Method Article

Прямолинейный метод глюкозинолатов экстракции и анализа с высоким давлением жидкостной хроматографии (ВЭЖХ)

DOI:

10.3791/55425

⸱

March 15th, 2017

 , 
1German Centre for Integrative Biodiversity Research (iDiv) Halle-Jena-Leipzig, 2Institute of Ecology, Friedrich Schiller University Jena

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы очень подробно описываем установленный и надежный протокол экстракции глюкозинолатов из измельченного растительного сырья. После обработки экстрактов сульфатазой на колонке десульфоглюкозинолаты элюируют и анализируют с помощью жидкостной хроматографии высокого давления.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Глюкозинолаты — это хорошо изученный и очень разнообразный класс природных растительных соединений. Они играют важную роль в устойчивости растений, качестве рапсового масла, пищевом ароматизаторе и здоровье человека. Биологическая активность глюкозинолатов высвобождается при повреждении тканей, когда они смешиваются с ферментом мирозиназой. Это приводит к образованию едких и токсичных продуктов распада, таких как изотиоцианаты и нитрилы. В настоящее время идентифицировано более 130 структурно различных глюкозинолатов. Химическая структура глюкозинолата является важным фактором, определяющим образующийся продукт, который, в свою очередь, определяет его биологическую активность. Последние могут варьироваться от вредных (например, прогоитрин) до полезных (например, глюкорафанин). Каждый вид растений, содержащих глюкозинолаты, имеет свой специфический профиль глюкозинолатов. По этой причине важно правильно идентифицировать и надежно количественно определить различные глюкозинолаты, присутствующие в листьях, семенах и корнеплодах капусты или, для экологических исследований, в их диких родственниках. В этой статье мы представляем хорошо проверенный, целенаправленный и надежный метод анализа профилей глюкозинолатов у широкого спектра видов растений и органов растений. Интактные глюкозинолаты экстрагируются из измельченного растительного сырья с помощью смеси метанола и воды при высоких температурах для отключения активности мирозиназы. После этого полученный экстракт выводят на ионообменную колонну для очистки. После обработки сульфатазой десульфоглюкозинолаты элюируют водой, а элюат подвергается сублимационной сушке. Остаток улавливается в точном объеме воды, который анализируется с помощью жидкостной хроматографии высокого давления (ВЭЖХ) с фотодиодной матрицей (PDA) или ультрафиолетовым (UV) детектором. Обнаружение и количественная оценка достигаются путем проведения сравнений времени удержания и УФ-спектров коммерческих эталонов. Концентрации рассчитываются на основе референсной кривой Синигрина и хорошо установленных коэффициентов отклика. Здесь обсуждаются преимущества и недостатки этого простого метода по сравнению с более быстрыми и технологически продвинутыми методами.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Подсчитано , что растения производят более 200000 различных типов химических соединений 1. Только меньшинство этих соединений, кажется, играет определенную роль в первичном метаболизме растений ", который роста и размножения видов топлива; большинство из них так называемые вторичные метаболиты. Несмотря на свое название, вторичные метаболиты часто имеют решающее значение для выживания растений и воспроизводства, поскольку они служат для привлечения опылителей или защитить растение от патогенных микроорганизмов и травоядных 1.

Глюкозинолаты представляют собой весьма разнородную класс вторичных метаболитов , которые были изучены в течение более 150 лет 2. На сегодняшний день, более 130 различных структурно глюкосинолаты были идентифицированы 3. В широком смысле, глюкосинолаты могут быть подразделены на различные классы, основанные на аминокислоты, из которых они синтезированы. Индолглюкозинолаты, например, синтезируются из аминокислотытриптофан, в то время как фенилаланин обеспечивает базовый скелет для синтеза ароматических глюкозинолатов 4. Внутри классов, существует высокий уровень структурного разнообразия, которое вызывается путем последовательных стадий удлинения цепи в биосинтетических путей, таких , как в классе алифатических глюкозинолатов, или путем модификации цепи стороне (например, гидроксилирование) 4, 5. Один глюкозинолатов видов растений может содержать до 37 различных глюкозинолатов , принадлежащих к различным структурным классам 6. Несмотря на то, виды растений имеют типичные профили глюкосинолатов, внутривидовая изменчивость для типов глюкозинолатов часто встречается среди лиц и групп населения , 6, 7. Малонарушенные глюкосинолаты хранятся в вакуолях растительных клеток и могут быть найдены в любом надземной или подземной органа 7, <вир класс = "Xref"> 8, 9. После разрыва клеток (например, herbivory), глюкозинолатов высвобождаются и смешивают с ферментом мирозиназой, положив начало масла бомбу 10 горчицу. Из - за активности мирозиназой, и в зависимости от структуры глюкозинолатов, условий реакции, а также наличие модифицирующих ферментов, образуются различные едкие, токсичных или вредных соединений, таких как нитрилы и (МОС) роданиды 11. Продукты реакции имеют высокую биологическую активность; например, они служат в качестве репеллентов от насекомых травоядных общего профиля 12. Наследственность и биосинтетических путей глюкозинолатов хорошо изучены, в основном из - за их важности для травоядных и сопротивления патогена, их значение в качестве компонентов аромата в горчицы и капусты, а также их отрицательные (progoitrin) и положительных (глюкорафанина) воздействие на здоровье человека 5, 13, 14.

