Методическая статья

Использование микрофлюидальных устройств для измерения срок службы и сотовых фенотипов в одиночных дрожжевых клетках почкования

DOI:

10.3791/55412

⸱

30 марта 2017 г.

 ,  ,  ,  , 
1The State Key Laboratory for Artificial Microstructures and Mesoscopic Physics, School of Physics, Peking University, 2Department of Biochemistry and Biophysics, University of California, San Francisco, 3Peking-Tsinghua Center for Life Sciences at Center for Quantitative Biology, Academy for Advanced Interdisciplinary Studies, Peking University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Данная статья представляет собой протокол, оптимизированный для производства чипов микрофлюидальных и настроек микрофлюидальных экспериментов для измерения продолжительности жизни и клеточных фенотипов одиночных дрожжевых клеток.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Почковающиеся дрожжи Saccharomyces cerevisiae являются важным модельным организмом в исследованиях старения. Генетические исследования выявили множество генов, которые оказывают консервативное влияние на продолжительность жизни у разных видов. Тем не менее, молекулярные причины старения и смерти остаются неясными. Чтобы получить систематическое понимание молекулярных механизмов, лежащих в основе старения дрожжей, нам нужны высокопроизводительные методы для измерения продолжительности жизни и количественной оценки различных клеточных и молекулярных фенотипов в отдельных клетках. Ранее мы разработали микрофлюидные устройства для отслеживания почковающихся материнских клеток дрожжей на протяжении всей их жизни, одновременно вымывая новорожденные дочерние клетки. В данной статье представлен метод получения микрофлюидных чипов и постановки микрофлюидных экспериментов. Несколько каналов могут использоваться для одновременного отслеживания клеток в разных условиях или от разных штаммов дрожжей. Типичная установка может отслеживать сотни клеток на канал и позволяет получать изображения с помощью микроскопа с высоким разрешением на протяжении всего срока службы клеток. Наш метод также позволяет детально охарактеризовать продолжительность жизни, молекулярные маркеры, морфологию клеток и динамику клеточного цикла отдельных клеток. Кроме того, наше микрофлюидное устройство способно захватывать значительное количество свежих материнских клеток, которые могут быть идентифицированы с помощью последующего анализа изображений, что позволяет измерять продолжительность жизни с более высокой точностью.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Баддинги дрожжей является мощной моделью организмом в исследовании старения. Однако традиционный анализ продолжительности жизни дрожжей зависит от микродиссекции, который является не только трудоемкий , но и низкой пропускной способностью 1, 2. Кроме того, традиционная микродиссекция подход не дает детальное представление о различных клеточных и молекулярных особенностях в отдельных материнские клетках, поскольку они стареют. Развитие микрофлюидальных устройств позволило автоматизированную процедуру для измерения дрожжей срока службы, а также , чтобы следовать молекулярным маркерам и различные клеточные фенотипам в течение всего срока службы материнских клеток 3, 4, 5, 6, 7, 8. После того, как клетки дрожжей загружаются в микрожидкое устройство, они могут быть отслежены под микроскопом с помощью автоматических временных кругове изображений. С помощью визуализации инструменты обработки, различные клеточные и молекулярные фенотипы могут быть извлечены 3, 6, 8, в том числе срока службы, размера, флуоресцентный репортера, клеточной морфологии, динамики клеточного цикла, и т.д., многие из которых трудно или невозможно получить , используя традиционный метод микродиссекции. Микрофлюидальные устройства приобрели широкую известность в научных исследованиях дрожжей старения , так как их успешного развития несколько лет назад 3, 4, 6, 7. Несколько группы впоследствии опубликованы на вариации предыдущих конструкций 5, и многие дрожжевые лаборатории использовали микрожидкостные устройства для их изучения.

