроскопии составляет около 200 нм, последние технологические достижения с использованием различных источников света, таких как крайней ультрафиолетовой и мягкой рентгеновской микроскопии, значительно увеличились это разрешение на почти 10 нм пространственным разрешением 3 , 4, 5. Другие технологические достижения в области обработки изображений включают в сочетании магнитно - резонансной томографии с гистологии и обеспечить новый способ для измерения толщины миелиновой оболочки в естественных условиях, параметр , который традиционно измерима только на электронно - микроскопических (ЭМ) уровне 6, 7. AlthouGH эти достижения на уровне LM обеспечивают отличный инструмент для изучения живых процессов, детального вида и характеристики структур, таких как синаптические контакты, может быть достигнуто только с ЭМ, который предлагает решение, которое может достигать 0,5 нма. Однако наблюдение на уровне EM требует образцы, чтобы быть мертвым и изменены в некоторой степени, с химическими фиксаторов и дегидратации процессов, с тем чтобы сохранить цитоархитектуру. Таким образом, рассматривая биологические образцы с высоким разрешением может быть сложной задачей из - за радиационного повреждения от электронного пучка, низкий контраст, структурных отклонений мембран, или даже наличие артефактов , которые могут возникнуть после обезвоживания и эпоксидной смолы вложение 8, 9, 10.

Сохранение образцов в их нативной форме для структурного анализа может быть достигнуто с помощью «Cryo EM стекловидных разделов» или CEMOVIS, секционирования подхода, которыйвключает быстрое замораживание и внедрение образца в стекловидном льде и изучении секций под EM при криогенной температуре 11, 12. Эта процедура позволяет для исследования образцов , пока они еще твердые и полностью гидратированный, тем самым устраняя артефакты , вызванные обезвоживанием процессов 13. Тем не менее, этот метод включает в себя дополнительные устройства для крио-ultramicrotomy, а также дополнительные устройства на стандарте EM, с тем чтобы этим наблюдением при очень низких температурах, которые генерируют значительные дополнительные затраты. Кроме того, подход CEMOVIS исключает использование иммунноокрашивания методов, так как антитела, как правило, должны быть инкубировали при комнатной температуре. В качестве альтернативы, можно сочетать ультраструктурный анализ с иммуногистохимическими процедурами с использованием сублимационного замещения подхода, в течение которых образцы крио-фиксированные медленно размороженный в то время погружены в крио-защитный химических веществах и йан внедренный в специализированных смол, таких как Lowicryls. После встраивания иммунноокрашивания затем могут быть выполнены на таком материале 12. Тем не менее, сублимационное замещение и крио-фиксирующая метода отнимает много времени. Они требуют установок дополнительного оборудования и все еще требуют образцов, которые подвергаются воздействию органического растворителя и химическому фиксатору , которые могут изменить цитоархитектуру, несмотря на использовании низкой температуры 14, 15. Таким образом, несмотря на все технические достижения как на LM и уровня EM, химической фиксации ткани головного мозга, в частности , с акролеином, остается недорогой и эффективный по времени метод , чтобы объединить иммуногистохимии с EM 16.

В последние десятилетия было сделано много попыток найти смесь альдегидов, которые обеспечивают наилучшую сохранность тканей. До 1960-х годов, единственный химический закрепляющий, что дало приемлемые результаты для EM был четырехокись осмия, Тем не менее, четырехокись осмия является высокотоксичным и дорогим, исключающее его применение через сосудистую систему, чтобы исправить органы, такие как мозг. Акролеина был введен в конце 1950 - х годов в качестве надежного способа для сохранения тканей животного , пригодного для ЭМ наблюдения клеточных структур 17. Он проникает в ткани более глубоко и реагирует быстрее , чем другие альдегиды , когда используются для фиксации путем погружения и обеспечивает хорошую сохранность компонентов цитоплазмы, с минимальной усадкой ткани 17. Такая особенность дает акролеин фиксации явное преимущество по сравнению с другими альдегидами при использовании в свежей ткани, позволяя более точную локализацию живого молекулярных соединений, такие как ферменты и другие белки 18. Действительно, это было подтверждено на протяжении многих лет, как легкий, эффективный и недорогого метод фиксации для визуализации на уровне ЕСТ у многих видов, в том числе амфибий и грызунов, как эффективно StabiliZes пептиды и белки, сохраняют антигенность и обеспечивают относительно нетронутых ультраструктур при использовании в сочетании с другим альдегидом фиксативом 16, 18, 19, 20, 21. Протоколы для фиксации в акролеине грызунов с тех пор были стандартизированы и широко используются, в частности , группа ПИКЕЛА, чтобы осуществить двойное иммунноокрашивание для EM 16, 22. Несколько групп использовали акролеин фиксации в тканях мозга приматов , не человек 23. Однако, насколько нам известно, есть только один протокол опубликован эффективно описывающий химическую фиксацию с акролеином в отличных от человека приматов , который совместим с ЭМ иммунноокрашивания 24.

