Одновременная оценка церебральной гемодинамики и свойств рассеяния света В Vivo Мозга крысы с помощью мультиспектральных диффузной отражательной визуализации

Summary

Одновременная оценка церебральной гемодинамики и легких рассеивающих свойств в естественных условиях ткани головного мозга крыс продемонстрировано с использованием обычной многоспектральных диффузного отражения системы формирования изображения.

Abstract

Одновременная оценка церебральной гемодинамики и светорассеивающих свойств мозговой ткани крысы in vivo демонстрируется с использованием обычной мультиспектральной системы визуализации диффузного отражения. Эта система состоит из широкополосного источника белого света, моторизованного фильтрующего колеса с набором узкополосных интерференционных фильтров, световода, собирающей линзы, видеозум-объектива и монохроматической камеры с заряженной связью (ПЗС). В кости черепа крысы под анестезией изофлурана создается эллипсоидальное черепное окно для получения in vivo мультиспектральных изображений диффузного отражения поверхности коры головного мозга. Регулирование фракции вдыхаемого кислорода с помощью устройства с газовой смесью позволяет вызывать различные респираторные состояния, такие как нормоксия, гипероксия и аноксия. Затем проводится множественный регрессионный анализ на основе моделирования методом Монте-Карло для измеренных мультиспектральных изображений диффузного отражения на девяти длинах волн (500, 520, 540, 560, 570, 580, 600, 730 и 760 нм) для визуализации двумерных карт гемодинамики и светорассеивающих свойств мозга крысы in vivo.

Introduction

Многоспектральное диффузное отражение изображение является наиболее распространенным методом получения пространственной карты собственных оптических сигналов (IOSs) в кортикальной ткани. IOSs наблюдается в головном мозге в естественных условиях в основном относится к трем явлениям: вариации в поглощении света и рассеивающие свойства из - за корковую гемодинамику, вариации в поглощении в зависимости от уменьшения или окисления цитохромов в митохондриях, и вариация в легких рассеивающих свойствах , индуцированных морфологическими изменения ^1.

Свет в видимой области спектра (VIS), чтобы в ближней инфракрасной области (NIR) области спектра эффективно поглощается и рассеивается биологической ткани. Диффузное отражение спектр в естественных условиях мозга характеризуются спектрами поглощения и рассеяния. Уменьшенные коэффициенты рассеяния ц _S 'мозговой ткани в результате диапазона длин волн VIS-к-НКА в однообразном рассеянии экспоната спектраМеньших величин при более длинных волнах. Спектр приведенных спектров рассеяния μ _s '(λ) можно аппроксимировать в виде функции степенного закона ^{2 , 3} при μ _s ' (λ) = a × λ ^-b . Сила рассеяния b связана с размером биологических рассеивателей в живой ткани ^{2 , 3} . Морфологические изменения ткани и снижение жизнеспособности живой ткани коры могут влиять на размер биологических рассеивателей ^{4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9} .

Оптическая система для мультиспектральной диффузно-отражательной визуализации может быть легко построена на лампе накаливания liGht, простые оптические компоненты и монохроматическое устройство с зарядовой связью (CCD). Поэтому для оценки корковой гемодинамики и / или тканевой морфологии ^{10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18} использовались различные алгоритмы и оптические системы для мультиспектрального диффузного отражения.

Метод, описанный в этой статье, используется для визуализации как гемодинамики, так и светорассеяния тканей головного мозга крысы in vivo с использованием традиционной мультиспектральной диффузно-отражательной системы формирования изображения. Преимущества этого метода над альтернативными методиками - это способность оценивать пространственно-временные изменения как в мозговой гемодинамике, так и в кортикальной тканиморфологии, а также его применимость к различным моделям дисфункции мозга животных. Таким образом, этот метод будет целесообразен для исследований травматического повреждения головного мозга, эпилептического припадка, инсульта и ишемии.

Protocol

Уход за животными, подготовка и экспериментальные протоколы были одобрены Исследовательским комитетом животных Токийского университета сельского хозяйства и технологий путем. По этой методике, крыса находится в контролируемой среде (24 ° С, 12 ч свет / темнота цикла), с пищей и водой , доступными по желанию.

