Вирусные производные пептиды, в сочетании с антител конъюгатов (ACs) — это подход, набирает обороты из-за возможности доставлять молекулярной аппаратуру с накоплением рост опухолевых клеток. Используя общие методы для оценки пептид спряжение, переменного тока и полезной нагрузки внутриклеточного накопления и опухоли таргетинга, этот протокол помогает исследователям на этапах первоначального развития.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Первоначальная оценка антител конъюгаты изменения с пептидами вирусный производные для повышения сотовой накопления и ориентации опухоли
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Антитела конъюгатов (АКГ) изменен с пептидами, вирус производные являются потенциально мощный класс опухолевых клеток агентов доставки для молекулярной нагрузок используется в лечении рака и изображений из-за увеличения сотовой накопления над текущей ACs. Во время ранних переменного тока в vitro развития, методы флуоресценции и Радиоиммуноанализы достаточно для определения внутриклеточной локализации, накопление эффективность и специфики целевой ячейки. В настоящее время нет консенсуса на стандартизированные методы подготовки клетки для оценки AC внутриклеточного накопления и локализации. Первоначальное тестирование ACs с вирусом производные пептиды имеет решающее значение, особенно если были построены несколько кандидатов. Определение внутриклеточного накопления флуоресценции могут быть затронуты фонового сигнала от ACs на поверхности клеток и усложнить толкование накопления. Для Радиоиммуноанализы фракционированный обычно обработанные клетки и измерения радиоактивности в различных клеточных компартментов. Однако лизис клеток зависит от ячейки к ячейке и часто ядерные и цитоплазматические отсеков не адекватно изолированы. Это может производить вводящие в заблуждение данные о свойствах доставки полезной нагрузки. Внутривенные инъекции radiolabeled вирус производные пептид модифицированные ACs в опухоли, принимая мышей, следуют радионуклидной визуализации-это мощный метод для определения свойства доставки опухоли ориентации и полезной нагрузки в в естественных условиях этапа развития. Однако это относительно недавнее улучшение и несколько групп оценивается вирус производные пептид модифицированные ACs таким образом. Мы описываем обработки обработанные клетки более точно оценить вирус производные пептид модифицированные накопление переменного тока при использовании confocal микроскопии и Радиоиммуноанализы. В частности метод trypsinizing клетки, чтобы удалить поверхности клетки связаны ACs. Мы также предоставляют метод для улучшения клеточной фракционирования. Наконец этот протокол предоставляет метод в естественных условиях с использованием позитронно-эмиссионная томография (ПЭТ) для оценки первоначальной опухоли, ориентация свойства опухоли подшипник мышей. Мы используем радиоизотопные 64Cu (t1/2 = 12,7 ч) как полезные данные примера в настоящем Протоколе.
Введение
Антитела конъюгатов (АКГ) являются биофармацевтических препаратов, которые созревают в класс трансформативных эффективных препаратов для улучшения лечения рака и для обнаружения опухолей. Состоит из моноклональных антител (МАБ), конъюгированных с молекулярной полезных радиоизотопов, малые молекулы и биологических токсинов, ACs способны доставить этих полезных для раковых клеток с изысканной целевой антигена сродства и специфичностью. Таким образом ACs могут значительно сократить неспецифических токсичности и увеличения полезной деятельности на объекте опухоли. Терапевтически ACs, транспортировки цитотоксических малых молекул (обычно упоминается как антитела наркотиков....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
В естественных условиях животных описал были проведены эксперименты согласно утвержденным протоколом и этические руководящие принципы Комитета по этике при университетский центр де Шербрук для экспериментов животных.
1. антитела пептида спряжение
Примечание: ChAcNLS может быть синтезирован в любой коммерческой пептид производителя или университет аффилированным пептидный синтез службы платформы. Синтез ChAcNLS можно найти в справочных 34. Для процедуры 1 и 2 Используйте МАБ 7G 3, которая является специфической для лейкемии антигена Ил 3Rα 39.
- В пр....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
1 процедура строительство 7G 3 изменена с ChAcNLS с помощью сульфогруппу ККАП как сшивателя является очень надежным. Как правило при загрузке на 12% гель и проанализированы SDS-PAGE, это приводит к различимых поэтапное увеличение МВт пропорционального увеличения соотношения сульфогруппу ККАП к - 7G 3 используется и позволяет для тяжелых и легких цепей оцениваться индивидуально для ChAcNLS Спряжение (рис. 3). 7G 3 отреагировали на 10-, 20-, 25- и 50-к-1 сульфогруппу ККАП к.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Основными задачами системного доставки анти-рак агентов являются увеличить накопления на опухоли и поглощение в раковые клетки и уменьшить нежелательные побочные эффекты в здоровых тканях. AC целевой доставки молекулярных полезных для опухолевых клеток является весьма перспективным подходом к лечения и выявления опухолей. Однако отсутствие эффективности вызванные endosome изобличения и вниз лизосомальных деградации поток остается важной задачей. Хотя этот протокол использует ChAcNLS пептид как пример для строительства но.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют ничего сообщать
Благодарности
Эта работа финансировалась обществом исследований рака (Канада) и кису. Авторы благодарят д -р Самиа МТА-Моханд и Жан-Франсуа Beaudoin за помощь. Д-р Анхель Лопес (Университет Южной Австралии) для mAb A14.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Sulfo-SMCC | Thermo Scientific | 22122 | Существует множество гомо- и гетеро-бифункциональных малеимидных сшивающих агентов на выбор. |
| Центробежные фильтры Amicon Ultra-0,5 мл EMD | Millipore | UFC505096 | Упаковки бывают 8, 24 и 96. Выбирайте в соответствии с вашими потребностями. |
| Прецизионный плюс белковый калейдоскоп стандартов | BioRad | 1610375EDU | Mulicolor рекомбинантных белков от 10 до 250 кДа. |
| Трипсин-ЭДТА (0,25%), фенол красный | Thermo Scientific | 25200056 | объемом 100 или 500 мл на выбор. |
| Вторичное антитело козы против мыши IgG (H+L), конъюгат Alexa Fluor 647 | Thermo Scientific | A-21235 | 1 - 10 μ г/мл рекомендуется |
| NOTA-NHS | CheMatech | C100 | |
| Lamin A/C антитело (N-18) | Santa Cruz Biotechnology | sc-6215 | |
| Rab7 антитело | Santa Cruz Biotechnology | sc-376362 | |
| A14 mAb | BD Biosciences | 555902 | |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | Thermo Scientific | NP0007 | |
| 2- Меркаптоэтанол | Sigma Aldrich | M3148-25ML | |
| TF-1a клетки | ATCC | ATCC CRL-2003 | |
| RPMI 1640 средний | ATCC | ATCC 30-2001 | |
| RIPA буфер для лизиса и экстракции Thermo | Scientific | 89900 | |
| AMIDE программное обеспечение для медицинской визуализации | доступно на amide.sourceforge.net | Совершенно бесплатно скачать | |
| FluoView FV1000 Конфокальный микроскоп | Olympus | ||
| Программное обеспечение Fluoview | Olympus | www.olympus-lifescience.com | |
| ITLC полоски | Biodex | 150-771 |
Ссылки
- Verma, S., et al. Trastuzumab emtansine for HER2-positive advanced breast cancer. New England Journal of Medicine. 367 (19), 1783-1791 (2012).
- Younes, A., et al. Results of a pivotal....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