Из-за большого интереса к глюкозинолатов как биологически активных соединений, способов экстракции и обнаружения на основе обращенно-фазовой жидкости под высоким давлением хроматографии (ВЭЖХ) , оснащенную ультрафиолетовой (УФ) или массив фотодиод (PDA) детекторы обычно использовались начиная с 1980 - х годов 15 , На основе этого метода, Европейских сообществ выдается стандартный протокол , который был проверены и подтверждены в нескольких лабораториях для анализа глюкозинолатов в масличных культур (Brassica париз, рапсового, канола 16). Другие добавляют к этому методу (например, путем определения дополнительных факторов отклика для глюкозинолатов, которые не присутствуют в рапс) 17. Несмотря на повышение доступности жидкостная хроматография платформ (LC-MS) и протоколов с высокой пропускной способностью для анализа 18 глюкозинолатов , 19, оригинальный метод ВЭЖХ-УФ / КПК до сих пор широко используется учеными. Основные причины, что этот метод является простым, экономически эффективным и относительно доступными для лабораторий без обширной инфраструктуры знаний химико-аналитической. Для того, чтобы служить этому сообществу, мы здесь подробно протокол для экстракции глюкозинолатов из растительных материалов и анализа их desulfo-форм с HPLC-PDA.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовка решений, необходимых для экстракции глюкозинолатов

  1. Приготовьте 500 мл 70% -ного метанола (MeOH) в воде (сверхчистые) в стеклянной бутылке. Для получения 100 образцов и 5 стандартов, 420 мл 70% MeOH требуется.
  2. Готовят 20 мМ ацетата натрия (NaOAc) (рН = 5,5), добавляя 0,82 г NaOAc или 1,36 г NaOAc х 3 H 2 O в 500 мл воды; рН смеси регулируют хлористым водородом (HCl). Храните NaOAc в холодильнике. Для получения 100 образцов и 5 стандартов, 370 мл 20 мМ ацетатом натри (рН = 5,5) в воде необходим.
  3. Для приготовления столбика вещества, смешивают 10 г сшитого декстрана геля (тип G-25) с 125 мл сверхчистой воды. Хранить полученную смесь в холодильнике (4 ° С).
  4. Приготовление раствора сульфатазы
    1. Растворите 10000 единиц арила сульфатазы (тип Н-1 из виноградная улитка) в 30 мл сверхчистой воды и добавляют 30 мл абсолютного этанола (EtOH). Приготовьте раствор хорошо и передать его одному из 250 мл ЕКСtrifuge трубки или несколько более мелких трубок, в зависимости от наличия.
    2. Центрифуга смеси при 2650 х г в течение 20 мин при комнатной температуре (RT). Передача супернатант (ы) в химическом стакане; добавьте 90 мл этанола и перемешать. Центрифуга смеси в одном или более центрифужные пробирки при 1,030 мкг в течение 15 мин при комнатной температуре.
    3. Откажитесь от супернатантов. Растворите и объединить гранул в количестве 25 мл сверхчистой воды. Vortex хорошо, обойтись в 1-мл пробирки, и хранить в морозильной камере при -20 ° C; они будут держать в течение не менее одного года.
  5. Получение эталонного раствора синигрин
    1. Взвешивание около 9 мг синигрин моногидрата с 1 мкг точностью (например, 8,769 мг). Перенесите его в мерную колбу на 10 мл, и растворить синигрин моногидрата в 10,0 мл сверхчистой воды.
    2. Вычислить молярность раствора и подготовить пять ссылок синигрин между 50-750 мкМ путем разбавления исходного раствора. Для подробного примера см Дополнительный файл S1 .
    3. Дозировать различные ссылки синигрин в реакционных трубах 1,5 мл и замораживают их при температуре 20 ° С. Включить серию из пяти синигрин ссылок в каждой партии экстракции. Всегда используйте правильные значения молярности для в настоящее время используется синигрин ссылок при расчете концентраций.

2. Подготовка установки для экстракции

  1. Подготовьте колонку стойку для пипетку Пастера колонн (для подготовки колонн, см шаг 3.1). Этикетка стойки или столбцы для отслеживания числа образцов (см рисунок 1).
  2. Приготовьте крепежного блока одинаковое количество меченых микропробирок 2 мл (этап 3.3 и рисунок 1)

5 / 55425fig1.jpg "/>
Рисунок 1: Стойка для глюкозинолатов добычи. Вид спереди (слева) и вид сверху (справа) самодельной стойки колонки и блок для экстракции глюкозинолатов. Высота: 100 мм, расстояние между отверстиями сдвинуты (для удержания колонны пипетки Пастера): 30 мм (ось х) х 15 мм (ось у). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

3. Подготовка колонн и труб микроцентрифужных

  1. Подготовьте один столбец на образце и пять дополнительных столбцов для пяти синигрин эталонных образцов.
    1. В каждом из стеклянной пипетки поместите кусок стекловаты примерно 1 см х 1 см. Используйте деревянную или стеклянную палочку, чтобы подтолкнуть стекловату вниз до точки, где пипетка сужается. Стекловолокно должно предотвратить материал колонки от работы, но не использовать слишком много, так как это замедляет вымывание колонн. Надевайте перчатки Whан работе с стекловатой.
  2. Поместите колонки на стойку колонке (см рисунок 1). Поместите стойку колонки в лаборатории (лоток отходов), чтобы поймать элюентов, используемые для последовательных промывок столбцов.
  3. Обрежьте первые 5 мм от кончика пластиковой 1-мл пипетки и пипеткой 0,5 мл приготовленного материала колонки (G-25, гель в воде, см шаг 1.3) в каждом столбце. Встряхнуть флакон, содержащий материал колонки задолго до пипеткой. Откажитесь протекающие колонны (G-25 материала истекает через слой стекловаты) и заменить новыми.
    1. После пипетирования столбика вещества в колонки, добавляют 1 мл сверхчистой воды, чтобы смыть вниз материала.
  4. Подготовьте 2 мл реакционной трубки каждой пробы и пять труб для пяти синигрин эталонных образцов; маркировать их. Используйте рассекает иглу, чтобы сделать отверстия в крышках для последующего сублимационной сушки и помещают подготовленные пробирки в блок трубки в точно такой же схеме, что истолбцы (2.2 см Рисунок 1).