В культуре клеток, подвергающейся экспоненциальный рост, число пожилых материнских клеток, которые доступны для наблюдения miniscuле. Таким образом, общий принцип конструкции микрожидкостных устройства для измерения продолжительности жизни является сохранением материнских клеток и удалить дочерние клетки. Одним из таких конструкций используют тот факт, что дрожжи подвергается асимметричному делению клеток. Структуры в устройстве поглотит крупные материнские клетки и позволяют более мелкие дочерние клетки должны быть смыты. Микрожидкостный чип описан в этой статье используется мягкая полидиметилсилоксан (PDMS) подкладки (вертикальные столбцы Pensile) для улавливания материнских клеток (рис 1). Устройства аналогичной конструкции были ранее сообщалось 3, 4, 6, 7. Этот протокол использует более простую процедуру для изготовления микрожидкостных устройств и простого метода клеточной загрузки, который оптимизирован для экспериментов визуализации покадровых. Одним из ключевых параметров в микрофлюидальном устройстве ширин PDMS прокладок, используемых для ловушки материнских клеток. Наш device использует более широкие подушечки, которые могут держать больше маточных клеток в каждой площадке, в том числе значительной части свежих материнских клеток, которые можно отслеживать на протяжении всей их жизни. В дополнении к измерениям продолжительности жизни, этот протокол является полезным для экспериментов визуализации одной клетки покадровых когда клетки должны быть отслежены в течение многих поколений, или когда наблюдение в течение всего срока службы необходимо.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Кремний вафельные Mold Fabrication

Примечание: фотошаблон разработан с программным обеспечением AutoCAD и производством коммерческой компанией. Эта конструкция состоит из трех слоев различных шаблонов ( Дополнительный File 1 ). Высоты первого, второго, и третьего слоев около 4 мкм, 10 мкм и 50 мкм, соответственно. Кремниевая пластина пресс - форма была создана из фотошаблона , используя мягкую литографию 9, 10.

  1. Испечь кремниевую пластину при 200 ° С в течение 10 мин для испарения водяного пара. Спин покрытие негативного фоторезиста СУ-8 на кремниевой пластине.
    Примечание: Спин покрытие СУ-8 3005 при 5000 оборотах в минуту в течение 30 с, чтобы генерировать первый слой, СУ-8 2010 при 3000 оборотах в минуту в течение 30 с, чтобы создать второй слой, и SU-8 3025 при 2000 оборотах в минуту в течение 30 секунд, чтобы генерировать третий слой.
  2. Мягкая выпекать пластины с нанесенным покрытием до тон перенос рисунка. Выравнивание и подвергать пластины в режиме «прямой контакт» с использованием маски выравнивателя.
    Примечание: Soft-выпекать пластины в течение 2 мин при 95 ° С в течение первого слоя, 3 мин при 95 ° C для второго слоя и 15 мин при 95 ° С в течение третьего слоя. Используйте дозу облучения при 100 мДж / см 2 для первого слоя, 130 мДж / см 2 для второго слоя и 200 мДж / см 2 для третьего слоя.
  3. После экспозиции, после выпекать пластины и развивать его с помощью SU-8 проявителя. Сушат пластины с использованием N 2 пистолета и трудно выпекать пластины при 200 ° С в течение 30 мин.
    Примечание: кремниевая пластина форма прикреплена к 15 см диаметр пластиковой чашки Петри с помощью скотча, с боковым узором лицевой стороны вверх. Как правило, мы помещаем несколько структур идентичны чип на одной и той же пресс-форме, что позволяет несколько микрофлюидные чипы, которые будут изготовлены в то же самое время. Каждая форма может быть повторно использована много раз, чтобы изготовить микрофлюидальных чипы.

