Методическая статья

Использование ферментных биосенсоров на основе измерить Тоник и фазовый глутамат в мышиных моделях болезни Альцгеймера

DOI:

10.3791/55418

⸱

3 мая 2017 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Psychology, West Virginia University, 2Department of Drug Discovery & Development, Auburn University, 3Department of Neuroscience, University of Kentucky Medical Center

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы описываем установку программного обеспечения, навигацию и анализ данных для пространственно и во время точного способа измерения тонизирующих и фазовые внеклеточные изменений глутамата в естественных условиях , используя связанные с ферментом микроэлектрода массивов (MEA).

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Нейротрансмиттеров нарушения часто является ключевым компонентом заболеваний центральной нервной системы (ЦНС), играет определенную роль в патологии, лежащей в основе болезни Альцгеймера, болезни Паркинсона, депрессии и тревоги. Традиционно, микродиализ был наиболее распространенным (хвалили) метод для изучения изменений нейротрансмиттеров, которые возникают в этих расстройствах. Но поскольку микродиализ имеет возможность измерять медленные изменения 1-20 минутных через большие участки ткани, имеет тот недостаток, инвазивность, потенциально разрушая внутренние соединения внутри мозга и возможностей медленной выборки. Относительно новый метод, массив микроэлектродов (МЭС), имеет многочисленные преимущества для измерения специфических изменений нейротрансмиттеров внутри дискретных областей головного мозга, как они происходят, что делает для пространственно и во время точного подхода. Кроме того, с помощью МЭС является минимально инвазивной, что позволяет для измерения нейротрансмиттерных изменений в естественных условиях. В нашей лаборатории, мы гаве был специально заинтересованы в изменении нейромедиатора, глутамат, связанный с патологией болезни Альцгеймера. Таким образом, способ, описанный здесь, был использован для оценки потенциальных нарушений гиппокампа в глутамате в трансгенной мышиной модели болезни Альцгеймера. Вкратце, метод, используемый включает в себя нанесение на несколько площадок микроэлектрода с ферментом очень селективным для нейротрансмиттер интереса и использования автореферентного сайтов для вычитания фонового шума и мешающих а. После того, как покрытие и калибровка, МЭУ может быть построена с помощью микропипетки и опускают в области мозга интереса с использованием стереотаксической устройства. При этом, способе, описанном включает обезболивающий RTG (TauP301L) 4510 мышей и с помощью стереотаксического устройства точно ориентировать подобласти (DG, СА1 и CA3) гиппокампа.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Измерение нейромедиаторов изменений в головном мозге является важным инструментом для нейробиологов, изучающих заболевания центральной нервной системы (ЦНС), которые часто характеризуется нейромедиатор дизрегуляция. Хотя микродиализ в сочетании с жидкостной хроматографией высоким давлени (ВЭЖЙ / EC) был наиболее широко используемым методом для измерения изменений внеклеточного уровня нейротрансмиттеров 1, 2, 3, 4, пространственное и временное разрешение микродиализных зондов может не быть идеальным для нейротрансмиттеров , такие как глутамат, которые жестко регулируется во внеклеточном пространстве 5, 6. Из-за последних достижений в области генетики и визуализации, существуют дополнительные методы , которые могут быть использованы для сопоставления глутамата в естественных условиях. Используя генетически кодируемые флуоресцентные репортер глутамата (iGluSnFR)д двухфотонного визуализации, исследователи способны визуализировать высвобождение глутамата нейронов и астроцитов в пробирке и в естественных условиях 7, 8, 9. В частности, это позволяет для записи с большим полем зрения и не нарушать внутренние соединения мозга. Несмотря на то, что эти новые оптические методы позволяют для визуализации кинетики глутамата и измерения сенсорных вызванных реакций и активности нейронов, они не имеют возможности определить количество глутамата в межклеточном пространстве в отдельных областях мозга.

Альтернативный метод представляет собой связанный с ферментом микроэлектрода массива (MEA), который может селективно измерять уровни внеклеточной нейротрансмиттеров, таких как глутамат, за счет использования самостоятельной привязкой схемы записи. Методика MEA была использована для изучения изменений в внеклеточном глутамате следующих травматическим мозгатравмы 10, 11, 12, старение 13, 14, стресс 15, 16, эпилепсия 17, 18, болезнь Альцгеймера 19, 20, а также инъекций вирусной мимической 21 и представляет собой улучшение по сравнению пространственных и временных ограничений , присущих микродиализ. В то время как микродиализ ограничивает возможность измерения вблизи синапса 22, 23, МЭС имеет высокое пространственное разрешение , которая позволяет селективные меры внеклеточного глутамата перелива вблизи синапсам 24, 25. Во-вторых, низкое временное разрешение микродиализом (1 - 20 мин) ограничивает возможность исследоватьбыстрая динамика высвобождения глутамата и зазор , происходящая в миллисекундах до второго диапазона 26. Из-за различий в освобождении или клиренс глутамата не может быть очевидным в мерах тоника, покоящихся уровни глутамата, может иметь важное значение, что высвобождение глутамата и зазор быть непосредственно измерены. МЭС допускает такие меры в связи с их высоким временным разрешением (2 Гц) и низкими пределами обнаружения (<1 мкМ). В-третий, МЭС позволяет на рассмотрение субрегиональных вариаций в нейротрансмиттер в пределах конкретного региона мозга, такие как крысы или мыши гиппокамп. Например, с помощью МЭС мы можем отдельно целевой зубчатой извилине (DG), Cornu ammonis 3 (СА3) и CORNU ammonis 1 (CA1) гиппокампа, которые соединены с помощью trisynaptic схемы 27, чтобы изучить субрегиональные различия в внеклеточного глутамата. Из - за размера микродиализные зондов (1 - длина 4 мм) и ущерб , причиненный имплантации 28 </ SUP>, 29, субрегиональные различия трудно решить. Кроме того, оптические системы только позволяют стимуляции с помощью внешних стимулов, таких как стимуляция усов или легкого мерцания, который не допускает субрегиональной стимуляцию 7. Окончательное преимущество МЭС по сравнению с другими методами является возможность изучения этих подобластей в естественных условиях , не нарушая их внешних и внутренних связей.