4. Добыча глюкозинолатов

  1. Взвесить подвергают сублимационной сушке и тонко измельченный материал растений (обычно 50.0-100.0 мг сухого веса; конечные концентрации глюкозинолатов в экстракте должно быть в диапазоне от эталонной кривой) с точностью до 0,1 мг в 2-мл, меченый, круглый -bottom реакционные трубы. Добавьте две небольшие металлические шарики (3 мм в диаметре), как кипячение, замедлители в каждую пробирку.
    Примечание: Протокол также может быть применен к свежей, быстро замораживали материалов, которые были заточены под жидким азотом и хранили в замороженном виде до экстракции. Увеличение количества материала , взвешивают для экстракции и процент МеОН в экстракционной жидкости до 85% , чтобы компенсировать разбавление водой в материалах 19.
  2. Пипетка 1 мл 70% MeOH в каждую пробирку и вихревые кратко. Закройте пробирки и запечатать их с крышками безопасности перед помещением их как можно быстрее в горячий шАтера ванны (90-92 ° С) в течение нескольких минут (~ 5 мин), до 70% MeOH только закипит. Внимание: Используйте защитные очки во время этого шага!
  3. Поместите пробирки с образцами в ультразвуковой ванне в течение 15 мин. В то же время, возьмите сульфатазы и пять синигрин эталонных образцов из морозильника, чтобы разморозить их при комнатной температуре.
  4. После того, как ультра-озвучивания, центрифугировать пробирки с образцами при 2,700 мкг в лабораторной центрифуге в течение 10 мин при комнатной температуре; гранулы должны образовывать в каждой пробирке. Добавьте к супернатантов меченых колонн и пипеткой пять эталонных образцов на отдельные столбцы.
    1. В то время как пипеткой супернатанты, держать кончик хорошо над таблеткой, чтобы избежать пипеткой растительных материалов. Следует отметить, что при использовании Высушенные пробы, объем супернатанта, будет меньше, чем 1,0 мл.
  5. Добавляют 1 мл 70% MeOH в остальных гранул в пробирок и вихревые трубки перед помещением их в ультразвуковой ванне в течение 15 мин. Центрифуга трубки снова, как в шаге 4.4, и добавьте supernaTants в соответствующих колонках; из-за свойств материала колонки, отрицательно заряженная сульфатную группу из глюкозинолатов будет специально задерживается на колонке.
  6. Вымойте колонки с экстрактами в трех последовательных шагов.
    1. Пипетка 2 х 1 мл 70% MeOH на каждую колонку. Подождите, пока колонки всухую перед добавлением следующего 1 мл; это приведет к удалению более неполярных соединений из экстрактов (например, хлорофилл).
    2. Промыть МеОН добавлением 1 мл сверхчистой воды для каждого столбца.
    3. Пипетка 2 х 1 мл 20 мМ NaOAc буфера для каждого столбца, чтобы создать оптимальные условия для реакции сульфатазы.
  7. Возьмите стойку с колоннами из лотка отходов и высушить ноги стойки с тканью. Поместите стойку над блоком с флаконах и промаркированные пробирки. Убедитесь , что каждый наконечник столбца в соответствующем маркированный, 2-мл трубки (см рисунок 1).
  8. Добавьте 20 мкл сульфатазы Solutiпо столбцам. Убедитесь, что сульфатазы достигает поверхности материала колонки. Внесите 50 мкл NaOAc буфера на каждую колонку, чтобы смыть вниз сульфатазы. Накройте колонны с алюминиевой фольгой и дать постоять в течение ночи.
    Примечание: В связи с деятельностью сульфатазы, сульфатной группы будут удалены, освобождая desulfoglucosinolates из колонки, так что они могут вымывается с водой. Подробное описание приведено в разделе Crocoll и др. 19.
  9. На следующий день, элюции desulfoglucosinolates пипеткой 2 х 0,75 мл сверхчистой воды на каждую колонку. Когда все столбцы иссякли, поднимите стойку колонки и удалить его из реакционных труб.
    1. Трубки закрывают крышками (убедитесь, что имеются отверстия в крышках) и заморозить их в жидком азоте или в -80 ° C морозильнике в течение 30 мин. Замерзание высушить образцы в течение 12-24 часов (в зависимости от количества образцов и мощность лиофильной сушилки), чтобы удалить всю воду.
    10. <литий> После сушки вымораживанием, повторно растворяют остаток в точном объеме (обычно 1,0 мл) сверхчистой воды. Передача образцов и пять синигрин ссылки на меченых ВЭЖХ флаконов. Хранить образцы в холодильнике (4 ° С) в течение до двух недель или морозильной камере (-20 ° C) в течение до одного года, прежде чем анализировать их с помощью ВЭЖХ.
  10. Пусть стеклянные колонки сушат под капотом в течение ночи и расположить их в сухом состоянии. Восстановление металлических шариков из образца труб, используемых в шаге 4.5 для повторного использования и положить трубы в бункер отходов.