1. Построение системы Обычного Multispectral диффузного отражение изображений

1. Крепление девять узкополосные интерференционные оптические фильтры с центром длинах волн 500, 520, 540, 560, 570, 580, 600, 730 и 760 нм до фильтрующих отверстий моторизованного фильтра колеса.
2. Построить мультиспектральную систему формирования изображения с использованием широкополосного источника белого света, моторизованный фильтра колесо с указанного выше набора узкополосных интерференционных фильтров, световод, собирающей линзы, видео-зум-объектив, а также монохроматического ПЗС-камеры. Расположение оптических компонентов, показанных на фиг.2, может быть использована для гоявляется процедура строительства.
   Примечание: Угол освещения приблизительно 45 ° по отношению к поверхности образца.
3. Включите источник света лампы галогена, чтобы осветить поверхность образца с помощью интерференционного фильтра, световода, и собирающей линзы.
4. Откройте управляющее программное обеспечение камеры CCD.

2. Подготовка животных

Примечание: В этом протоколе, крыса не использовалась для будущих экспериментов и была принесена в жертву сразу после измерений мультиспектральных изображений.

1. Подключение входного отверстия индукционной камеры к выходному порту анестезии машины с трубкой. Подключение выходного порта индукционной камеры к впускному отверстию машины анастезии со второй трубкой.
2. Поместите крысу в индукционной камеру и индуцировать анестезию с 5,0% изофлураном. Поддержание анестезии на глубине, так что крыса не реагирует на носок щепотку. LДо 2,0% изофлурана, используя вращающуюся ручку на анестезиологической машине.
3. Закрепите голову крысы в ​​стереотаксической рамке. Прикрепите мундштук для анестезии к стереотаксической рамке.
4. Соедините впускной канал мундштука с выходным отверстием анестезиологического аппарата с помощью трубки. Соедините выходное отверстие мундштука со впускным отверстием машины для анестезии с помощью трубки.
5. Бритье головы области за перспективный разрез сайта с помощью машинки для стрижки волос, пока поверхность кожи появляется.
6. Сделайте продольный разрез длиной около 20 мм вдоль средней линии головы с помощью хирургического скальпеля ( рис . 1 (а) ) и обнажите подкожные соединительные ткани ( рис. 1 (б) ).
7. Удалите подкожные соединительные ткани, используя острую кюретку или клешню, и потяните ее к обеим сторонам головы, чтобы обнажить кость черепа ( рис. 1 (c) ).
8. Выкопайте эллипсоидальный ров на кости черепа внутри черепного сутура(ы венечный шов, сагиттальный шов и ламбдовидные шовное) с помощью дрели высокоскоростной (Рисунок 1 (d)).
9. Медленно и гомогенно выкопать кости черепа внутри кювет с помощью дрели высокой скорости.
10. Слегка нажмите на поверхности утонченного черепа с кончиком пинцета, чтобы оценить толщину и прочность костной ткани после того, как появляются церебральные кровеносные сосуды. Если Утонченная область черепа угнетает легко, прекратить снижение кости черепа с бура с высокой скоростью.
11. Вырезать эллипсоидальную границу линию утонченного черепа по частям, используя кончик пинцета или небольших хирургических ножниц.
12. Снимите утонченный череп с поверхности мозга медленно и осторожно, используя клешню.
13. Аккуратно омывать черепной окно с физиологическим раствором и покрыть ее с прозрачной стеклянной пластиной толщиной около 0,1 мм.

3. Регулирование фракции вдыхаемого кислорода

Примечание: Дыхательная Кондиции может быть изменен путем регулирования фракции вдыхаемого кислорода (FiO _2).

1. Используя трубку, соединить первый порт разъема с Y-образной трубки (разъем 1) к первому порту другого соединителя Y-образной трубки (разъем 2).
2. Подключение входного отверстия мундштука ко второму порту соединителя трубки 1.
3. Использование трубки, подключить третий порт соединителя трубы 1 к устройству концентрации кислорода монитора.
4. С трубкой, подключить второй порт соединителя трубы 2 к выпускному отверстию анестезии машины.
5. Использование трубки, подключить третий порт соединителя трубы 2 к выпускному отверстию устройства газовой смеси.
6. Подключите один впускной порт устройства газовой смеси до высокого давления 95% O ₂ - 5% CO ₂ , газовый баллон с использованием трубки.
7. Подключите другой впускной порт устройства газовой смеси с высоким давлением 95% N ₂ - 5% CO ₂ газового баллона с использованием трубки.
8. Изменение скорости потока газа уплотнительнойе О ₂ и N ₂ с помощью поворотных регуляторов на устройстве газовой смеси.
9. Проверить и отрегулировать FiO ₂ с помощью устройства концентрации кислорода монитора.