Здесь мы опишем , как система записи (например, FAST16mkIII) в сочетании с МЭС, состоящая из керамического на основе мультисайтового микроэлектрода, может быть по- разному покрытие на участках записи , чтобы позволить вмешательство агентов , которые будет обнаружена и удалено из сигнала анализируемого вещества. Мы также демонстрируем эти массивы могут быть использованы для Амперометрии на основе исследований в естественных условиях регулирования глутамата в пределах DG, СА3 и СА1 гиппокампа подобластей наркоза RTG (TauP301L) 4510 мышей, обычно используемый мУзы модель болезни Альцгеймера. Кроме того, мы обеспечиваем подтверждение чувствительности системы MEA к быстрой динамики высвобождения глутамата и очистки путем обработки мышей с рилузолом, препарат показано в пробирке , чтобы уменьшить высвобождение глутамата и увеличить поглощение глютамата 30, 31, 32, 33, и демонстрация этих соответствующих изменений в естественных условиях в модели мыши TauP301L.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Покрытие микроэлектрода массива с помощью ферментов или матричного слоя

  1. Подготовка матричного белка раствор
    1. Взвесить 10 мг бычьего сывороточного альбумина (BSA) и переносят в 1,5 мл микроцентрифужных трубки.
    2. Добавить 985 мкл деионизованной воды в микроцентрифужных пробирку, содержащую БСА. Смешайте раствор путем ручного перемешивания (ре-пипеткой с помощью 1000 мкл пипетки ~ 3 раз, до тех пор пока БСА не растворится).
      Примечание: Не используйте завихрения для смешивания раствора, как это может вводить воздух в раствор. Кроме того , установлено пипетку до объема <1000 мкл (например , 700 мкл) , чтобы избежать введения пузырьков воздуха. Раствор может быть помещен в микроцентрифуге, если это необходимо.
    3. После того, как раствор БСА растворяют, добавляют 5 мкл 25% -ного раствора глутарового альдегида. Смешайте раствор путем инвертирования закрытой трубе 3 - 5 раз. Полученный раствор 1% БС с 0,125% глутаральдегидом.
    4. Отложите матричные белка Солуние в течение 5 мин. Решение будет появляться светло-желтого цвета.
  2. Приготовление раствора желаемого фермента (например, глутамат - оксидаза)
    1. Приготовьте раствор глутамата оксидазы путем добавления отфильтрованного ДИ воды к лиофилизированной, очищенный фермент (например, 50 мкл деионизированной воды добавляют к 25 единиц глутамат - оксидазы с получением 0,5 ед / мкл).
      Примечание: аликвоты исходного раствора (например, 1 мкл) и хранить в аликвоты соответствующего размера контейнеров (например, 500 мкл микропробирок) при -20 ° С. Порции могут храниться до 6 месяцев в этих условиях.
    2. Добавить 4 мкл БСА / глутаральдегида раствора в микроцентрифужных аликвоты пробирку, содержащую глутамата оксидазы. Смешайте раствор путем ручного перемешивания (повторного пипеткой с 10 мкл пипетки. Пипетка должна быть установлена ​​в объеме <5 мкл). Полученный раствор 1% БС, 0,125% глутаровый альдегид и 0,1 ед / мкл глутамат-оксидаза.Используйте раствор для нанесения покрытия немедленно.
      Примечание: Глутамат раствор оксидазы покрытия может быть использован только в течение 15 мин. Хотя несколько МЭСА может быть покрыт одним приготовленным раствором, рекомендуются, чтобы не превысить годное к употреблению окна времени для глутамата-оксидазы. Количество электродов, которые могут быть покрыты в течение 15 мин варьироваться. Как правило, от 4 до 6 электродов могут быть покрыты за один раз.
  3. Покрытие MEA
    1. Как правило, слой пара сайта записи (ов) на MEA с желаемым ферментным (глутамат-оксидазы) и другой парой сайта записи (ов) (сайт «сторожевого» (ами)) покрывают неактивного белка-матрицы.
    2. Используйте тупым кончиком Гамильтона микрошприцы (например , 10 мкл) для покрытия МЭС с L-глутамат - оксидазы или неактивным белком раствора матрицы (БСА + глутаральдегида). Процедуры, используемые для фермента или неактивного белка-матричных покрытий являются одинаковыми.
    3. Очистите шприцы до и после использования (3 промывокДеионизированная вода, 3 полоскания с метанолом, 5 полосканий с деионизированной водой).
      Примечание: Выделенные шприцы используются для нанесения слоя фермента (глутамат-оксидаза) или белковой матрицы. Не используйте один и тот же шприц для другого решения. Рекомендуется, чтобы выполнить белок-матричных покрытий до того ферментных покрытий.
    4. Составление глутамата оксидазу или белковой матрицы с помощью шприца 10 мкл Hamilton. Аккуратно нажмите на поршень, чтобы обойтись небольшой шарик раствора на кончик шприца (визуализировали с использованием рассекает микроскопом).
    5. Использование рассекает микроскоп для целевой сайты записи МЭСА, решения применить к соответствующим сайтам записи путем кратковременного контактирования участков записи с помощью капельного раствора / шарика, который представляет собой один слой. Три слоя являются достаточными для обоих белков-матрицы и фермента пальто. Толстые слои могут уменьшить чувствительность СМЭ.
    6. Поднимите капельку раствора прямо вверх и от участков записи (то есть СиринGE наконечник не должен скрести по всей поверхности MEA).
    7. Установите таймер в течение 1 мин. Это минимальное требование времени между нанесением покрытий на сайт (ы) записи. Разрешить МЭС ферментного покрытия для отверждения при температуре 4 ° С в течение 5-7 дней.
    8. Запишите количество нанесенных слоев, сколько времени потребовалось, чтобы применить покрытия, количество электродов, а также имя и дату в лаборатории ноутбука.