5. ВЭЖХ измерения добытых образцов

  1. Отделить глюкозинолатов на обращенной фазой C 18 колонке (4,6 х 150 мм, 3 мкм, 300 А) , с градиентом ацетонитрил-вода (таблица 1) и поток 0,75 мл / мин и температуре колонки 40 ° C , Выполнить обнаружение и количественное определение на 229 нм.
  2. Мера синигрин ссылки на той же колонке, но с адаптированной градиентомСпособ по сокращению использования растворителей (смотри таблицу 2). Начните с инъекционным пять синигрин ссылок, начиная с обращения с наименьшей концентрацией. Затем вводят образцы, в том числе инъекции метанола (пробел) после каждого десятого образца для очистки колонны и предотвратить унос пиков.
Время [мин] Расход [мл / мин] % Вода % B ACN
1 0.750 98 2
35 0.750 65 35
40 0.750 98 2
Температура колонки 40 ° С.

Таблица 1: градиент ацетонитрил-вода для глюкозинолатов разделения и analysiс на обращенно-фазовой ВЭЖХ.

Время [мин] Расход [мл / мин] % Вода % B ACN
1 0.750 98 2
10 0.750 89,3 10.7
11 0.750 98 2
Температура колонки 40 ° С.

Таблица 2: Укороченный градиент ацетонитрил-вода для количественной оценки пяти синигрин ссылок , используемых для количественной оценки глюкозинолатов.

6. глюкозинолатов Идентификация и Количественная

  1. Идентификация
    1. Сравнение УФ-спектров и время удерживания пиков в образцах с коммерчески безрезультатноспособные, чистые ссылки глюкозинолатов. На рисунке 2 примеры УФ - спектров из различных классов глюкозинолатов.
    2. Идентификация неизвестных глюкозинолатов с эталонами или на ЖХ-МС 18, 19, если это возможно.
    3. Идентификация неизвестных глюкозинолатов с ядерного магнитного резонанса (ЯМР), если это возможно.
    4. Сравнение УФ - спектров и временами удерживания пиков с теми , на рисунке 2 и в таблице ссылок 3, баз данных или литературы.

figure-protocol-1
Рисунок 2. УФ - спектры наиболее распространенных классов глюкозинолатов. спектры поглощения УФ (200-350 нм) из шести desulfoglucosinolates (GSL), на основе решений, изготовленных из коммерчески доступных эталонных соединений, экстрагированных, как описано здесь, представляющие наиболее распространенные классы структурных. Общее название, Structural имя (в скобках), и структурный класс приведены. (А) синигрин (2-пропенил GSL), алкенил; (В) glucoerucin (4-метилтиобутил GSL), thioalkenyl; (С) глюкорафанин (4-methylsulfinlybutyl GSL), сульфинил; (D) glucobrassicin (индол-3-ил-метил GSL), индол; (Е) gluconasturtiin (2-фенилэтил GSL), ароматические; (F) синальбин (4-гидроксибензил GSL), ароматические. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

  1. квантификация
    1. Интегрирование площади под пиками пяти синигрин ссылок и образцов.
    2. Вычислить калибровочной кривой из пяти измеренных синигрин ссылок, основанных на интегрированной области. Используя уравнение линии регрессии (см уравнение 1) для вычисления интерполированного количество глюкозинолатов (см уравнение 2).
    3. Для того, чтобы вычислить концентрацию различных глюкозинолатов, умножить интерполированное количество (х) на коэффициент отклика (М) для обнаружения при 229 нм , от EC (1990) 16, Бюхнера (1987) 15, или Браун и др. (1993) 17; факторы реагирования на основе консенсуса наиболее часто обнаруженных desulphoglucosinolates приведены в таблице 3.
      Примечание: Коэффициенты чувствительности могут варьироваться между системами, это может быть причиной того, что существуют различные значения, приведенные различными ссылками (ссылки см 15-17). Тем не менее, эти значения в основном довольно близко и в таком же диапазоне со структурными классами. После конвенции, установите коэффициент отклика неопознанных глюкозинолатов до 1, хотя по неизвестным индолглюкозинолаты с УФ - спектра , аналогичной glucobrassicin и других индолглюкозинолаты (рисунок 2), было бы целесообразно использовать 0,25 в качестве фактора ответа для полученияреалистичной оценкой концентрации (таблица 3).
    4. Для того, чтобы рассчитать окончательную сумму глюкозинолатов (х Т) в образце, возьмите коэффициент разбавления (D) и массы образца (W) , используемый для анализа во внимание (см уравнение 3).
      figure-protocol-2 (1)
      figure-protocol-3 (2)
      figure-protocol-4 (3)
      у = площадь пика
      м = наклон опорной 5-точечной кривой регрессии
      с = пересечение линии регрессии с оси у
      х = количество глюкозинолатов в экстракте
      х т = концентрация глюкозинолатов в образце растений
      D = коэффициент разбавления
      М = коэффициент отклика для детектирования на 229 нм от Бюхнера (1987) или Brown и соавт. (1993)
      ш = масса образца использовали для экстракции