2. микрожидкостныхЧип Fabrication

  1. Поместите чистый вес лодку на весах и тарирование. Залить 50 г PDMS основания в взвешивании лодки.
  2. Добавляют 5 г PDMS отвердителя на взвешивании лодки (вес / вес соотношении 1:10 к основанию PDMS).
    Примечание: Этот объем основан на 15 см диаметра чашки Петри с формой. Регулировка количества реагента при использовании чашки Петри другого размера.
  3. Перемешать основание PDMS и отвердитель с одноразовой пипеткой. Начните с краями взвешенной лодочки и медленно двигаться внутрь. тщательно перемешать в течение нескольких минут, пока маленькие пузырьки не образуются по всей смеси; тщательное перемешивание имеет важное значение для полимеризации PDMS.
  4. Поток смесь медленно в чашку Петри; смесь должна полностью покрыть кремниевую пластину пресс-форму.
  5. Поместите чашку Петри в вакууме в течение 10 мин, чтобы удалить все пузырьки воздуха из смеси PDMS. Если пузырьки остаются на поверхности смеси, с помощью пипетки, чтобы взорвать их.
  6. Инкубируйте кремнийпластины пресс-формы с PDMS в печи при 75 ° С в течение приблизительно 2 ч.
  7. Аккуратно очистить слой полимеризованных PDMS отходящих от кремниевой пластины пресс-формы, избегая любого повреждения конструкции пластин пресс-формы. В качестве альтернативы, вырезать PDMS непосредственно из кремниевой пластины пресс-формы с минимальным запасом 5 мм вокруг рисунка с использованием одного края промышленного лезвия бритвы; осторожно очистить слой PDMS выключения вафельной формы.
  8. Поместите слой PDMS на скамье с боковым узором лицевой стороны вверх. Тщательно вырезать отдельный чип с одним краем промышленной лезвием бритвы, сохраняя достаточный запас прочности от края каждого одного чипа, чтобы избежать повреждения конструкции.
  9. С бокового шаблоном лицевой стороны вверх, использовать пуансон ручку (0,75 мм ID) для пробивки отверстий прямо вниз через входные и выходные круги на каждой стороне каналов.
    Примечание: Эти отверстия создают пути для потока среды. Поэтому крайне важно, чтобы пройти через круги и удар весь путь через слой PDMS. Убедись вудалить столбцы PDMS из отверстия.
  10. Проверьте каждую пробитое отверстие, вставив удар пера иглу снова в отверстие. Убедитесь, что игла может выйти с другой стороны, указывая, что нет закупорки. Нанесите ленту на поверхность шаблона, затем аккуратно снимите пленку для очистки частиц пыли. Повторите этот шаг, по крайней мере в три раза. Оставьте чистый кусок скотча на PDMS для поддержания стерилизации.
  11. Повторите эту процедуру на противоположной стороне PDMS и оставить последнюю часть ленты на а.
  12. Подготовка 24 мм х 30 мм покровного стекла с толщиной 0.13-0.17 мм. Спрей 70% этанола на стекле и насухо для удаления пыли, чтобы стерилизовать поверхность; Кроме того, стекло может быть промыто автоклавной водой и сушит для удаления пыли.
  13. Передача покровного стекла и PDMS к пластиковой пластине. Снимите липкую ленту с PDMS и положите шаблон лицевой стороной вверх. Избегать контакта с поверхностью шаблона во время передачи.
  14. Поместите пластиковую пластину в плазменной машине. Применение плазменной обработки кислорода к PDMS и покровное стекло для визуализации поверхности гидрофильные со следующими параметрами работы: экспозиция, 75 с; Стабилизация газа, 20 см / мин; давление, 200; и мощность, 100 Вт
  15. Осторожно поместите PDMS на покровное стекло, соединяя обе гидрофильные поверхности (поверхности, которые, с которыми сталкиваются в ходе плазменной обработки). Убедитесь, что нет пузырьков воздуха между PDMS и покровным стеклом.
  16. Инкубируйте чип PDMS в сушильном шкафу при 75 ° С в течение по меньшей мере 2 ч.
    Примечание: Дефектные микрофлюидики могут привести к утечке жидкости в микроскоп во время эксперимента. Поэтому важно, чтобы проверить связь между PDMS и покровного стекла, слегка поднимая PDMS от краев с помощью пинцета. Осторожно поднимая PDMS не должен отделить его от покровного стекла, что указывает на успешную связь.