2. гальванических с м-фенилендиамин для улучшенной селективностью

  1. Подготовка м-фенилендиамин дигидрохлорид раствор (МПД)
    Примечание: пластина исключения слой, ПДС, чтобы предотвратить окисление допамина и других крупных молекул, interferent (например, аскорбиновая кислота), тем самым улучшая селективность датчика для глутамата / H 2 O 2 по сравнению с другими потенциально-interferent молекул.
    1. Мера 50 мл 0,05 М фосфатно-буферного солевого раствора (PBS) в мерной колбе и переносят 50 мл 0,05М PBS к большей (150 мл) колбе Эрленмейера.
    2. Используя трубку , соединенную с баком азота (например, с использованием трубки соединен с эжектором давления), присоединить наконечник пипетки (например , Р200 наконечник) к открытому концу трубы. Поместите трубку с прикрепленным наконечником пипетки в растворе PBS и покрывает раствор свободно с парафином. Включите азот и осторожно раствор пузырьков в течение 20 мин.
    3. Взвесить 0,045 г MPD.
      Внимание: МУР есть потенциально канцерогенное вещество. Взвешивание MPD должна быть выполнена с использованием шкалы, содержащейся в вытяжном шкафу. Надевайте перчатки и маску при использовании MPD. Убедитесь, что капот является функциональным, и что створка вытягивается к соответствующему рабочему уровню. Сразу чистые поверхности, которые могут быть загрязнены с MPD, чтобы избежать постоянного окрашивания.
    4. После того, как кипящий, передать все MPD в дегазировали растворе PBS. Накройте отверстие колбы с парафином и нежно вихревой раствором, чтобы растворить MPD в растворе. Избегайте aggressivе смешивание или использование вихря, как это может ввести газы в раствор.
    5. Передача раствора в химический стакан 50 мл. Бар размешать не нужно.
  2. Гальванический электрод
    1. Получить электрод сравнения. Используйте опорные электроды, посвященные мФД металлизации только. Использование другого электрода сравнения для процедур калибровки.
    2. Поместите пластиковый кронштейн держателя электрода сравнения через стакан. Проверить наличие пузырьков воздуха в опорном стеклянном электроде (не может быть в состоянии увидеть). Осторожно вылить дистальный конец опорного электрода, чтобы удалить пузырьки воздуха в наконечнике.
    3. Поместите эталонный электрод через отверстие в пластиковой руке и ниже в химический стакан, содержащий PBS. Убедитесь, что эталонный электрод не контактирует с нижней частью стакана.
    4. Подключение эталонного электрода к headstage (например , 2 пА / мВ) и подключение (например , разъем DIP) МЭС быть мФД пластиныд к headstage.
    5. Опустить MEA в раствор химического стакана таким образом, что только кончик МЭСА погруженный в растворе. Не погрузить кончики MEA в жидкости за пределами черного «пузырь» (расположенный над кончиком MEA черной изоляции). Это может привести к повреждению MEA.
    6. Выполнить калибровку «испытательную», чтобы проверить функциональность электродных каналов и подключения к headstage.
      Примечание: Хотя аппаратные настройки должны отражать оборудование используются, детали относящихся к анализируемой interferent типа / и концентрации не должны быть введены для калибровки «тест». Режим перекодировки должен быть «Амперометрия» и «V-прикладная» должна быть -0,7 В. Проверьте типичную запись для всех каналов.
    7. Отменить выбрав «Отмена», если подключение всех сайтов записи проверяется. Не нужно, чтобы сохранить данные калибровки.
    8. Выберите значок «Гальваника» на рабочем столе. Гальванических ДляПоявится меню ола. Проверьте правильность настройки введены:
      Амплитуда PP: 0,25
      Смещение: -0.5
      Частота: 0,05
      Продолжительность (мин): 20
    9. Нажмите кнопку «пауза», чтобы начать обшивку. Прошедшее поле времени следует начинать отсчет.
    10. После завершения (все время, прошедшее с), выберите «другой MEA» в появившемся меню, чтобы начать мФД покрытие дополнительно MEA. Заменить гальванический МЭС с MEA, чтобы быть мФД высевал и повторить процедуру гальванизации с помощью инструмента гальваностегии.
      Примечание: Рекомендуется использовать приготовленный раствор MPD не более чем в 2 раза или в течение периода времени 1 ч. Приготовить свежий раствор, чтобы подготовить более 2 МЭС.
    11. Выберите «выездное программное обеспечение», чтобы закончить гальваник. Промыть MPD-пластинчатые электродные наконечники с деионизированной водой (чтобы избежать солевого остатка) и магазина (24 ч) перед калибровкой.
    12. Удалите эталонный электрод из раствора и промыть деионизированной водой перед помещением в соответствующие Storage раствор (например , 3 М NaCl). Убедитесь, что кончик электрода сравнения погружен в раствор. Медленно опустить стекло опорный электрод в раствор, чтобы не повредить стекло.
    13. Утилизацию раствора MPD в соответствующим образом маркированный контейнер опасных отходов.