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот метод позволяет обнаруживать и разделение обычно встречающихся desulfoglucosinolates во всех структурных классов (рисунок 3). Вредное 2-hydroxyglucosinolate progoitrin приходит относительно рано на хроматограмме и четко отделены от полезного глюкозинолатов глюкорафанина, единственный methylsulfinylglucosinolate в этом образце. Синигрин, gluconapin и glucobrassicanapin образуют элюотропную серию алкенильных глюкозинолатов с длинами увеличения боковой цепи (С3, С4, С5 и, соответственно). Подобная логическая серия видна для двух methylthioalkenyl глюкозинолатов, glucoiberverin (С3) и glucoerucin (C4). Пики три индолглюкозинолаты, glucobrassicin и его производных 4-гидрокси и 1-methoxyglucobrassicin (neoglucobrassicin), также четко разделены. Следует отметить, что пики neoglucobrassicin и glucoerucin, а также gluconasturtiin, единственным ароматическим глюкоsinolate в этом образце, особенно высоки в этом Brassica экстракт из - за добавления корневых экстрактов в смеси 9.

figure-results-1
Рисунок 3: Хроматограмма экстракта глюкозинолатов. Деталь (1-32 мин) на хроматограмме ВЭЖХ в результате анализа комбинированных корней и побегов из образцов горчица чёрная, Б. рапы и Б. Oleracea. Пиковые метки указывают время удерживания и сокращения для определенных desulfoglucosinolates (GSL). PRO = progoitrin (2-ОН-3-бутенил GSL); Раф = глюкорафанина (4-methylsulfinlybutyl GSL); SIN = синигрин (2-пропенил GSL), ГНА = gluconapin (3-бутенил GSL); 4OH = 4-гидроксиглюкобрассицин; IBV = glucoiberverin (3-метилтиопропил GSL); ГБН = glucobrassicanapin (4-пентенил GSL); ЕСВ = glucoerucin (4-метилтиобутил GSL); GBC = glucobrassicin (индол-3-ил GSL); NAS = gluconasturtiin (2-фенилэтил GSL); ОСЗ = neoglucobrassicin (1-метанол-glucobrassicin). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Более длинные метилсульфинил глюкосинолаты цепи, которые обычно встречаются в модели растения Arabidopsis, также показывают элюотропную ряд, как показано в корневой экстракт Rorippa Austriaca. Glucohesperalin (C6), glucosiberin (C7), glucohirsutin (C8) и glucoarabin (С9) появляются через равные промежутки времени на хроматограмме (рисунок 4). Вместе с УФ-спектров пиков, таких элюотропную логическая серия может быть использована для классификации, и в предварительном порядке определить, неизвестные глюкозинолатов.

figure-results-2
Рисунок 4: Хроматограмма (кадр 9-30 мин) Из desulfoglucosinolates в Austriaca экстракта корня Rorippa. Пиковые метки указывают время удерживания и сокращения для определенных desulfoglucosinolates (GSL). HES = glucohesperin (6-methylsulfinylhexyl GSL); SBE = glucosiberin (7-methylsulfinylheptyl GSL); GBC = glucobrassicin (индол-3-ил-метил GSL); HIR = glucohirsutin (8-methylsulfinlyoctyl GSL); АРА = glucoarabin (9-methylsulfinylnonylglucosinolate); ОСЗ = neoglucobrassicin (1-метанол-glucobrassicin). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Распространенное имя Структура боковой цепи Rt (мин) * 229 нм Справка#
aliphatiC глюкосинолаты
Glucocapparin метил 3.5 1 коричневый
синигрин 2-пропенил 5.5 1 Браун, EC
Gluconapin 3-бутенил 9.5 1.11 ЕС
Glucobrassicanapin 4-пентенил 13.5 1,15 ЕС
Glucoiberverin 3-метилтиопропил 10,9 0,8 коричневый
Glucoerucin 4-метилтиобутил 14,0 0,9 коричневый
Glucoiberin 3-methylsulfinylpropyl 3.7 1.2 коричневый
глюкорафанина 4-methylsulfinylbutyl 4.9 0,9 коричневый
Glucoalyssin 5-methylsulfinylpentyl 7.6 0,9 коричневый
Glucohesperin 6-methylsulfinylhexyl 10.5 1 коричневый
Glucosiberin 7-methylsulfinylheptyl 13.5 1 коричневый
Glucohirsutin 8-methylsulfinyloctyl 16.8 1.1 коричневый
Glucoarabin 9-methylsulfinylnonyl 20.5 1
Glucocheirolin 3-methylsulfonylpropyl 4.2 0,9 коричневый
Progoitrin 2 (R) -OH-3-бутенил 4.5 1,09 Бюхнера, EC
Gluconapoleiferin 2-ОН-5-пентенил 8.3 1 ЕС
индолглюкозинолаты
4-гидроксиглюкобрассицин 4-hydroxyindol-3-ил-метил 11.2 0,28 Бюхнера, EC
Glucobrassicin индол-3-ил-метил 15,3 0,29 Бюхнера, EC
4-Methoxyglucobrassicin 4-метоксииндол-3-ил-метил 18,2 0,25 Бюхнера, EC
Neoglucobrassicin 1-метоксииндол-3-ил-метил 22,5 0,2 Бюхнера, EC
ароматические глюкосинолаты
синальбин 4-гидроксибензил 8.1 0,5 Бюхнер
Glucosibarin 2 (R) -OH-2-фенилэтил 12.1 смотреть следующий
Glucobarbarin 2 (S) -OH-2-фенилэтил 12,7 0,95 Бюхнер
Glucotropaeolin бензил 13,8 0,95 Бюхнера, EC
Gluconasturtiin 2-фенилэтил 18,0 0,95 Бюхнера, EC
неизвестен - алифатические / ароматические как УФ - спектра 1 ЕС
неизвестен - индол , как спектр 0,25 ЕС
* Приблизительное время удерживания (RT) с округлением до ближайшего 0,1 мин (± 0,3 мин в зависимости от колонки, качества элюент). Время удерживания определяют на ThermoFisher / Dionex Окончательный ВЭЖХ платформ , оснащенных C 18 колонке (150 х 4,6 мм, 3 микрометров размер частиц) плюс С 18 таблице 1.
# Документы факторов отклика: Бюхнера, Р. в глюкозинолатов в рапс (под ред JP Wathelet) 50-58 (Нейхоф Publishers, 1987); Браун, PD, Tokuhisa, JG, Reichelt, М. и Гершензон, J. Изменение глюкозинолатов накопления среди различных органов и стадий развития Резуховидка Таля. Фитохимии. 62 (3), 471-481, DOI: 10.1016 / S0031-9422 (02) 00549-6, (2003); EC. Масличные семена - определение глюкозинолатов высокоэффективной жидкостной хроматографии. Официальный журнал Европейских сообществ. L 170/28. Приложение VIII 03.07.27-34 (1990).