3. Подготовка к эксперименту

    Подготовка труб.
    1. Submerge входные и выходные трубы в 70% растворе этанола отдельно за 1 день до получения чипа ПДМС.
    2. Заполните 5-мл шприц с автоклавной водой, чтобы промыть трубы. Промыть каждую пробирку, подключив трубку на шприц и промывки трубки с водой.
    3. Повторите стадии промывки по крайней мере, 3 раза, чтобы очистить остаток этанола.
  1. Проверьте PDMS каналов под оптическим микроскопом с объективом 10Х, чтобы убедиться, что структура соответствует и неповрежденными. Стабилизировать чип PDMS на платформу микроскопа с помощью скотча.
    Примечание: Сделайте несколько фишек за один раз в шаге 2, чтобы гарантировать, что есть резервные чипы, особенно если сделать устройство в первый раз.
  2. Заполните 5-мл шприц с автоклавной водой. Безопасный шприц в шприцевой насос и вставить соответствующие входные и выходные трубы. Установите скорость стирки до 750 мкл / ч для промывки чипа в течение приблизительно 10 мин. Воздушные пузырьки на ветке каналовдолжны быть смыты в течение этого периода; если есть остальные пузырьки, вручную регулировать скорость удаления пузырьков.
  3. Дрожжи подготовки образца.
    1. Передача 1 мл подготовленного образца дрожжей (OD 600 0,6-0,8) на две 1,5-мл микроцентрифужных пробирках и центрифугируют в течение 5 мин при 3000 х г.
    2. Удалить большинство супернатанта из каждой пробирки и объединяют остаток с образованием пробы 0,5 мл.
  4. Пауза шприцевой насос и удалите входные трубки от чипа PDMS.
  5. Вручную обратный шприцевой насос, чтобы сосать небольшой воздушный пузырь (от 1 до 2 см в длину) в каждой входной трубы. Перемещение по сосать в образце дрожжей; воздушный пузырек покажет границу образца и указать, сколько образец был нарисован.
    Примечание: Во избежание всасывания образца в шприц.
  6. Вставьте входной трубки обратно в чип PDMS и перезапустить насос для загрузки ячейки со скоростью 750 мкл / ч.
  7. Оставьте шприц насоса в течение 10 мин вп и исследовать прогрессию клеточного загрузки под микроскопом; успешная загрузка воля клетка ловушки под более чем 60% приостановить столп.
  8. Переключение в питательный раствор и регулировать скорость до 400 мкл / ч для культивирования клеток.
  9. Выбор позиции наблюдения за микроскопом.
    Примечание: Для измерения продолжительности жизни, снимки были сделаны один раз каждую 15 мин с помощью оптического микроскопа с 40x объективом. Для флуоресцентного анализа репортера, изображения были взяты один раз каждые 15 мин с помощью флуоресцентного микроскопа с целью 60X нефти.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