3. Калибровка МЭС для обнаружения глутамата и селективностью (Рисунок 1) 21

  1. Подготовка решений, необходимых для калибровки.
    Примечание: Обратитесь к Таблице 1.
  2. Выполните калибровку при постоянном перемешивании (магнитная мешалка батарейках) при 37 ° С. Включите грелку или циркулирующие водяную баню и получить небольшую мешалку. Перемешать медленно, но достаточно быстро, что, когда прибавление делается (ниже), новое плато достигается быстро.
  3. Подключение headstage (2 пА / мВ) к системе управления записью и вставить наконечник MEA в 40 мл перемешиваемой 0,05 М PBS (используйте химический стакан 50 мл).
  4. Подключение гправочник электрода. Флик конца, чтобы убедиться в отсутствии воздушных пузырьков.
  5. Откройте программу для записи и нажмите кнопку «Калибровка». Убедитесь в правильности настроек (проверьте, что дозорные выбраны, так как это может измениться с различными электродами), выберите номер MEA и нажмите кнопку «Пуск».
  6. Разрешить 5 - 10 мин для уравновешивания; начинают после того, как базовая линия стабилизировалась (<0,004 нА / мин) изменения.
  7. Выберите «базовый» и добавьте 500 мкл 20 мМ аскорбиновой кислоты (interferent конечна [250 мкМ]) и выбрать «Interferent» (АА рассматривать как мозга шириной interferent) после того, как ток достигает нового, стабильного плато, если Любые. Разрешить 0,5 - 1 мин между добавками. Если MEA правильно гальваническим, не должно наблюдаться почти никаких изменений.
  8. Добавьте 40 мкл 20 мМ L-глутамата (конечная [20 мкМ]) , и после того , как ток достигает нового, стабильного плато, знак 1 - е дополнение «аналит». Повторите три раза в общей сложности 3 glutamatе дополнения.
  9. Добавить 40 мкл DA. Не выбирайте «аналит»; выберите «тестируемое вещество» - DA может быть только interferent в областях, содержащих DA.
  10. Добавить 40 мкл перекисью. Не выбирайте «аналит»; выберите «Test субстанцию».
  11. Нажмите на кнопку «Стоп», когда калибровка закончена.
  12. Для определения функциональности MEA, выберите вкладку расчета и записать следующие параметры в лаборатории ноутбука.
    1. Для конструкции MEA (3000 мкм 2) , используемой в этих калибровках, использовать моноэтаноламин с наклоном ≥ 0,004 нА / мкМ , но более низкие склоны могут быть использованы для некоторых экспериментов. Если есть меньше, чем 10% разница в склоне между ферментным покрытием и без покрытия сайтов, а затем использовать этот МЭС для выпуска только вызывали или чистый / выбросить МЭС.
    2. Использование предела обнаружения (LOD) ≤ 1,5 мкМ. Если УД больше, чем 1,5 мкМ, а затем использовать этот МЭС для вызванных локализуйтее и поглощение только. Не использовать эти электроды для записи уровней тонизирующих.
    3. Используйте селективность для требуемого анализируемого вещества (например, глутамат) над interferent из> 20 условных единиц. Если селективность меньше, чем 20, то чистый / выбросить МЭС.
    4. Используйте линейность (R 2) калибровочной кривой ≥ 0,90. Если линейность меньше, чем 0,90, то чистый или отбрасывать MEA.
  13. Сохраните файл с # СМЭ, дата и инициалы лица калибрования.

4. Сборка микропипетки

Примечание: Микропипетки (капиллярные стекла) должны иметь наконечник с внутренним диаметром 10 - 15 мкм.

  1. Поместите микропипетки централизованно среди всех сайтов записи четыре платины и смонтировать 50-100 мкм выше СМЭ с помощью липкой воск и моделирования глины.
  2. Чтобы загрузить микропипетки, используйте 1 мл шприц, заполненный глутамата или раствором KCl, 0,22 мкм стерильный шприц Filteг, и длинный 97 мм, 28-го калибра пипетку наполнитель, засыпки микропипетки. То есть, вставить иглу в верхней части микропипетки и заполнить в нижней части микропипетки (конец к MEA), убедившись, что там нет пузырьков.
  3. Приложить микропипетки к системе выброса давления при 2 - 20 фунтов на квадратный дюйм в течение примерно 1 с.

5. Пластина Миниатюрный Электрод для In Vivo использования

  1. Приготовьте раствор металлизации (50 г NaCl / 90 мл 1 М HCl в 100 мл химический стакан (гальваническую ванну)) и вырезать ванну электрода (~ 10 см длина платины (Pt) провод (~ 0.02" диаметр)).
  2. Вырезать 10 - 15 см в длину кусок тефлонового покрытия серебряной проволоки (0,008" голой) и использовать лезвие, чтобы соскоблить ~-см тефлонового покрытия от каждого конца конца серебряной проволоки.
  3. Припой золотой штифт на одном конце и поместите один конец открытой серебряной проволоки в гальваническую ванну.
  4. Использование адаптера постоянного тока (используйте только адаптер постоянного тока, имеющий выход ~ 9 -. 15 В постоянного тока макс),зажим «красный» (+) провод к подготовленному серебра проволоки (электрода сравнения) на стороне золота выводами. Зажим «черный» (-) провод к Pt ванны катода.
  5. Подключите адаптер питания постоянного тока. Посмотрите на правильный процесс нанесения покрытия - пузырьки должны появиться в ванне электрода; эталонный электрод превращает серебро / серый цвет.
    ВНИМАНИЕ: Не включайте провода [черный (-) против красный (+)] - покрытие ванны будет разрушена , если это происходит , и свежее покрытие решение нужно будет сделать. Плохое решение будет желтеть в цвете: НЕ ИСПОЛЬЗОВАТЬ!
    Примечание: реакция металлизации занимает 2-5 мин , как правило: Ag 0 + Cl - → AgCl + е -
  6. Проверка электрода сравнения.
    1. Установите мультиметр на 100 - настройка мВ постоянного тока 200.
    2. Поместите точку отсчета (то есть, предварительно протестирован электрод, как известен, работают) эталонный электрод в 3 М NaCl и испытание против вновь плакированного электрода сравнения.
      Примечание: Если насING новый электрод сравнения, замочить в 3 М NaCl перед использованием (12 ч рекомендуется).
    3. Поместите «красный» (+) вывод на золотой штифт опорного электрода, подлежащего испытанию. Поместите «черный» (-) вывод на эталонный электрод. Допустимый диапазон считывания составляет ± 10 мВ. 0 мВ идеально подходит через 2 опорных электродов.