4. Приобретение отражательных изображений Multispectral рассредоточенного

1. Приобретение эталонных изображений
   Примечание: Оптические компоненты, используемые в данном эксперименте, такие как источник света, оптическое волокно, и детекторы имеют свои собственные спектральные характеристики. Таким образом, интенсивность света проходит через эти компоненты должны быть записаны в качестве опорного изображения. Эталонное изображение является изображением, полученным с помощью стандартного белого диффузора освещенного света от источника света.
   1. Поместите стандартный белый диффузор на сцене в горизонтальном направлении.
   2. Фокус объектив камеры на поверхности белого диффузора, вращая кольцо масштабирования на баррель.
   3. Отрегулируйте время интегрирования камеры, выбрав нужное значение изВыпадающий список времен интеграции в рабочем программном обеспечении камеры, так что наибольшее количество света вырабатывает сигнал, который составляет приблизительно 75% от максимального числа отсчетов. Наблюдая гистограмму значений пикселей, отрегулируйте время интегрирования, пока уровень интенсивности сигнала не составит приблизительно 75% максимального значения.
   4. Выберите команду «сохранить» в меню «Файл», чтобы сохранить изображение в файл.
   5. Измените расположение фильтра, вращая колесо фильтра.
   6. Сохраните изображение на других длинах волн в соответствии с процессом, описанным выше. Имя файла должно идентифицировать образец и используемую длину волны ( например, W500, W520, W540 ... W760).
2. Приобретение образцов изображений
   Примечание. Изображения интенсивности диффузно отраженного света облученного мозга крыс на девяти длинах волн фиксируются и сохраняются на жестком диске персонального компьютера, используя те же условия приема.
   1. Осторожно поместите rна на сцене и медленно отрегулировать уровень ступени, так что камера может фокусироваться на поверхности мозга крысы.
   2. Выберите команду «Сохранить» из меню файла, чтобы сохранить изображение в файл.
   3. Изменение расположения фильтра путем поворота фильтра колеса.
   4. Сохранение изображения на других длинах волн, в соответствии со способом, описанным выше. Имя файла должно определить образец и длину волны (например, R500, R520, R540 ... R760).
3. Приобретение темных изображений
   Примечание: ПЗС-камера может генерировать интенсивность света в ответ на электрический сигнал. Тем не менее, есть некоторые незначительные выход из-за шума в электрических цепях и детекторов, даже если свет не попадает на детектор; это называется темновой ток шума. Для того, чтобы точно измерить спектральную интенсивность света, темная составляющая тока должна быть записана в виде темного изображения, а затем вычитается из измеренного сигнала. Темное изображение является взятие изображенияп с путем света блокируется.
   1. Выключить источник света галогенной лампы.
   2. Блокировать световой путь к системе ПЗС-камеры с помощью экранирующей пластины.
   3. Выберите команду «Сохранить» из меню файла, чтобы сохранить изображение в файл. Имя файла должно идентифицировать образец (например, темный).

5. Визуализируя Гемоглобин Содержание и светорассеяние параметра

Примечание: Набор мультиспектральных изображений диффузного отражения сохраняется на жесткий диск персонального компьютера и проанализировано в автономном режиме. Множественный регрессионный анализ автоматизированного с помощью моделирования методом Монте - Карло ¹⁹ мультиспектральных диффузных изображений отражения в девяти длин волн (500, 520, 540, 560, 570, 580, 600, 730 и 760 нм) Затем выполняется для визуализации двумерной карты окисленной концентрации гемоглобина, дезоксигенированная концентрация гемоглобина, общая концентрация гемоглобина, регионального мозгового насыщение кислорода и экскрементыдящая власть. Подробный алгоритм был опубликован в литературе ^{17, 18.}