Таблица 3: Факторы ответ наиболее часто встречающиеся desulfo-глюкозинолатов в экстрактах растений и их приблизительное время удержания на C 18 столбцов. Элюентов, gradienт, температура колонки, и скорость потока , как в таблице 1.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Наибольшие преимущества этого созданы и широко используемый метод является то, что она является надежной, довольно простой и относительно недорогой на образец. Большая часть оборудования, необходимого для экстракции и анализа, должны быть доступны в стандартной лабораторной или может быть построенного собственными силами, за исключением ВЭЖХ-ФДА. Еще одно преимущество состоит в том, что desulfoglucosinolates растворенные в воде химически достаточно стабилен при хранении прохладное и в герметичных (ВЭЖХ) флаконов, таким образом экстракты можно было легко транспортировать для ВЭЖХ-анализа в другом месте. В отличие от платформ LC-MS, которые требуют специальной подготовки и большой практический опыт для управления программным обеспечением и анализа данных, ВЭЖХ-УФ / КПК можно легко запускать после короткого периода обучения. Это не только снижает затраты на процедуры, но и делает этот метод более доступным для широкого круга ученых, в том числе студентов.

В общем случае, когда процедуры, описанные выше, с последующим сторожныLLY, несколько проблем должно произойти. В общем, пики глюкозинолатов очень хорошо разделены на хроматограмме. Если это не так, программа градиент может быть адаптирован путем уменьшения скорости увеличения ацетонитрила в качестве элюента. В качестве альтернативы, строительство в новой предварительной колонке (200-500 инъекции) или колонке (1500 -2000 инъекции) может решить эту проблему. Время от времени, хроматограммы единичных образцов в партии может показать очень мало или совсем нет пиков. Это, как правило , из - за ошибок при использовании пипеток при добавлении сульфатазы (например, колонна была пропущена или сульфатазы не был должным образом смывается в колонку). В качестве альтернативы, концентрация глюкосинолатов в экспериментальных материалов, возможно, были ниже, чем ожидалось, и слишком мало материала был использован для экстракции. Если последнее имеет место, объем впрыска может быть увеличена до 100 мкл, или точный аликвоты (например, 800 мкл) экстракта может быть сконцентрирован. Последнее может быть достигнуто путем сублимационной сухойИнг экстракта, растворением остатка в меньшем объеме (например, 100 мкл) , воды, и реинжекции с использованием той же эталонной кривой. В расчетах для исходной концентрации экстракта, число следует умножить на коэффициент разбавления. Если это не решает проблему, материалы должны быть извлечены еще раз, используя больше исходного материала. Если это больше, чем 100 мг, объем растворителей экстракции и размеры труб должны быть скорректированы пропорционально для поддержания эффективности экстракции.

Дополнительным преимуществом является то, что этот метод был хорошо проверен. Это потому , что он был описан в качестве стандартного метода для количественного определения глюкозинолатов в рапсовое, для которых процедуры и точность были подтверждены в нескольких лабораториях 16. Кроме того, генетический фон, биосинтез и биологические функции глюкозинолатов подвержены интенсивных усилий исследований, в модеэль видов растений Резуховидка Таля среди других 4, 6, 12. Таким образом, многие факторы отклика для точного количественного определения desulfoglucosinolates по отношению к синигрин хорошо определены и общедоступны 15,17. Даже если протоколы LS-MS на основе более высокой пропускной способностью , более чувствительны и способны (предварительно) определить глюкозинолатов , для которых нет стандартов отсутствуют 18, 19, 20, отсутствие универсальных факторов отклика для LC-MS ограничивает точное количественное определение концентрации глюкозинолатов 18. Кроме того, эти методы, как правило, не включают в себя стадию сушки вымораживанием и количество воды в свежем растительном материале является неучтенных в расчетах, что делает трудным точное определение объемов. И, наконец, потому, что наш метод экстракции включает столбец на основеочистка и стадия концентрирования, она также может быть применена к «грязных» образцов с низкой концентрацией глюкозинолатов, таких как почвы 21.

По сравнению с ЖХ-МС на основе методов , которые обычно извлекают свежезамороженной материалов, используемых 96-луночные планшеты для экстракции, и не включают стадию сульфатазы 18, 19, наш метод относительно больших затрат времени и труда , интенсивно. С помощью стоек колонн, описанных в данной статье, один человек может добывать около 100-150 проб в течение одного дня. Элюирование (на следующий день), заморозить сушки (в течение ночи), и повторное растворение может иметь место в течение следующих двух дней. С помощью автоматизированной ВЭЖХ инжектора, запуск и уравновешивающим время 40-45 мин на инъекцию, и без каких-либо непредвиденных событий, то потребуется 3-4 дней, чтобы получить данные для этого набора образцов. Когда программное обеспечение ВЭЖХ позволяет производить автоматическую Количественное основанный на синигрин кривой, ручной проверки на хроматограммах и реак задания на 100 выборок может принимать только еще 1 или 2 часа до того, как данные могут быть использованы для статистического анализа.

Несмотря на повышение доступности стандартов глюкозинолатов, лишь малая часть из более чем 130 кандидатов в настоящее время может быть коммерчески куплены. Тем не менее, с несколькими ссылками для каждого из биосинтетических классов; доступ к базам данных литературы с указанием соединений найденных ранее в видов растений (например, Фэхи и др . 22); базовые знания хроматографических принципов, таких как логика элюотропную ряда (например, для увеличения количества Cs на боковой цепи в алифатических соединений, 3 и 4); и проверка отдельных образцов на LC-MS 19 или изолированных глюкозинолатов на ЯМР 23, можно легко преодолеть это ограничение. Большинство протоколов для глюкозинолатов анализа используют внутренние эталонных кривых(То есть, определенная концентрация для извлечения синигрин или синальбин к экстракции растворителем 16, 17, 19). В принципе, внутренние опорные кривые являются более подходящими для коррекции отдельных ошибок обработки образца и, таким образом, теоретически дают более высокую точность. Несмотря на это преимущество, мы предпочитаем использовать пятибалльной внешний эталонной кривой а, как мы часто анализируем различные дикие виды, некоторые из которых содержат высокие уровни синигрин (например, горчица чёрная 24) или синальбин (например, Sinapis альба 25) два глюкозинолатов ссылки, для которых коэффициенты чувствительности доступны. Кроме того, добавление внутренних стандартов к каждому образцу увеличивает стоимость анализов, а высококачественные опорные глюкосинолатов стандарты, как правило, довольно дорого.

В заключение, несмотря на затратных по времени шагов, этот протоколобеспечивает простой и доступный метод для извлечения и количественного определения глюкозинолатов в образцах растений. Тем не менее, важно учитывать , что сами уровни глюкозинолатов являются только индикацию потенциальной биологической активности, который рассматривается как необходимость вступать в реакцию с мирозиназой способности и изменения в продуктах реакции могут возникать из одного глюкозинолатов 11. Validation анализы должны быть выполнены, чтобы подтвердить биологическую значимость.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NMvD благодарит доктора Михаэля Райхельта (Институт химической экологии Макса Планка, Йена, Германия) за предоставление первых эталонных образцов, когда она начала использовать этот метод 16 лет назад. Циска Рааймейкерс (NIOO-KNAW, Вагенинген, Нидерланды), Себастьян Кроссе (B-Ware, Неймеген, Нидерланды) и Кристиан Ристок (iDiv, Лейпциг) получили признание за улучшение протокола на протяжении многих лет. Мирка Мазель и Мартина Хуберти (Университет Тюбингена, Германия) получили разрешение на использование хроматограммы Рориппы. Авторы выражают благодарность за поддержку Немецкому центру интегративных исследований биоразнообразия (iDiv) Галле-Йена-Лейпциг, финансируемому Немецким научно-исследовательским обществом (FZT 118).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Метанол HiPerSolv CHROMANORM® градиентный марка для ВЭЖХ маркиVWR20864.320
Ацетат натрия (NaOAc)Sigma-AldrichW302406-1KG-K
HClVWR1.09057.1000
SephadexSigma-AldrichA25120-10G
(−)-Синигрин гидрат<бр/> из хрена Sigma-AldrichS1647-500MG
АрилсульфатазаSigma-AldrichS9626-10KU
ЭтанолVWR20816.298
Пипетка ПастераCarl Roth4518.1
СтекловатаCarl Roth7377.1
Стеклянная/деревянная палочкаVWRHERE1080766
2 мл реакционных пробирокVWR211-2120
Игла для препарированияCarl RothKX93.1
Тарелка дляCarl Roth0772.1
Лоток для отходов Зажимы для запайки RotilaboCarl Roth N217.1
Сублимационная сушилка Freezone 12 лLabconco7960030
Ацетонитрил супер градиенткласса VWR83639.320
Водяная баняVWR462-5112
Ультразвуковая ваннаFisher ScientificFB 15061
PH ЭлектродThermo Fisher ScientificSTARA2115
Центрифуга Heraeus Multifuge X1Thermo Fisher Scientific75004210
предварительная колонкаThermo Fisher Scientific69697C18 колонна (4,6 x 10 мм, 5 & м, 300 & Аринг;) 
Колонна Acclaim 300Thermo Fisher Scientific60266C18 колонна (4,6 x 150 мм, 3 &; м, 300 & Аринг;) 
ВЭЖХ Ultimate 3000Thermo Fisher Scientificс колонной печью и детектором УФ или КПК
Колба 1 000 млVWR215-1595
Глюкозинолатные референтные соединенияФитопланразличныхhttp://www.phytoplan.de/
отходов

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hartmann, T. From waste products to ecochemicals: Fifty years research of plant secondary metabolism. Phytochemistry. 68 (22-24), 2831-2846 (2007).
  2. Will, H., Laubenheimer, A. Ueber das Glucosid des weissen Senfsamens. Justus Liebigs Annalen der Chemie. 199 (1), 150-164 (1879).
  3. Agerbirk, N., Olsen, C. E. Glucosinolate structures in evolution. Phytochemistry. 77, 16-45 (2012).
  4. Halkier, B. A., Gershenzon, J. Biology and biochemistry of glucosinolates. Ann Rev Plant Biol. 57, 303-333 (2006).
  5. Sønderby, I. E., Geu-Flores, F., Halkier, B. A. Biosynthesis of glucosinolates - gene discovery and beyond. TIPS. 15 (5), 283-290 (2010).
  6. Kliebenstein, D. J., et al. Genetic control of natural variation in Arabidopsis glucosinolate accumulation. Plant Physiol. 126 (2), 811-825 (2001).
  7. van Leur, H., Raaijmakers, C. E., van Dam, N. M. A heritable glucosinolate polymorphism within natural populations of Barbarea vulgaris. Phytochemistry. 67 (12), 1214-1223 (2006).
  8. Kelly, P. J., Bones, A., Rossiter, J. T. Sub-cellular immunolocalization of the glucosinolate sinigrin in seedlings of Brassica juncea. Planta. 206 (3), 370-377 (1998).
  9. van Dam, N. M., Tytgat, T. O. G., Kirkegaard, J. A. Root and shoot glucosinolates: a comparison of their diversity, function and interactions in natural and managed ecosystems. Phytochem Rev. 8 (1), 171-186 (2009).
  10. Ratzka, A., Vogel, H., Kliebenstein, D. J., Mitchell-Olds, T., Kroymann, J. Disarming the mustard oil bomb. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (17), 11223-11228 (2002).
  11. Wittstock, U., Kliebenstein, D. J., Lambrix, V., Reichelt, M., Gershenson, J. Integrative Phytochemistry: From ethnobotany to molecular ecology: Recent Advances in Phytochemistry. Romeo, J. T. 37, Ch. 5 Pergamon (2003).
  12. Hopkins, R. J., van Dam, N. M., van Loon, J. J. A. Role of glucosinolates in insect-plant relationships and multitrophic interactions. Ann Rev Entomol. 54 (1), 57(2009).
  13. Kliebenstein, D. J., Gershenzon, J., Mitchell-Olds, T. Comparative quantitative trait loci mapping of aliphatic, indolic and benzylic glucosinolate production in Arabidopsis thaliana leaves and seeds. Genetics. 159 (1), 359-370 (2001).
  14. Mithen, R., Bennett, R., Marquez, J. Glucosinolate biochemical diversity and innovation in the Brassicales. Phytochemistry. 71 (17-18), 2074-2086 (2010).
  15. Buchner, R. Glucosinolates in rapeseed. Wathelet, J. P. , Martinus Nijhoff Publishers. 50-58 (1987).
  16. Oil seeds - determination of glucosinolates High Perfomance Liquid Chromatography. Official Journal of the European Communities. , L 170/28. Annex VIII 03.07 27-34 (1990).
  17. Brown, P. D., Tokuhisa, J. G., Reichelt, M., Gershenzon, J. Variation of glucosinolate accumulation among different organs and developmental stages of Arabidopsis thaliana. Phytochemistry. 62 (3), 471-481 (2003).
  18. Glauser, G., Schweizer, F., Turlings, T. C. J., Reymond, P. Rapid Profiling of Intact Glucosinolates in Arabidopsis Leaves by UHPLC-QTOFMS Using a Charged Surface Hybrid Column. Phytochem Analysis. 23 (5), 520-528 (2012).
  19. Crocoll, C., Halkier, B. A., Burow, M. Current Protocols in Plant Biology. , John Wiley & Sons, Inc. (2016).
  20. Griffiths, D. W., Bain, H., Deighton, N., Botting, N. P., Robertson, A. A. B. Evaluation of liquid chromatography-atmospheric pressure chemical ionisation-mass spectrometry for the identification and quantification of desulphoglucosinolates. Phytochem Analysis. 11 (4), 216-225 (2000).
  21. Gimsing, A. L., Kirkegaard, J. A. Glucosinolates and biofumigation: fate of glucosinolates and their hydrolysis products in soil. Phytochem Rev. 8 (1), 299-310 (2009).
  22. Fahey, J. W., Zalcmann, A. T., Talalay, P. The chemical diversity and distribution of glucosinolates and isothiocyanates among plants. Phytochemistry. 56, 5-51 (2001).
  23. de Graaf, R. M., et al. Isolation and identification of 4-α-rhamnosyloxy benzyl glucosinolate in Noccaea caerulescens showing intraspecific variation. Phytochemistry. 110 (0), 166-171 (2015).
  24. van Dam, N. M., Raaijmakers, C. E. Local and systemic induced responses to cabbage root fly larvae (Delia radicum) in Brassica nigra and B. oleracea. Chemoecology. 16 (1), 17-24 (2006).
  25. Gols, R., et al. Temporal changes affect plant chemistry and tritrophic interactions. Bas Appl Ecol. 8 (5), 421-433 (2007).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Glucosinolate ExtractionHPLC AnalysisMethanol Water ExtractionIon Exchange PurificationSulfatase TreatmentDesulfoglucosinolate ElutionFreeze Drying ProcessRetention Time ComparisonUV Spectra DetectionSinigrin Reference Curve

Related Articles