Хирургия 6. Общие для животных MEA Recordings

  1. Подготовка к операции
    1. Поместите хирургии инструменты дезинфицирующей ночи.
    2. Удалите инструменты из дезинфицирующих и тщательно промыть и поместить средства на стерильную хирургии площадки. Получить грелку.
    3. Калибровка два электрода и прикрепить микропипетки, как описано в процедурах 3 и 4.
    4. Сделать электрод сравнения, как описано в разделе 5.
    5. Сделать 200 мкМ глютамата и 70 мМ KCl. Обратитесь к таблице 1,
    6. Получить животное и записать его вес на хирургии листов.
    7. Подготовка анестезии и включите грелку.
  2. Выполните MEA операцию
    1. Использование изофлурана (4% поток в кислороде), анестезия животного в индукционной камере до тех пор, пока частота дыхания значительно снизилась, и животное не реагирует на палец ногу или хвост шнур. Запись частота дыхания и температура тела каждые 15 мин.
    2. Поместите животное в стереотаксическом устройстве с использованием стержней уха, чтобы стабилизировать голова. Убедитесь, что животное является безопасным и голова не двигается. Опустить поток изофлуран до 1,5 - 3% в кислороде. Убедитесь, что грелка правильно расположена под животным и установить до 37 ° С, чтобы обеспечить дополнительное тепло. Неспособность обеспечить дополнительное тепло может привести к глубокой гипотермии и преждевременной смерти животного.
    3. Нанести глазную мазь с использованием стерильным ватным аппликатором и запишите частоту дыхания итемпература тела. Использование батареек триммера, брить верхнюю часть головы. Используйте небольшие хирургические ножницы, чтобы удалить шерсть возле ушей.
    4. На данный момент, надеть стерильные перчатки хирургии. Применение йода, а затем спирт (три раза) на кожу головы.
    5. Используя скальпель, сделайте надрез прямо по центру головы и распространяется на кожу с помощью быка собаки хомутов. Возьмите стерильный наконечник хлопка, чтобы впитывать кровь. Используйте перекись водорода, чтобы облегчить появление темени и лямбда.
    6. Проверьте, что головка правильно расположена путем измерения D / V и M / L координаты темени и лямбда. Координатные изменения должны быть равны нулю, если голова находится на ровной плоскости. Отрегулируйте бары головы и уха, как необходимо обеспечить плоскую плоскость.
    7. Найти брегмы и обнулить координаты. Используя нужные координаты, перемещение влево и вправо, и сделать отметку с помощью перманентного маркера. Использование cauterizer / маркер, сделайте большой квадрат вокруг отметки с достаточно места, чтобы выйти втребуемая область.
    8. Используя стерильный ротационный инструмент, сверлить вокруг квадратного знака. Впитать кровь с помощью стерильного ватного аппликатора. Тщательно продезинфицировать сверло перед каждым использованием.
    9. Приложить МЭС к headstage и засыпки пипетки с первым раствором желаемым. Обязательно оставляйте зазор в пипетку без раствора, так что может быть рассмотрено решение высылки. Присоединить трубку к стеклянной микропипетке.
    10. Включите резервуар азота и эжектора давления (фунтов на квадратный дюйм = 5, время = 0,6 сек). Test (нажмите ручную красная кнопка), чтобы обеспечить пипетку не засорена перед началом.
    11. Калибровка микропипетки. Начало в 0 на визире и поместите кусок синей ленты на headstage, чтобы указать начальную точку. Включите цифровое считывающее устройство и сбросить его к нулю. Спуститесь 1 мм (DV) и подсчитать количество тиков раствор переместился на визира. 10 тиков должен быть равен 1 мм (1 мм = 250 нл), так что 1 тик = 25 нл.
    12. Поместите эталонный электрод вудаленное место из СМЭ, так что он все еще находится в жидком контакте с мозгом, чтобы завершить контур.
    13. Найти брегму с MEA присоединенного и обнуление цифрового читателя. Перемещение MEA до нужных координат. Медленно опустите MEA пока кончик не коснется мозга. Обнуление DV координат и медленно опустите MEA в мозг.
    14. На записи программы, нажмите на желаемом калиброванный электроде, а затем нажмите кнопку «Выполнить эксперимент.» После этого система начнет запись тонических уровней для аналита, а наркоз животного.
    15. Увеличение к оси, которая поможет в наблюдении за базовую линию и позволить электрод к исходному уровню в течение 20 - 45 мин.
    16. После того, как базовая линия является стабильной, установить эжектор давления до .6 с до 5 фунтов на квадратный дюйм и нажмите на красную кнопку эжектора давления, чтобы извлечь. Регистрируют время и давление, а также объем / тиков перемещается на инъекции листа (рисунок 2). Сделайте примечание, которые необходимы (например,большие пики, разведение эффекты, засорение пипетка, шумная базовая / о-сфера применение).
    17. Для глутаматных инъекций, подождать 3 - 5 мин между инъекциями. Для KCl инъекций подождать 1 - 2 мин между инъекциями. Вводят с использованием того же давления и времени, по крайней мере в 3 раза. Изменение времени и повторить. Старайтесь не менять давление, если микропипетка не засорен.
    18. Если микропипетка засорен, увеличивают давление до 30 фунтов на квадратный дюйм.
    19. Запись от желаемых областей мозга, повторяя на обеих сторонах мозга, используя различные решения. Запись базовой линии в каждом новом регионе в течение 20 мин.
    20. Возьмите MEA с микропипеткой прилагается, промыть дистиллированную воду и замочить в PBS в течение ночи, пока вся кровь не исчезнет.
    21. Эвтаназии животное и сохранить мозг в предварительно меченных трубы и хранить в -80 ° C морозильнике или держать одну сторону для фиксации. Для того, чтобы усыпить животное, передозировка с изофлуран (ингаляции). Выполните обезглавливание с помощью хирургических ножниц и рассекать из желаемых областей.