1. Вычесть темное изображение как от эталонного изображения и изображения образца на каждую длину волны.
2. Нормализация изображение образца по эталонному изображению на каждой длине волны. Treat нормализованного изображения в качестве диффузного отражательных изображений R.
3. Вычислить оптическую плотность (или оптической плотности) изображения А, беря логарифм обратной величины диффузного отражения изображения R на каждой длине волны:
   (1)
4. Генерировать трехмерную матрицу путем укладки оптической плотности изображения в порядке их длин волн, где х - у самолета показывает структурную информацию , полученную на поверхности мозга , а г ось показывает спектральную информацию.
5. Пеrform множественный регрессионный анализ для поглощения спектра А (X) в каждой координатные.
6. Используйте абсорбцию спектр А (Х) в качестве зависимого переменного и молярного коэффициента экстинкции спектров оксигемоглобина е _ГБО (X) и венозной гемоглобина х _H (X) в качестве независимой переменных для шага 5.5 (опубликованные значений ε _ГБО (λ) и ε _HBr (λ), приведены в таблице 1).
7. Проверьте двумерные карты (изображения) из трех коэффициентов множественной регрессии с _ГБО с _HBr, и _0.
8. Сформировать трехмерную матрицу путем наложения изображения нескольких коэффициентов регрессии в порядке с _ГБО в _HBR, и _0, где y показывает структурную информацию, полученную для поверхности мозга, а ось z показывает коэффициенты множественной регрессии.
9. Рассчитайте концентрацию оксигенированного гемоглобина C _HbO , концентрацию дезоксигенированного гемоглобина C _HbR и мощность рассеяния b из набора коэффициентов множественной регрессии a _HbO , a _HbR и a ₀ при каждой координате xy, используя следующие эмпирические формулы (значения β _{HbO , i} , β _{HbR , i} и β _{0, i} ( i = 0,1,2,3) _{представлены} в таблице 2 ):
   (2)
   (3)
   (4)
10. Проверьте двумерные карты (образов) окисленного концентрации гемоглобина С _ГБО, в деоксигенированной концентрации гемоглобина С _HBr, а мощность рассеяния б.
11. Рассчитать двумерную карту общей концентрации гемоглобина C _HBT путем суммирования C _ГБО и C _HBr при каждом х - координаты у.
12. Рассчитать двумерную карту регионального мозгового насыщения кислородом RSO ₂ путем деления концентрации гемоглобина кислородом С _ГБО от общей концентрации гемоглобина C _HBT в каждой точке х - координаты у.

Results

Характерные спектральные изображения диффузного отражения , полученной из в естественных мозга крыс показаны на фигуре 3. Изображения на 500, 520, 540, 560, 570, и 580 нм четко визуализировать плотную сеть кровеносных сосудов в коре головного мозга. Ухудшение контраста между кровеносными сосудами и окружающими тканями, наблюдаемыми в изображениях при 600, 730 и 760 нме отражает более низкое поглощение света гемоглобина на дольше и NIR длины волн.

Discussion

Наиболее важным шагом в этом протоколе является удаление из разреженной области черепа, чтобы сделать черепной окно; это должно быть выполнено тщательно, чтобы избежать неожиданного кровотечения. Этот шаг важен для получения высококачественного Multispectral диффузного отражения изображения с высокой точностью. Использование стереомикроскопа рекомендуется для хирургической процедуры, если это возможно. Небольшие кусочки желатиновой губки полезны для гемостаза.

Оптическая система описаны в эт...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Источник света галогенной лампы мощностью 150 Вт	Hayashi Watch Works Co., Ltd, Токио, Япония	LA-150SAE
Световод	Hayashi Watch Works Co., Ltd, Токио,	Япония LGC1-5L1000
Собирающий объектив	Hayashi Watch Works Co., Ltd, Токио, Япония	SH-F16
Интерференционные фильтры l@ 500 нм	Edmund Optics Japan Ltd, Токио, Япония	#65088
Интерференционные фильтры l@ 520 нм	Edmund Optics Japan Ltd, Токио, Япония	#65093
Интерференционные фильтры l@ 540 нм	Edmund Optics Japan Ltd, Токио, Япония	#65096
Интерференционные фильтры l@ 560 нм	Edmund Optics Japan Ltd, Токио, Япония	#67766
Интерференционные фильтры l@ 570 нм	Edmund Optics Japan Ltd, Токио, Япония	#67767
Интерференционные фильтры l@ 580 нм	Edmund Optics Japan Ltd, Токио, Япония	#65646
Интерференционные фильтры l@ 600 нм	Edmund Optics Japan Ltd, Токио, Япония	#65102
Интерференционные фильтры l@ 730 нм	Edmund Optics Japan Ltd, Токио, Япония	#65115
Интерференционные фильтры l@ 760 нм	Edmund Optics Japan Ltd, Токио, Япония	#67777
Моторизованное фильтрующее колесо	Andover Corporation, NH, США	FW-MOT-12.5
8-битная монохроматическая ПЗС-камера	THE IMAGINGSOURCE, Германия	DMK21BU618. H
Видеозум-объектив	Edmund Optics Japan Ltd, Токио, Япония	VZMTM300i
Спектралон белый стандарт с 99% диффузным отражением	Labsphere Incorporated, North Sutton, NH, США	SRS-99-020