В этой статье мы предлагаем простой и надежный способ эффективно химически исправить не-шумН. приматы мозг с акролеином, что позволяет для потенциально длительного хранения вместе с предварительно встраиванием иммунноокрашивания и EM передачи экспертизы.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Заявление по этике: Все протоколы с участием животных были утверждены Comité де защита дез Animaux де l'Université Laval и были сделаны в соответствии с Канадским советом по уходу за животными Руководства к уходу и использованию экспериментальных животных (Ed 2.). Протокол, описанный здесь, был оптимизирован для взрослых животных приблизительно 800 г. Объемы закрепителя должны быть скорректированы в зависимости от размера животного.

1. Приготовление растворов для транскардиальной перфузии

  1. Готовят 1 л раствора 50 мМ натрий-фосфатный буферный солевой раствор (PBS), в соответствии со следующими этапами. Приготовьте раствор максимум 24 ч перед перфузией и держать при температуре 4 ° С до использования.
    1. Мера 800 мл дистиллированной воды в 1 л лабораторный стакан. Добавьте 5,87 г безводного двухосновного фосфата натрия (Na 2 HPO 4), 1,20 г моногидрата одноосновного фосфата натрия (NaH 2 PO 4 · H 2 O), и 9 гхлорида натрия (NaCl),. Перемешать до растворения.
    2. Доводят рН до 7,4 постепенным добавлением 5 N NaOH. Добавить дистиллированную воду до достижения общего объема 1 л
      ВНИМАНИЕ: NaOH, является коррозионным химическим соединением. Носите соответствующие средства индивидуальной защиты (СИЗ;. Лабораторное пальто, перчатки, защитные очки и т.д.).
  2. Подготовьте 2 л 4% параформальдегида (PFA) в соответствии со следующими этапами. Это решение должно быть подготовлено не более 24 ч перед операцией и хранили при 4 ° С до использования.
    1. Мера 1,5 л дистиллированной воды в 2-л лабораторный стакан. Добавить 23,48 г безводного двухосновного фосфата натрия (Na 2 HPO 4) и 4,80 г моногидрата одноосновного фосфата натрия (NaH 2 PO 4 · H 2 O). Перемешать до растворения. Добавить дистиллированную воду до достижения общего объема 2 L.
    2. Раствор нагревают под вентиляционным колпаком, пока температура не достигнет примерно 45 - 55 ° C. Не нагревать до более чем 60 ° C.
    3. Постепенно добавить 80 г PFA в раствор и перемешивают до полного растворения (приблизительно 30 - 60 мин). Продолжайте контролировать температуру, чтобы держать его ниже 60 ° C.
      ВНИМАНИЕ: ПФ обладает высокой летучестью в виде порошка. Он очень токсичен при контакте с кожей или глазами и опасен при вдыхании или проглатывании. Носите средства индивидуальной защиты и использовать с осторожностью под вентиляционным колпаком.
    4. Раствор охлаждают до 4 & deg; С и ​​фильтруют. Хранить при 4 ° С.
  3. Готовит 1 л 3% акролеина в 0,1 М фосфатного буфера (PB) в соответствии со следующими этапами. Раствор ПБ должен быть подготовлен не более 24 ч перед перфузией.
    ВНИМАНИЕ: акролеин является высокотоксичным при вдыхании и может производить немедленный ущерб. Он также коррозионный и высокотоксичный при всасывании через кожу. Это канцероген и мутагенными свойствами. Носите соответствующие средства индивидуальной защиты и использовать под вентиляционным колпаком.
    1. Мера 800 мл дистиллированной воды. Добавьте 8,66 г безводного двухосновного фосфата натрия (Na 2 HPO 4) и 5,38 г моногидрата одноосновного фосфата натрия (NaH 2 PO 4 · H 2 O). Перемешать, пока все соли не растворятся. Добавить дистиллированную воду до достижения общего объема 1 л Хранить раствор при температуре 4 ° С.
    2. Перед операцией передачи 900 мл раствора PB в стеклянный контейнер объемом 1 л и добавляют 30,94 мл 97% -ного раствора акролеина под вентиляционным колпаком. Добавить решение PB для достижения общего объема 1 л и размешать. Фильтр решения и держать его при температуре 4 ° С.