7. Очистка с покрытием МЭС после использования

  1. Не следует чистить МЭС, если не используется. Если есть пух или пыль на поверхности, чистый метанол и дайте высохнуть в течение 24 часов перед нанесением покрытия.
  2. Включите водяную баню (80 ° C) и замочить кончик MEA в течение 30 мин. Тщательно протереть наконечник электрода с наконечником аппликатора хлопка, чтобы удалить твердые частицы, которые могут быть оставлены на кончике электрода. Не получить черную «изоляционную часть» СМЭ мокрой.
  3. Используя три различных ультразвуковые, замочить кончик МЭС (1) Citrisolv, коммерчески растворитель и очищающее средство (2) изопропил, и (3) DI воды в течение 5 мин. Тщательно протереть наконечник электрода с наконечником аппликатора хлопка, чтобы удалить твердые частицы, которые могут быть оставлены на кончике электрода.
  4. Изучите советы под рассекает микроскоп, чтобы гарантировать, что слои были успешно удалены.

8. Анализ

  1. Для анализа данных,первый экспортировать нужный эксперимент дважды щелкнув готовый эксперимент и выберите «Экспорт данных» из выпадающего меню файла.
  2. Сохранить данные в нужном месте файла и открыть программу анализа. Нажмите кнопку «Открыть» в программе анализа и выберите недавно сохраненный файл.
  3. Дайте программу несколько минут, чтобы загрузить файл, а затем проверить эксперимент на вкладке маркеров событий. При выходе, установите флажки для нужных параметров. Так , например, базовой линии, амплитуда, площадь пика (площадь под кривой), T подъема и T 80.
  4. Нажмите кнопку Refresh, а затем проанализировать, чтобы экспортировать данные в электронную таблицу (это может занять несколько минут). Программа даст подсказку, чтобы сохранить файл в нужном месте. После сохранения файла можно редактировать в таблице.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Несмотря на то, что эта технология может быть использована для измерения изменений в глутаматэргических сигнализациях во многих видах животных моделей, такие как черепно-мозговой травма, старение, стресс и эпилепсии, здесь мы покажем, как технология MEA может быть использована для изучения глутаматергических изменений в модели трансгенной мыши человеческой таупатии 19, 20. РТГ (TauP301L) 4510 мыши выражает мутацию P301L в тау, св...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Методика позволяет МЭС для измерения быстрой кинетики высвобождения нейротрансмиттеров и поглощения в пробирке и в естественных условиях. Таким образом, технология производит широкий спектр выходных данных, включая уровни нейромедиаторов тонизирующих, вызывали высвобождение нейротрансмиттеров и клиренс нейромедиаторов. Однако, поскольку использование МПС является относительно сложной процедурой, существует множество факторов, которые, возможно, должны быть оптимизированы для успешного использования. На...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