После экспериментов продолжительность жизнь этих клеток и многих клеточных и молекулярных фенотипов может быть извлечена из записанных изображений покадровых. Поскольку существует целый ряд различных функций, которые могут быть извлечены из каждой ячейки, первый шаг анализа состоит в том, чтобы аннотировать клетки и событие, в том числе положений и границ ячеек и синхронизации различных событий, которые отслеживаются, например как многообещающие события. Эти аннотации облегчат возвращать...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Устройство ПДМСА должно быть свежеприготовленным. В противном случае, пузырьки воздуха, вызванные вставки трубы в устройство будет трудно удалить. Шаг 3.4 имеет важное значение для повышения эффективности нагрузки сотовой ячейки путем концентрации клеток. Для того, чтобы увеличить пропускную способность эксперимента, от 4 до 6 модулей на одном чипе PDMS соединены с независимо друг от друга, работающие насосы, как правило, используются для выполнения от 4 до 6 различных экспериментов (различные штаммы или медиа-композици...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было поддержано NIH Grant AG043080 и Национальным фондом естественных наук Китая (NSFC), No 11434001. Мы благодарим Лукаса Вальдбургера за корректуру рукописи.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
3'' < 111> кремниевая пластинаAddison Engineering
SU-8 серии 2000 и 3000MicroChem
Sylgard® 184 Набор силиконовых эластомеровEllsworth2065622Включает в себя основу силиконового эластомера Sylgard® и отвердитель Чашки
ПетриVWR391-1502
Harris Uni-core™ пуансон (внутренний диаметр 0,75 мм)Sigma-Aldrich
24 мм x 40 мм SLIP-RITE® защитное стеклоThermo Fisher Scientific102440
3M СкотчULINES-10223
VWR® Бритвенные лезвияVWR55411-050
Чистый этанол, KoptecVWR64-17-5
Whoosh-Duster™VWR16650-027
Шприц BD объемом 5 мл (Luer-Lock™ Совет)Becton, Dickinson and Company309646
Трубка со стандартной стенкой из ПТФЭ (100 футов, размер AWG: 22, номинальный ID: 0.028)Компания по поставке компонентовSWTT-22
Ассортимент игл Компанияпоставке компонентовNEKIT-1
ЭксикаторHACH2238300
Лабораторная печьFisher Scientific13246516GAQ
Микроскоп Nikon TE2000 с объективом 40Х и 60ХNikon
Zeiss Axio Observer Z1 с объективом 40Х и 60ХZeiss
LongerpumpTS-1B
29002513 по Шприцевой насос

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mortimer, R. K., Johnston, J. R. Life span of individual yeast cells. Nature. 183 (4677), 1751-1752 (1959).
  2. Polymenis, M., Kennedy, B. K. Cell biology: High-tech yeast ageing. Nature. 486 (7401), 37-38 (2012).
  3. Xie, Z., et al. Molecular phenotyping of aging in single yeast cells using a novel microfluidic device. Aging Cell. 11 (4), 599-606 (2012).
  4. Zhang, Y., et al. Single cell analysis of yeast replicative aging using a new generation of microfluidic device. PLoS One. 7 (11), e48275(2012).
  5. Chen, K. L., Crane, M. M., Kaeberlein, M. Microfluidic technologies for yeast replicative lifespan studies. Mech Ageing Dev. , (2016).
  6. Lee, S. S., Avalos Vizcarra,, Huberts, I., H, D., Lee, L. P., Heinemann, M. Whole lifespan microscopic observation of budding yeast aging through a microfluidic dissection platform. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (13), 4916-4920 (2012).
  7. Huberts, D. H., Janssens, G. E., Lee, S. S., Vizcarra, I. A., Heinemann, M. Continuous high-resolution microscopic observation of replicative aging in budding yeast. J Vis Exp. (78), e50143(2013).
  8. Jo, M. C., Liu, W., Gu, L., Dang, W., Qin, L. High-throughput analysis of yeast replicative aging using a microfluidic system. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (30), 9364-9369 (2015).
  9. Mata, A., Fleischman, A. J., Roy, S. Fabrication of multi-layer SU-8 microstructures. Journal of Micromechanics and Microengineering. 16 (2), 276-284 (2006).
  10. Xia, Y. N., Whitesides, G. M. Soft lithography. Angewandte Chemie-International Edition. 37 (5), 550-575 (1998).
  11. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  12. Xie, Z., et al. Early telomerase inactivation accelerates aging independently of telomere length. Cell. 160 (5), 928-939 (2015).
  13. Boy-Marcotte, E., et al. The heat shock response in yeast: differential regulations and contributions of the Msn2p/Msn4p and Hsf1p regulons. Mol Microbiol. 33 (2), 274-283 (1999).
  14. Yang, X., Lau, K. Y., Sevim, V., Tang, C. Design principles of the yeast G1/S switch. PLoS Biol. 11 (10), e1001673(2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Microfluidic DeviceYeast LifespanCell LoadingMicroscope ImagingPDMS ChipFlow RateYeast SampleImage Analysis

Похожие статьи