2. транскардиальная перфузия и мозг Препарирование

  1. Хранить растворы на льду в течение всей хирургической процедуры. Подготовьте насос, поместив трубку в первом растворе, который будет использоваться (PBS, 50 мМ) и поворачивая насос, пока воздух не остается в шланге. Для транскардиальной перфузии макаки, ​​использовать 21 G иглу и установить отток при температуре приблизительно 80 мл / мин.
  2. Обезболить животное с внутримышечной инъекцией смесир кетамина (20 мг / кг), ксилазин (4 мг / кг) и ацепромазин (0,5 мг / кг). Поддерживать животное под изофлуран (3%) седативного эффекта.
  3. Закрепить конечности животного к столу вентилирования.
  4. С помощью скальпеля, удалить кожу до подмышек. Сокращение мышц живота. Используйте тяжелые хирургические ножницы, чтобы вырезать ребра по бокам, осторожно избегая жизненно важные органы.
  5. Вырезать диафрагму с хирургическими ножницами и поднимите грудную клетку, чтобы обнажить сердце. После того, как диафрагма режутся, действуйте быстро, так как сердце перестанет биться в течение нескольких минут.
  6. Удалить перикард с скальпелем и вставить иглу в левый желудочек. С помощью скальпеля, осторожно сделать небольшое иссечение в правое предсердие. Быстро запустить насос при 72 мл / мин и удерживать иглу на месте. Если возможно, наклоните животное, чтобы иметь свою голову на более низком уровне, чем сердце.
    Примечание: Будьте осторожны, чтобы не проколоть межжелудочковой перегородки при установке иглы.
    1. Rinsе кровь приблизительно 300 мл PBS, пока легкие белые и кровь не выходит из правого предсердия.
  7. Остановить насос, быстро перевести шланг / трубку с 3% -ным раствором акролеина и запустить насос снова. Постепенно увеличивайте скорость откачки до 80 мл / мин, как только сердце перестало биться. Заливать приблизительно 500 мл раствора акролеина.
  8. Остановить насос, быстро перенести шланг в 4% растворе PFA, и запустить насос снова. Этот шаг требует приблизительно 1 л PFA.
    Примечание: Фиксация завершена, когда передние конечности являются жесткими и шея жесткая.
  9. Отрежьте голову и тщательно препарировать мозг из черепа. Позаботьтесь, чтобы не повредить мозг с хирургическими инструментами. Перфузионное является оптимальным , когда мозг не бледный (никаких следов крови) и жесткие (Фигура 1А).
  10. Погрузите интактный мозг в 4% PFA в течение 1 ч при 4 ° С.
  11. Поочередно отрезать мозг с охлаждающей вибратомой (4 ° С)в желаемой плоскости в 50 мкм толщиной секций и собрать их в PBS (0,1 М) (рис 1B).
    Примечание: Этот шаг может быть осуществлен разными способами в соответствии с требуемым протоколом. Полушария могут быть разделены до вибратомы резки, или держали целое. Если мозг слишком велик для вибратомы платформы, она может быть разрезана на более мелкие блоки. После этого шага, секции могут храниться в течение длительного периода времени при -30 ° С в растворе антифриза из 40% PB (50 мМ), 30% глицерина и 30% этиленгликоля.

3. Предварительно вложение иммуногистохимии (рисунок 1C)

  1. Подготовьте 4 л исходного раствора трис-буферном солевом растворе (TBS, 50 мМ, рН 7,6) следующим образом.
    1. Мера 2 л дистиллированной воды в 4 л лабораторный стакан, добавляют 24,23 г тригидроксиметил аминметан (THAM; С 4 Н 11 NO 3), и перемешать до растворения.
    2. Доводят рН до 7,6 с приблизительно 148 мл 1 н HCl. Кислота должна быть добавлена ​​с cautiна, чтобы избежать достижения рН ниже 7,6. Общий объем должен быть 4 Л.
      ВНИМАНИЕ: HCl, оказывает сильное коррозионное воздействие. Носите соответствующие средства индивидуальной защиты.
  2. Выбор секции (от этапа 2.11), содержащей область интереса для обработки на EM иммуногистохимию.
  3. Промывают свободно плавающие секции 3x в PBS (0,1 М, рН 7,4) в течение 5 мин при комнатной температуре, чтобы промыть раствор антифриза.
  4. Готовят 0,5% -ный раствор NaBH 4 , разбавленный в PBS.
    1. Взвешивают 0,05 г NaBH 4 и разбавить его в 10 мл PBS. Не накрывать. Готовят этот раствор непосредственно перед использованием.
  5. Инкубируйте разделы в свежеприготовленный раствор NaBH 4 в течение 30 мин при комнатной температуре. Рок мягко. Не накрывать.
  6. Промыть 3 раза в PBS в течение 10 мин при комнатной температуре, не качалки энергично, пока ни одна из реакционного газа остается.
  7. Подготовьте блокирующий раствор для EM с 2% соответствующей нормальной сыворотки и 0,5% холодной рыбьего желатина, разведенного в PBS.
    Примечание: Количество Should рассчитывается для того, чтобы иметь достаточно для следующих трех шагов. Используйте сыворотку, сделанную из одних и тех же видов животных, принимающих вторичное антитело. Избегайте использование методов поиска антигена или добавления небольших количеств тритона (чтобы увеличить проникновение антител), так как эти способы существенно нарушить качество ткани.
  8. Инкубируйте секции в блокирующем растворе в течение 1 ч при комнатной температуре. Рок мягко.
  9. Готовят раствор первичного антитела, разбавленного в блокирующем растворе.
    Примечание: Концентрация первичного антитела, как правило, такие же, как для LM иммуногистохимии, но рассмотреть возможность проведения тестов с различными концентрациями антител заранее, так как некоторые первичные антитела не могут работать с акролеином. Если это так, то можно использовать смесь из глутарового альдегида (0,1 - 2%) и 4% PFA в течение транскардиальной перфузии и получить аналогичные результаты. Оптимизация времени инкубации и температуры, а также.
  10. Инкубируйте разделы в растворе первичного антителав течение ночи при комнатной температуре при осторожном покачивании. Используйте ранее испытанный время инкубации и температуры.
  11. Промыть секции 3x в PBS в течение 5 мин при комнатной температуре при осторожном покачивании.
  12. Подготовьте 1: раствор биотинилированного вторичного антитела, разбавленного в блокирующем растворе 1000.
    Примечание: Вторичное антитело должно быть поднято против вида хозяина, используемого для генерации первичного антитела.
  13. Инкубируйте разделы в растворе вторичного антитела в течение 1,5 ч при комнатной температуре. Рок мягко.
  14. Готовят раствор, по меньшей мере 60 мин до конца вторичной инкубации антитела авидин-биотин-пероксидаза (ABC).
    1. Используйте калиброванный пипетки для измерения 8,80 мкл / мл растворов А и В и разбавить их в PBS.
    2. Rock мягко в течение по крайней мере 60 мин при комнатной температуре, чтобы позволить полным св зывания между авидинами и биотином молекулами.
  15. После инкубации в растворе вторичного антитела, промыть 3 раза в PBS в течение 10 мин при комнатной температуре.
  16. Инкубируйте разделы в ABC такlution в течение 1 ч при комнатной температуре. Рок мягко.
  17. Промыть один раз в PBS и дважды в TBS в течение 10 мин при комнатной температуре при осторожном покачивании.
  18. Подготовьте свежий раствор 0,05% 3,3'-диаминобензидина (DAB) с 0,005% H 2 O 2 , разбавленного в TBS.
    1. Взвешивают 12,5 мг ДАБ и разбавить его в 25 мл холодного TBS. Защита от света.
      ВНИМАНИЕ: Порошок DAB обладает высокой летучестью и вреден при вдыхании. Он является канцерогенным и тератогенным. Таким образом, беременные или кормящие женщины не должны манипулировать этот продукт, даже при разбавлении. Используйте маску N95 при манипулировании и носить средства индивидуальной защиты.
    2. Фильтр решение и добавить 4,5 мкл 30% H 2 O 2 непосредственно перед использованием.
  19. Инкубировать срезы в растворе DAB в течение от 3 до 7 мин при комнатной температуре. Рок мягко.
    Примечание: Коричневый осадок не должен быть слишком темным, чтобы избежать высокого уровня фонового окрашивания. Время инкубации должны быть оптимизированы соответствующим образом.
  20. Остановить реакцию быстро мыть два разав холодной TBS, а затем два раза в течение 10 мин в холодном TBS при комнатной температуре, а затем два раза в течение 10 мин в PB, с мягким покачиванием.
    Примечание: Использование PB (и не PBS) имеет решающее значение для того, чтобы устранить любые следы NaCl, как он будет реагировать с осмия и формы кристаллов.

4. Osmification и встраивание для электронной микроскопии

  1. Готовят раствор 1% осмия (OSO 4) , разведенного в PB. Защита от света.
    ВНИМАНИЕ: осмий очень токсичен и не должны вступать в контакт с кожей, глазами, или рот и не следует вдыхать. Это может привести к смертельному исходу при попадании в организм. Она должна быть использована только под вентиляционным колпаком и с соответствующей индивидуальной защиты.
  2. Инкубируйте разделы в 4 растворе OSO в течение 30 мин при комнатной температуре под капотом вентиляции (без перемешивания) и покрывают их алюминиевой фольгой , чтобы защитить их от света. Полностью сплющить секции перед добавлением раствора OsO 4.
    Примечание: В секции становится очень темной и риGID, и следует манипулировать с осторожностью после этого шага.
  3. Подготовьте водоотталкивающую эпоксидную смолу в течение osmification.
    1. Добавьте соответствующие количества каждого из компонентов смеси эпоксидной смолы (20 г эпоксидной смолы, 20 г отвердителя, 0,6 г ускорителя и 0,4 г пластификатора) в большой пластмассовой чашке. Движение с деревянной палочкой или пластиковой пипеткой до получения однородного коричневого цвета.
      Примечание: Очень важно, чтобы использовать точную долю каждого компонента.
    2. Передача равных количеств алюминиевых чашек соответствующих размеров, в зависимости от количества секций, подлежащая обработке. Дайте ему отдохнуть.
  4. Вымойте osmificated секции 3x в ПБ в течение 10 мин при комнатной температуре с низкой скоростью качания.
  5. Высушить разделы в следующей серии градуированного этанола в течение 2 минут каждые: 2 раза в 35% этаноле; 1 раз каждый в 50, 70, 80, 90, и 95% -ный этанол; и 3x в 100% этаноле.
  6. Перенесите секции в стеклянные флаконы для завершения dehydratiна процесс путем инкубации срезов 3 раза в течение 2 мин в окись пропилена.
    ВНИМАНИЕ: Окись пропилена является очень летучим и токсичным органическим растворителем. Это может привести к серьезным повреждениям в глаза или на кожу при контакте или при вдыхании или проглатывании. Он был классифицирован как 2-й степени канцерогенного вещества. Она должна быть использована только под вентиляционным колпаком и средствами индивидуальной защиты. Кроме того, легко воспламеняется и должны храниться вдали от любого источника тепла.
    Примечание: Перед этой стадии секции должны быть осторожно переносили в стеклянные флаконы, так как окись пропилена представляет собой органический растворитель и несовместим с пластмассой. На данный момент, участки очень хрупкие и должны управляться с осторожностью. Секции могут быть переданы в качестве альтернативы стеклянных флаконов перед этапом 4.5.
  7. Передача секции осторожно, один за другим, в алюминиевые чашки и избежать контакта с воздухом как можно больше. Мини-вставлять разделы в предварительно смешанной водоотталкивающей эпоксидной смоле и инкубировать их на ночь под ventinг капот при комнатной температуре.
    Примечание: На этом этапе, секции полностью обезвожены и очень хрупки и следует манипулировать с осторожностью.
  8. Использование минерального масла, смазки готовят покрытые стеклянные слайды вместе с смазанным пластиковыми покровными.
  9. Смягчение смолы путем инкубирования алюминиевых чашек при температуре 60 ° С в течение 12-15 мин максимума. Тщательно расправьте участки на смазанную сторону предметного стекла. Поместите смазанные покровные и осторожно вытолкните оставшийся воздух.
  10. Инкубируйте слайды при температуре 60 ° С в течение 48 ч.
    Примечание: Очень важно, чтобы не превышать 48 ч времени инкубации, как смола будет слишком трудно.
  11. Удалите пластиковую покровные.

5. Подготовка проб для ультратонкой секционирования и наблюдения с помощью просвечивающего электронного микроскопа

  1. Используйте бинокль , чтобы найти интересующую область и вырезать небольшой четырехугольный кусок примерно 1 мм 2 с помощью скальпеля.
  2. Файл кончик блока смолы и клей Quadrangular кусок на него (рисунок 1С). Разрешить клей высохнуть в течение не менее 1 ч или в течение ночи перед секционирования.
  3. Использование ультрамикротома, вырезать четырехугольный кусок в 80 мкм толщины секций (рис 1D).
    1. Поместите блок смолы в ультрамикротоме палубы в вертикальном положении и, используя острое лезвие бритвы, постепенно разрезать каждую сторону блока смолы с образованием трапеции с гладкими сторонами.
    2. Поместите палубу в его горизонтальном положении и вращать блок до тех пор, длинная сторона трапеции не были обращены вниз.
    3. Используйте алмазный инструмент обрезки или стеклянный нож, чтобы обрезать поверхность четырехугольного куска. Установите ультрамикротоме вырезать 300 мкм толстых секций на 1 мм / с. Отрегулируйте нож, чтобы быть вертикально параллельно четырехугольного элемента и отображать очень небольшой горизонтальный угол приблизительно 1 °.
      Примечание: Этот угол позволит пользователю приблизиться к ткани почти параллельно поверхности Ьблокировки, где immunolabeled элементы более вероятно, будут найдены. При использовании этих параметров с помощью алмазного инструмента обрезки, смола показывает блестящий белый цвет. Когда ткань режется, он меняется на фиолетовый или зеленоватый цвет.
    4. Использование ультра 45 ° алмазного ножа, снабженная лодкой, заполненная дистиллированной водой, чтобы сократить толщину 80 мкм секций, разглаживают секции путем пропускания через них с куском поглощающей бумаги наклоненной в ксилоле, и собирать серийные срезы на формвар покрытии игровых сеток никелевых или голые 150 меш медных сеток (рис 1E).
  4. Поместите решетки в ящике для хранения сетки.
  5. Пятно сетки с цитратом свинца.
    1. Используйте 5 мл шприца и шприц 0,2 мкм фильтр, чтобы подготовить 1: 1 раствор фильтрованного цитрата свинца исходного раствора и фильтрованную дистиллированную воду. Защита от света.
      Примечание: Исходный раствор цитрата свинца должно быть свежее каждый месяц, чтобы избежать образования твердой Deposего. См паспорта на склад рецепт. Кроме того, если нужно быть окрашены многие серии сеток, изменить разбавленный раствор, когда он становится молочно.
    2. Поместите каждую сетку на каплю разбавленного раствора, с сечением в контакте с раствором. Инкубируют в течение 3 мин.
    3. Используйте маленькие щипчики для того чтобы держать сетку, и тщательно промойте его в двух стаканах, содержащих дистиллированную воду.
    4. Удалите излишки воды, осторожно с помощью абсорбирующей бумаги. Храните сетки в окне сетки. Подождите 30 минут , прежде чем рассматривать секции с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ; рис 1F).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом разделе представлены репрезентативные результаты, которые были получены после наблюдения, на уровне ЭМ передачи, из иммуноокрашивания примата ткани мозга химически фиксированной со смесью 3% акролеина и 4% PFA. Мы достигли хорошей сохранности ультраструктуры, как показано на относительно интактной миелиновой оболочки и аккуратной визуализации двойных мембран (фигура 2А). Синаптические контакты, наряду с нейронными элементами из микросреды, может быть легко идентиф...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этой статье мы представляем надежный протокол для транскардиальной перфузии приматов, отличных от человека и предварительно вложения иммуногистохимии, пригодной для EM образца экспертизы. Несмотря на то, типично крио-ЭМ, такие как CEMOVIS, обеспечивает хорошее сохранение ультраструктуры мозга, он также ограничивает использование иммуногистохимии 12. Другие методы, в том числе крио-замещения и методики Tokuyaso, позволяют после внедрения иммуногистохимии, но эти методы являются дорогостоящими из...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было поддержано естественных наук и инженерного исследовательского совета Канады (NSERC, 401848-2011 к МП). MP получил награду карьеры от Fonds де Recherche дю Квебек-Santé (FRQ-S). LE был получателем докторской стипендии от Frq-S (FRQ-S 14D 29441). Мы благодарим Мари-Жозе Уоллман за техническую помощь.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Двухосновной безводный фосфат натрия (Na2HPO4)Fisher scientificS374-500
Моноосновной моногидрат фосфата натрия (2PO4· H2O)EM ScienceSX0710-1
Хлорид натрия (NaCl)Fisher scientificS271-3
Гидроксиметиламинометан (THAM)Fisher scientificT370-500
HCl EMDHX0603-31 Н разбавление. Продукт вызывает коррозию. Используйте с соответствующей защитой.
Разведение NaOHEMDSX0590-15 N. Продукт вызывает коррозию. Используйте с соответствующей защитой.
Параформальдегид (PFA)SigmaP61484% разведение. Продукт обладает высокой летучей летучей способностью в виде порошка и высокой токсичностью. С осторожностью используйте под вентиляционным колпаком с соответствующей защитой.
Акролеин (90%)Сигма1102213% разведении. Продукт обладает высокой токсичностью. Используйте под вентиляционным колпаком с соответствующей защитой.
Стол для аутопсииMopecCE400
Электронный перфузионный насосcole parmermasterflex L/S 7523-90
Игла (перфузия)NN-1838R18 G 11/2
Иглатерумо NN-2713R21 г 1/2
Кетамин20 мг/кг
Ксилазин4 мг/кг
Ацепромазин0,5 мг/кг
Скальпель
ЛезвияПеро                   Лэнс201011                    J9913No22 для хирургии и No11 для ЭМ
Хирургические ножницы
Rongeurs
VibratomeLeicaVT 1200SКалибруйте лезвие перед каждым использованием, когда прибор позволяет это
Vibratome бритвенное лезвиеGilletteGIN 642107
глицериномFisher scientificG33-430% разбавление
ЭтиленгликольFisher scientificE178-430% разведение
Борогидрид натрия (NaBH4)SigmaS-9125
Нормальная лошадиная сыворотка (NHS)Jackson immunoResearch Laboratories008-000-1212% разведение
Холодный рыбный желатинAurion900.0330,5% разведение. Оригинальный продукт концентрирован на 40%
Первичное антитело, SERTSanta Cruz биотехнологияSC-14581/500 разведение
Первичное антитело, ChATChemicon (Millipore)AB144P1/25 разведение
Первичное антитело, THImmunoStar229411/1,000 разведение
Биотинилированное вторичное антитело, козаВектор лабораторииBA-95001/1,000 разведение
Биотинилированное вторичное антитело, мышьВектор лабораторииBA-20001/1,000 разведение
Vectastain elite ABC наборВектор лабораторииPK61008.8 &; L/мл А и В каждый
3,3'-диаминобензидин (DAB)SigmaD56370,05% разведение. Продукт обладает высокой летучей летучей способностью в виде порошка и токсичен. Не выбрасывайте отходы в раковину.
Перекись (H2O2) 30%Fisher scientificH-3230,005% разбавление
Тетраоксид осмия (OsO4)Электронная микроскопическая наука2% 19152
4% 19150
Исходный раствор может составлять как 2, так и 4%. Обратите внимание на то, какой из них используется для расчета окончательного разведения в 1%. Продукт очень чувствителен к свету. Осмий обладает высокой токсичностью. Используйте только под вентиляционным колпаком с соответствующей защитой.
Дуркупан водоотталкивающая эпоксидная смолаSigmaA: M эпоксидная смола (44611)
B: отвердитель 964 (44612)
C: ускоритель 960 (DY 060) (44613)
D: пластификатор (44614) 		Полимеризовать 48 ч при 58°С; C перед тем, как выбросить отходы.
Алюминиевые стаканчикиЭлектронно-микроскопическая наука70048-01
Этанолкоммерческие спирты1019CРазведенные в дистиллированной воде с соответствующей концентрацией
Оксид пропиленаЭлектрон микроскопический наука20401Органический растворитель. Высоколетуч и токсичен. Используйте под вентиляционным колпаком.
Непокрытые средние стекла предметные стеклалаборатории исследования мозга3875-FRСмазочная поверхность минеральным маслом
Пластиковая пленка (Aclar embedding film)Электронная микроскопическая наука50425-25Смазка поверхности минеральным маслом
УльтрамикротомLeica UC7EM UC7
Алмазный инструмент для обрезки (ультратрим)Диатом...UT 1081Можно использовать стеклянный нож в качестве альтернативы
Ultra 45° Диатомный алмазный ножDiatome MC13437оснащен лодкой
КсилолыFisher scientificX5SK-4
150-мешные медные сеткиElectron microscopic scienceG150-cu
сетка-боксElectron microscopic science71138Может хранить до 100 сеток
Цитрат натрияАнахимия81983
Нитрат свинцаSigmaL-6258Сделайте стоковый раствор цитрата свинца из 1,33  г нитрата свинца и 1,76  г цитрата натрия, разведенного в 42  мл предварительно кипяченой и охлажденной дистиллированной воды, к которой 8  мл 1  N NaOH добавляются после завершения преобразования из нитрата свинца в цитрат свинца. pH должен быть примерно 12. Храните раствор в герметичной пластиковой бутылке и бейте от света.
Шприцтерумо SS-05L5 мл
Шприцевой фильтрCorning4312220,2 & микро; m
Абсорбирующая бумага (бибуловая бумага)Электронная микроскопическая наука70086-1
ПарапленкаЛабораторная пленкаPM-999
Минеральное маслоSigmaM5904

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pozzi, P., Gandolfi, D., et al. High-throughput spatial light modulation two-photon microscopy for fast functional imaging. Neurophotonics. 2 (1), 015005(2015).
  2. Zhou, Y., et al. A comparison study of detecting gold nanorods in living cells with confocal reflectance microscopy and two-photon fluorescence microscopy. J. Microsc. 237 (2), 200-207 (2010).
  3. Chao, W., Kim, J., Rekawa, S., Fischer, P., Anderson, E. H. Demonstration of 12 nm resolution Fresnel zone plate lens based soft X-ray microscopy. Opt. Express. 17 (20), 17669-17677 (2009).
  4. Wachulak, P., Bartnik, A., Fiedorowicz, H. A 50 nm spatial resolution EUV imaging-resolution dependence on object thickness and illumination bandwidth. Opt Express. , (2011).
  5. Wachulak, P., et al. A compact "water window" microscope with 60 nm spatial resolution for applications in biology and nanotechnology. Microsc. Microanal. , 1-10 (2015).
  6. Stikov, N., et al. In vivo histology of the myelin g-ratio with magnetic resonance imaging. Neuroimage. 118, 397-405 (2015).
  7. Stikov, N., et al. Quantitative analysis of the myelin g-ratio from electron microscopy images of the macaque corpus callosum. Data Brief. 4, 368-373 (2015).
  8. Mollenhauer, H. H. Artifacts caused by dehydration and epoxy embedding in transmission electron microscopy. Microsc. Res. Tech. 26 (6), 496-512 (1993).
  9. Henderson, R. Realizing the potential of electron cryo-microscopy. Q. Rev. Biophys. 37 (1), 3-13 (2004).
  10. Sander, B., Golas, M. M. Visualization of bionanostructures using transmission electron microscopical techniques. Microsc. Res. Tech. 74 (7), 642-663 (2011).
  11. Ren, G., Rudenko, G., Ludtke, S. J., Deisenhofer, J., Chiu, W., Pownall, H. J. Model of human low-density lipoprotein and bound receptor based on cryoEM. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (3), 1059-1064 (2010).
  12. Webster, P., Schwarz, H., Griffiths, G. Preparation of cells and tissues for immuno EM. Methods Cell Biol. 88, 45-58 (2008).
  13. Kürner, J., Medalia, O., Linaroudis, A. A., Baumeister, W. New insights into the structural organization of eukaryotic and prokaryotic cytoskeletons using cryo-electron tomography. Exp. Cell Res. 301 (1), 38-42 (2004).
  14. Humbel, B. M. Freeze-substitution. Handbook of cryo-preparation methods for electron microscopy. 13, 319-341 (2009).
  15. Stierhof, Y., Humbel, B. M., van Donselaar, E., Schwarz, H. Cryo-fixation, freeze-substitution rehydration and Tokuyaso cryo-sectioning. Handbook of cryo-preparation methods for electron microscopy. 14, 344-365 (2009).
  16. Leranth, C., Pickel, M. V. Electron microscopic pre-embedding double-immunohistochemical methods. Neuroanatomical tract-tracing methods 2. , 129-172 (1989).
  17. Luft, J. H. The use of acrolein as a fixative for light and electron microscopy. Anat. Rec. 133, 305-305 (1959).
  18. Saito, T., Keino, H. Acrolein as a fixative for enzyme cytochemistry. J. Histochem. Cytochem. 24 (12), 1258-1269 (1976).
  19. King, J. C., Lechan, R. M., Kugel, G., Anthony, E. L. Acrolein: a fixative for immunocytochemical localization of peptides in the central nervous system. J. Histochem. Cytochem. 31 (1), 62-68 (1983).
  20. Sabatini, D. D., Bensch, K., Barrnett, R. J. Cytochemistry and electron microscopy. The preservation of cellular ultrastructure and enzymatic activity by aldehyde fixation. J. Cell Biol. 17, 19-58 (1963).
  21. Karlsson, U., Schultz, R. Fixation of the central nervous system for electron microscopy by aldehyde perfusion: I. Preservation with aldehyde perfusates versus direct perfusion with osmium tetroxide with special reference to membranes and the extracellular space. J. Ultrastruct. Res. 12, 160-186 (1965).
  22. Sesack, S. R., Pickel, V. M. Dual ultrastructural localization of enkephalin and tyrosine hydroxylase immunoreactivity in the rat ventral tegmental area: multiple substrates for opiate-dopamine interactions. J. Neurosci. 12 (4), 1335-1350 (1992).
  23. Mathai, A., Ma, Y., Paré, J., Villalba, R. M., Wichmann, T., Smith, Y. Reduced cortical innervation of the subthalamic nucleus in MPTP-treated parkinsonian monkeys. Brain. 138 (4), 946-962 (2015).
  24. Villalba, R. M., Paré, J., Smith, Y. Three-dimensional electron microscopy imaging of spines in non-human primates. Transmission electron microscopy methods for understanding the brain. 115, 81-103 (2016).
  25. Eid, L., Champigny, M., Parent, A., Parent, M. Quantitative and ultrastructural study of serotonin innervation of the globus pallidus in squirrel monkeys. Eur. J. Neurosci. 37 (10), 1659-1668 (2013).
  26. Eid, L., Parent, A., Parent, M. Asynaptic feature and heterogeneous distribution of the cholinergic innervation of the globus pallidus in primates. Brain Struct. Funct. 221, 1139-1155 (2016).
  27. Eid, L., Parent, M. Morphological evidence for dopamine interactions with pallidal neurons in primates. Front. Neuroanat. 9, 111-114 (2015).
  28. McDonald, K. High-pressure freezing for preservation of high resolution fine structure and antigenicity for immunolabeling. Methods Mol. Biol. 117, 77-97 (1999).
  29. Gilkey, J., Staehelin, L. Advances in ultrarapid freezing for the preservation of cellular ultrastructure. J. Electron Microsc. Tech. 3, 177-210 (1986).
  30. Korogod, N., Petersen, C. C. H., Knott, G. W. Ultrastructural analysis of adult mouse neocortex comparing aldehyde perfusion with cryo fixation. eLife. 4, (2015).
  31. Karlsson, U., Schultz, R. Fixation of the central nervous system for electron microscopy by aldehyde perfusion: III. Structural changes after exsanguination and delayed perfusion. J. Ultrastruct. Res. 14, 47-63 (1966).
  32. Schultz, R. L., Maynard, E. A., Pease, D. C. Electron microscopy of neurons and neuroglia of cerebral cortex and corpus callosum. Am. J. Anat. 100 (3), 369-407 (1957).
  33. Gocht, A. Use of LR white resin for post-embedding immunolabelling of brain tissue. Acta Anat. (Basel). 145 (4), 327-339 (1992).
  34. Eldred, W. D., Zucker, C., Karten, H. J., Yazulla, S. Comparison of fixation and penetration enhancement techniques for use in ultrastructural immunocytochemistry. J. Histochem. Cytochem. 31 (2), 285-292 (1983).
  35. Manocha, S. L. Effect of glutaraldehyde fixation on the localization of various oxidative and hydrolytic enzymes in the brain of rhesus monkey, Macaca mulatta. Histochem. J. 2 (3), 249-260 (1970).
  36. Mrini, A., Moukhles, H., Jacomy, H., Bosler, O., Doucet, G. Efficient immunodetection of various protein antigens in glutaraldehyde-fixed brain tissue. J. Histochem. Cytochem. 43 (12), 1285-1291 (1995).
  37. Storm-Mathisen, J., Ottersen, O. P. Immunocytochemistry of glutamate at the synaptic level. J. Histochem. Cytochem. 38 (12), 1733-1743 (1990).
  38. Hwang, S. J., Rustioni, A., Valtschanoff, J. G. Kainate receptors in primary afferents to the rat gracile nucleus. Neurosci. Lett. 312 (3), 137-140 (2001).
  39. Palay, S. L., McGee-Russeel, S. M., Gordon, S. Jr, Grillo, M. A. Fixation of neural tissues for electron microscopy by perfusion with solutions of osmium tetroxide. J. Cell Biol. 12, 385-410 (1962).
  40. Corthell, J. Chapter 9, Perfusion and Immersion Fixation. Basic Molecular Protocols in Neuroscience: Tips, Tricks, and Pitfalls. , 1st ed, Academic Press. 83-90 (2014).
  41. Helander, K. G. Formaldehyde prepared from paraformaldehyde is stable. Biotech. Histochem. 75 (1), 19-22 (2000).
  42. van Harreveld, A., Khattab, F. I. Perfusion fixation with glutaraldehyde and post-fixation with osmium tetroxide for electron microscopy. J. Cell. Sci. 3 (4), 579-594 (1968).
  43. Renno, W. M. Post-embedding double-gold labeling immunoelectron microscopic co-localization of neurotransmitters in the rat brain. Med. Sci. Monit. 7 (2), 188-200 (2001).
  44. Ellisman, M. H., Deerinck, T. J., Shu, X., Sosinsky, G. E. Picking Faces out of a Crowd: Genetic Labels for Identification of Proteins in Correlated Light and Electron Microscopy Imaging. Methods Cell Biol. 111, 139-155 (2012).
  45. Labrecque, S., et al. Hyperspectral multiplex single-particle tracking of different receptor subtypes labeled with quantum dots in live neurons. J. Biomed. Opt. 21 (4), 046008(2016).
  46. Bailey, R., Smith, A., Nie, S. Quantum dots in biology and medicine. Physica E Low Dimens. Syst. Nanostruct. 25 (1), 1-12 (2004).
  47. Perkovic, M., et al. Correlative light- and electron microscopy with chemical tags. J. Struct. Biol. 186 (2), 205-213 (2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

DAB

Похожие статьи