GG является единственным собственником Quanteon, LLC, которая делает FAST-16 систему записи, используемую для измерения глутамата в данном исследовании. JEQ является платным консультантом Quanteon.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана Национальным институтом общих медицинских наук (НРД; U54GM104942), NIA (НРД; R15AG045812), Ассоциации Альцгеймера (МНР; NIRG-12-242187), WVU факультет Исследовательского Сенатской Гранта (НРД) и WVU PSCOR Гранта (МНР).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
FAST-16mkIII-8 канальныйQuanteon16mkIII
Микроэлектродные матрицыCenMetW4 или 8-TRK
Бычья сыворотка Альбумин (BSA)Sigma-AldrichA-305910 г (срок годности через 1 месяц)
ГлутаральдегидSigma-AldrichG-6257100 мл (срок годности 6 месяцев)
ГлутаматоксидазаUS Biological или Sigma AldrichG4001-01 или 10064650 UI (истекает через 6 месяцев)
Шприцы HamiltonHamilton#803832 шприца
МетанолBDHUN12304 л
m-фенилендиамина дигидрохлорид (мФД)ACROS Organics133056025025 г
Электроды сравнения (RE-5B)BASMF-20793 электрода
Питание от батареи Магнитный пластина для перемешиванияCole-parmerEW-04804-01Можно приобрести у разных поставщиков
ГлутаматSigma-AldrichG-1626100 г
Аскорбиновая кислотаTCI50-81-7500 г
Дофамина гидрохлоридАльфа Аэсар62-31-75 г
Хлорная кислотаVWRUN2920500 мл
Постассиум хлоридVWR7447-40-71 кг
натрия хлоридаVWR7647-40-71 кг
кальция хлоридаMP153502100 г
натрия гидроксидаBDH1310732500 г
Стеклянные пипетки под давлениемCenMet
Клейкий воскKerrlab625Можно приобрести у разных поставщиков
МикрошприцWorld Precision InstrumentsMF28G-5
Пластилин для лепкиWalMartМожно приобрести у разных поставщиков
Picospritzer IIIParker
Silver wireAM systems# 786500
Соляная кислотаBDH76470102,5 л
Платиновая проволокаAM Systems778000
ПаяльникLowes или Home DepotМожно приобрести у разных поставщиков
МультиметрWalMartМожно приобрести у разных поставщиков
PhysioSuiteKent ScientificМожно приобрести у разных поставщиков
SomnoSuiteKent ScientificМожно приобрести у разных поставщиков
Стереотаксическое устройствоStoeltingМожно купить у разных поставщиков
Digital Lab StandardStoeltingМожно приобрести у разных поставщиков
Meiji EMZ микроскопMeijiEMZ-5
DrillDremelMicro
MetricideMetrex102800
ScalpelVWRМожно купить у другого поставщика
Хирургические ножницыVWRМожно приобрести у разных поставщиков
Стерильные ватные тампоныPuritan25806Можно приобрести у разных поставщиков
Глазную мазьPuralube Vet OintmentПолучить у ветеринара
Йодные тампоныVWRS48050Можно приобрести у разных поставщиков
Спиртовые тампоныМестная аптекаМожно приобрести у разных поставщиков
Стерильная хирургическая простыняDynarex4410Можно приобрести у разных поставщиков
Стерильный физиологический растворTeknovaS5815Можно сделать собственный раствор с помощью фильтров
Перекись водорода (3%)Местная аптекаМожно приобрести у разных поставщиков
ГрелкаWalMartМожно приобрести у разных поставщик

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bito, L., Davson, H., Levin, E., Murray, M., Snider, N. The concentrations of free amino acids and other electrolytes in cerebrospinal fluid, in vivo dialysate of brain, and blood plasma of the dog. J Neurochem. 13 (11), 1057-1067 (1966).
  2. Cavus, I., et al. Extracellular metabolites in the cortex and hippocampus of epileptic patients. Ann Neurol. 57 (2), 226-235 (2005).
  3. Montgomery, A. J., Lingford-Hughes, A. R., Egerton, A., Nutt, D. J., Grasby, P. M. The effect of nicotine on striatal dopamine release in man: A [11C]raclopride PET study. Synapse. 61 (8), 637-645 (2007).
  4. Chefer, V. I., Thompson, A. C., Zapata, A., Shippenberg, T. S. Overview of brain microdialysis. Curr Protoc Neurosci. , Chapter 7 Unit 7.1 (2009).
  5. Hu, S., Sheng, W. S., Ehrlich, L. C., Peterson, P. K., Chao, C. C. Cytokine effects on glutamate uptake by human astrocytes. Neuroimmunomodulation. 7 (3), 153-159 (2000).
  6. He, X., et al. The association between CCL2 polymorphisms and drug-resistant epilepsy in Chinese children. Epileptic Disord. 15 (3), 272-277 (2013).
  7. Xie, Y., et al. Resolution of High-Frequency Mesoscale Intracortical Maps Using the Genetically Encoded Glutamate Sensor iGluSnFR. J Neurosci. 36 (4), 1261-1272 (2016).
  8. Marvin, J. S., et al. An optimized fluorescent probe for visualizing glutamate neurotransmission. Nat Methods. 10 (2), 162-170 (2013).
  9. Hefendehl, J. K., et al. Mapping synaptic glutamate transporter dysfunction in vivo to regions surrounding Abeta plaques by iGluSnFR two-photon imaging. Nat Commun. 7, 13441(2016).
  10. Hinzman, J. M., Thomas, T. C., Quintero, J. E., Gerhardt, G. A., Lifshitz, J. Disruptions in the regulation of extracellular glutamate by neurons and glia in the rat striatum two days after diffuse brain injury. J Neurotrauma. 29 (6), 1197-1208 (2012).
  11. Thomas, T. C., Hinzman, J. M., Gerhardt, G. A., Lifshitz, J. Hypersensitive glutamate signaling correlates with the development of late-onset behavioral morbidity in diffuse brain-injured circuitry. J Neurotrauma. 29 (2), Epub 2011 Dec 2011 187-200 (2011).
  12. Hinzman, J. M., et al. Diffuse brain injury elevates tonic glutamate levels and potassium-evoked glutamate release in discrete brain regions at two days post-injury: an enzyme-based microelectrode array study. J Neurotrauma. 27 (5), 889-899 (2010).
  13. Stephens, M. L., Quintero, J. E., Pomerleau, F., Huettl, P., Gerhardt, G. A. Age-related changes in glutamate release in the CA3 and dentate gyrus of the rat hippocampus. Neurobiol Aging. 32 (5), Epub 2009 Jun 2017 811-820 (2009).
  14. Nickell, J., Salvatore, M. F., Pomerleau, F., Apparsundaram, S., Gerhardt, G. A. Reduced plasma membrane surface expression of GLAST mediates decreased glutamate regulation in the aged striatum. Neurobiol Aging. 28 (11), 1737-1748 (2006).
  15. Hascup, E. R., et al. An allosteric modulator of metabotropic glutamate receptors (mGluR(2) ) (+)-TFMPIP, inhibits restraint stress-induced phasic glutamate release in rat prefrontal cortex. J Neurochem. 122 (2), Epub 02012 Jun 07713 619-627 (2012).
  16. Rutherford, E. C., Pomerleau, F., Huettl, P., Stromberg, I., Gerhardt, G. A. Chronic second-by-second measures of L-glutamate in the central nervous system of freely moving rats. J Neurochem. 102 (3), 712-722 (2007).
  17. Matveeva, E. A., et al. Reduction of vesicle-associated membrane protein 2 expression leads to a kindling-resistant phenotype in a murine model of epilepsy. Neuroscience. 202, Epub 2011 Dec 2013 77-86 (2011).
  18. Matveeva, E. A., et al. Kindling-induced asymmetric accumulation of hippocampal 7S SNARE complexes correlates with enhanced glutamate release. Epilepsia. 53 (1), Epub 02011 Dec 0334 157-167 (2012).
  19. Hunsberger, H. C., Rudy, C. C., Batten, S. R., Gerhardt, G. A., Reed, M. N. P301L tau expression affects glutamate release and clearance in the hippocampal trisynaptic pathway. J Neurochem. 132 (2), 169-182 (2015).
  20. Hunsberger, H. C., et al. Riluzole rescues glutamate alterations, cognitive deficits, and tau pathology associated with P301L tau expression. J Neurochem. 135 (2), 381-394 (2015).
  21. Hunsberger, H. C., et al. Peripherally restricted viral challenge elevates extracellular glutamate and enhances synaptic transmission in the hippocampus. J Neurochem. , (2016).
  22. Obrenovitch, T. P., Urenjak, J., Zilkha, E., Jay, T. M. Excitotoxicity in neurological disorders--the glutamate paradox. Int J Dev Neurosci. 18 (2-3), 281-287 (2000).
  23. Hillered, L., Vespa, P. M., Hovda, D. A. Translational neurochemical research in acute human brain injury: the current status and potential future for cerebral microdialysis. J Neurotrauma. 22 (1), 3-41 (2005).
  24. Burmeister, J. J., Gerhardt, G. A. Self-referencing ceramic-based multisite microelectrodes for the detection and elimination of interferences from the measurement of L-glutamate and other analytes. Anal Chem. 73 (5), 1037-1042 (2001).
  25. Burmeister, J. J., et al. Improved ceramic-based multisite microelectrode for rapid measurements of L-glutamate in the CNS. J Neurosci Methods. 119 (2), 163-171 (2002).
  26. Diamond, J. S. Deriving the glutamate clearance time course from transporter currents in CA1 hippocampal astrocytes: transmitter uptake gets faster during development. J Neurosci. 25 (11), 2906-2916 (2005).
  27. Greene, J. G., Borges, K., Dingledine, R. Quantitative transcriptional neuroanatomy of the rat hippocampus: evidence for wide-ranging, pathway-specific heterogeneity among three principal cell layers. Hippocampus. 19 (3), 253-264 (2009).
  28. Borland, L. M., Shi, G., Yang, H., Michael, A. C. Voltammetric study of extracellular dopamine near microdialysis probes acutely implanted in the striatum of the anesthetized rat. J Neurosci Methods. 146 (2), Epub 2005 Mar 2005 149-158 (2005).
  29. Jaquins-Gerstl, A., Michael, A. C. Comparison of the brain penetration injury associated with microdialysis and voltammetry. J Neurosci Methods. 183 (2), Epub 2009 Jun 2025 127-135 (2009).
  30. Azbill, R. D., Mu, X., Springer, J. E. Riluzole increases high-affinity glutamate uptake in rat spinal cord synaptosomes. Brain Res. 871 (2), 175-180 (2000).
  31. Gourley, S. L., Espitia, J. W., Sanacora, G., Taylor, J. R. Antidepressant-like properties of oral riluzole and utility of incentive disengagement models of depression in mice. Psychopharmacology (Berl). 219 (3), Epub 2011 Jul 2021 805-814 (2011).
  32. Frizzo, M. E., Dall'Onder, L. P., Dalcin, K. B., Souza, D. O. Riluzole enhances glutamate uptake in rat astrocyte cultures). Cell Mol Neurobiol. 24 (1), 123-128 (2004).
  33. Fumagalli, E., Funicello, M., Rauen, T., Gobbi, M., Mennini, T. Riluzole enhances the activity of glutamate transporters GLAST, GLT1 and EAAC1. Eur J Pharmacol. 578 (2-3), Epub 2007 Oct 2025 171-176 (2008).
  34. Day, B. K., Pomerleau, F., Burmeister, J. J., Huettl, P., Gerhardt, G. A. Microelectrode array studies of basal and potassium-evoked release of L-glutamate in the anesthetized rat brain. J Neurochem. 96 (6), Epub 2006 Jan 1625 1626-1635 (2006).
  35. Kane, R. L., Martinez-Lopez, I., DeJoseph, M. R., Vina, J. R., Hawkins, R. A. Na(+)-dependent glutamate transporters EAAT1, EAAT2, and EAAT3) of the blood-brain barrier. J Biol Chem. 274 (45), 31891-31895 (1999).
  36. Ramsden, M., et al. Age-dependent neurofibrillary tangle formation, neuron loss, and memory impairment in a mouse model of human tauopathy (P301L). J Neurosci. 25 (46), 10637-10647 (2005).
  37. Oddo, S., et al. Triple-transgenic model of Alzheimer's disease with plaques and tangles: intracellular Abeta and synaptic dysfunction. Neuron. 39 (3), 409-421 (2003).
  38. Zang, D. W., et al. Magnetic resonance imaging reveals neuronal degeneration in the brainstem of the superoxide dismutase 1 transgenic mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Eur J Neurosci. 20 (7), 1745-1751 (2004).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи