Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Высокая пропускная способность Совместимость анализа для оценки эффективности против наркотиков пассировать макрофагов

7.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/55453

⸱

24 марта 2017 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, University of Alabama at Birmingham

В этой статье

Краткое содержание

Новые модели и анализы, которые могли бы улучшить процесс ранней разработки лекарств для противотуберкулезных препаратов следующего поколения, крайне желательны. В данной статье мы описываем быстрый, недорогой и совместимый с BSL-2 анализ для оценки эффективности препарата против Mycobacterium tuberculosis, который может быть легко адаптирован для высокопроизводительного скрининга.

Аннотация

Ранний процесс разработки противотуберкулезных препаратов затруднен из-за неэффективного перевода соединений с активностью in vitro в эффективность в клинических условиях. Вероятно, это связано с недостаточным вниманием к физиологически значимым барьерам клеточного проникновения, которые существуют в инфицированном хозяине. Недавно мы создали альтернативную модель инфекции, которая генерирует крупные агрегатные структуры макрофагов, содержащие плотно упакованный M. tuberculosis (Mtb) в своей основе, который подходит для тестирования на чувствительность к лекарствам. Эта модель заражения недорогая, быстрая и, что самое главное, совместимая с BSL-2. Здесь мы описываем экспериментальные процедуры для создания структур Mtb/макрофагов, которые будут производить Mtb, проходящий через макрофаги, для тестирования чувствительности к лекарственным препаратам. В частности, мы демонстрируем, как эта система заражения может быть непосредственно адаптирована к формату 96-луночных планшетов, демонстрируя пропускную способность для скрининга библиотек соединений на Mtb. В целом, этот анализ является ценным дополнением к доступному в настоящее время набору инструментов для поиска лекарств от туберкулеза туберкулеза благодаря своей простоте, экономической эффективности и масштабируемости.

Введение

Туберкулез (ТБ) остается серьезной угрозой глобального здравоохранения , несмотря на наличие противотуберкулезных режимов химиотерапии в течение более 40 лет 1. Это связано отчасти с требованием в течение длительного периода лечения в течение 6 месяцев с использованием нескольких комбинаций лекарственных препаратов, что приводит к пациенту несоблюдения 2. Возникновение лекарственно-устойчивого туберкулеза в последние годы еще более усугубляются проблемы в области , где успешное развитие клинически одобренных препаратов практически не существует 3. Действительно, несмотря на исчерпывающий разработки лекарственных средств против туберкулеза, только один препарат был одобрен FDA для клинического использования в течение последних 40 лет 4. Таким образом, крайне необходимы новые поколения противотуберкулезных препаратов для решения этой проблемы.

Ключевой проблемой в обнаружении наркотиков ТБ является отсутствие успешной передачи из соединений с активностью в пробирке эффективности в клинических условиях= "Xref"> 5, 6, 7. Первоначально целевые подходы , основанные были использованы для скрининга лекарственных средств анти- MTB 5, которые не удалось перевести в целые бактериальные клетки. Даже при использовании MTB клетки, она часто выполняется с использованием бульона выращенных культур, которые не точно предсказать эффективность лекарственного средства в естественных условиях 8, 9. Эти проблемы были признаны и скрининга лекарственных препаратов анализы против макрофагов , содержащих MTB или латентную MTB были успешно установлены 8, 10, 11, 12. Тем не менее, даже эти более продвинутые анализы не дают достаточного внимания к проникновению барьеров, что наркотики столкнуться в не васкуляризированных легочных поражений, а в некротических очагов на месте инфекции. В самом деле, Даже для первой линии ТБ рифампицином наркотиков, неоптимальной дозирование была поставлена под сомнение в связи с недостаточным в естественных условиях ткани и спинномозговой жидкости (CSF) проникновение 13, 14, 15, а также снижение эффективности против внутриклеточной Mtb 8, 9. Как таковые, новых моделей и анализов, которые учитывали бы эти параметры в ходе процесса разработки свинца начале будет, несомненно, улучшит ТБ усилия обнаружения наркотиков.

Чтобы удовлетворить эту потребность, мы недавно установили недорогой, быстрый, и BSL-2 совместимый альтернативную модель заражения для Mtb наркотиков тестирования 16 эффективности. Эта инфекция модель производится плотно упакованной MTB в крупных макрофагами агрегированных структур, что физиологически соответствующие воспроизводятся барьеры проникновения сотовой связи и порожденных макрофаг-пассировать Mtb с измененным физиологическим состоянием , напоминающим латентный MTB. Mtb производным от этой инфекции модель была объединена с ресазурин микротитрационного анализа (REMA) , чтобы оценить эффективность препарата, которая производила результаты в соответствии с другими моделями внутриклеточной инфекции и хорошо коррелируют с отчётный способностью общих противотуберкулезных препаратов для достижения высокой концентрации CSF относительно концентрации в сыворотке крови 16.

Здесь мы опишем подробно поколение MTB / макрофагами агрегированных структур для производства макрофаг-пассировать Mtb подходит для тестирования чувствительности к лекарственным препаратам с использованием Рема. В частности, мы покажем, как эта система инфекция может быть адаптирована к формату 96-луночного для совместимости с скрининга кандидатов противотуберкулезных препаратов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Примечание: В туберкулезной MC 2 6206 является авирулентный штамм 17, 18, все работы в этом протоколе могут быть выполнены в 2 уровня биологической безопасности объекта (BSL-2).

1. Условия культивирования для зеленого флуоресцентного белка Выражая туберкулезной MC 2 6206 (MTB -GFP)

Примечание: туберкулез M. H37Rv полученный ауксотроф штамма MC 2 6206 (Δ panCD, Δ leuCD) , трансформированные с GFP экспрессии плазмиды pMN437 используется в этом протоколе 16. Можно заменить штамм Mtb -GFP с не- GFP экспрессии штамма дикого типа с целью упрощения доступности штамма для исследователей. Однако экспрессия GFP желательно включить визуальное подтверждение фагоцитоза и образования агрегатов / макрофагов MTB. Для долготуг Срок хранения, Mtb -GFP замораживают при температуре -80 ° С в полных 7H9 средах (описанных в пункте 1.1) , дополненной 20% глицерина.

  1. Подготовьте полный Mtb -GFP носитель (7H9-C), дополнив 7H9 среду с добавлением 10% Миддлбрука OADC, 0,02% тилоксапола, 24 мкг / мл D-пантотеновой кислоты, 50 мкг / мл L-лейцина и 50 мкг / мл гигромицину В.
  2. Оттепель один флакон Mtb -GFP и добавляют к 10 мл 7H9-C в квадратной нижней PETG колбу 30 мл.
  3. Инкубируют при 37 ° С на роторной качалке (50 оборотов в минуту). Проводите измерения оптической плотности (OD 600) каждые несколько дней , пока OD 600 не достигнет 1,0 (приблизительно 5-8 дней).
  4. Развести и прохождение культуры по мере необходимости для поддержания OD 600 между 0,2-1,0.
  5. Для заражения, использовать установленную культуру Mtb -GFP в логарифмической фазе роста (OD 600 0,6-1). Чтобы избежать глыбовыми культур, разрушать ультразвуком культуры колбу MTB на водяной бане (130 Вт; 3 х 5 сек импульсов) ОНКе или два раза в неделю

2. Условия культивирования для ТНР-1 клеток

  1. Подготовьте полный ТНР-1 клеточную среду (среда RPMI-C), дополняя RPMI 1640 с добавлением 10% инактивированной нагреванием фетальной бычьей сыворотки, 2 мМ L-глутамина и 10 мМ HEPES.
  2. Инкубируйте клеток в Т-75 колбу при 37 ° C в увлажненной атмосфере , содержащей 5% CO 2.
  3. Граф клеток с помощью гемоцитометра или проточной цитометрии через день и поддерживать клетки ТНР-1 при плотности от 0,1 до 0,6 млн на мл.

3. Протокол Заражение для генерации MTB / макрофагами агрегатных структурах

  1. ТНР-1 препарат клеток (на 96-луночный планшет)
    1. Центрифуга клетки 7 × 10 6 ТНР-1 при 250 мкг в течение 5 мин. Ресуспендируют в 7 мл RPMI-C.
  2. Препарат Mtb -GFP
    1. Центрифуга 2,8 х 10 8 Mtb -GFP при 3200 мкг в течение 5 мин в бакет-центрифуге Uпеть преобразование OD 600 1,0 = 3 × 10 8 бактерий / мл.
    2. Промывают один раз RPMI-C и центрифуга, как на этапе 3.2.1.
    3. Ресуспендируют в 7 мл RPMI-C и вихревое в течение 10 с.
  3. Инфекционное заболевание
    Примечание: На рисунке 1 шаблона.
    1. Подготовка 96-луночный планшет с добавлением 200 мкл стерильной воды в строках А и Н и столбцах 1 и 12 для воды ободком для предотвращения испарения культуральной среды.
    2. Добавить 200 мкл RPMI-C к колонке 2 (B2 на G2) для фонового контроля (пробел).
    3. Для заражения, добавьте Mtb -GFP суспензию (шаг 3.2) к ТНР-1 клеточной суспензии (этап 3.1) и хорошо перемешать с помощью пипетки. Окончательный ТНР-1 плотность клеток 5 х 10 5 на мл и соответствующей кратностью инфекции 40.
    4. Налейте ТНР-1 / Mtb -GFP суспензии в резервуар 25 мл.
    5. Добавить 200 мкл THP-1 / Mtb -GFP подвески для всех остальных 96- ти лунок (B3 через G11) USINга многоканальная пипетка.
      Примечание: Если работы с несколькими 96-луночные планшеты, регулярно ресуспендирования оставшегося ТНР-1 / MTB суспензии в резервуаре , чтобы обеспечить даже смесь добавляют в каждую лунку.
    6. Инкубировать при 37 ° С с 5% CO 2 в течение 7-10 дней.
    7. Изменение среды каждые 2 дня, медленно удаляя 100 мкл истощенные среды из каждой лунки и осторожно добавлением 100 мкл предварительно нагретую RPMI-C, используя пипетку многоканальный. Не ресуспендируют скважин и нарушить агрегаты MTB / макрофаги на дне лунок.
    8. Визуально проверьте лунки с помощью флуоресцентной микроскопии (4-10X объективной) ежедневно, принимая во внимание размер агрегатов / макрофагами MTB. Днем 7-10, MTB / макрофаги агрегаты должны быть достаточно большим (см рисунок 2 для справки) , чтобы приступить к тестированию эффективности лекарственного средства (раздел 4).
    9. При желании, захвата изображения 96-лунок с использованием системы автоматизированной обработки изображений клеток установленыс ярким полем и GFP наборов фильтров к документу MTB / макрофагами образования агрегатов.
      Примечание: Если пользователи не имеют доступа к автоматизированной системе формирования изображения, изображения представительных скважин могут быть выполнены при помощи любого подходящего микроскопа с GFP и светлого поля возможностями.

4. Рост Анализ ингибирования для оценки эффективности против наркотиков MTB Производный от MTB / макрофагальной Совокупностей

  1. Лекарственный препарат (тройные условия для двух препаратов)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Смотрите Рисунок 1A для шаблона.
    1. В отдельном 96-луночного планшета, добавляют 125 мкл 7H9-C Среда для В2 до G10.
    2. Готовят два препарата в двойном высшей желаемой конечной концентрации в 1 мл 7H9-C для учета разбавления на этапе 4.2.4.
    3. Добавить 250 мкл каждого препарата в лунки B11-C11-D11 и E11-F11-G11, соответственно, для трех параллельных обработок.
    4. Используя пипетку многоканальный, последовательно разбавленнымЮт тестируемые препараты в два раза путем перемещения 125 мкл из B11-G11 в B10-G10. Смешайте с помощью пипетки 5 раз на каждом шаге.
    5. Продолжайте двигаться 125 мкл из колонки в колонку (справа налево) через пластину, и остановится после колонки 4.
    6. После смешивания колонку 4, выбросьте 125 мкл в контейнер для отходов. Колонки 2 и 3 не должны содержать каких-либо лекарств, чтобы использовать в качестве фона (пробел) и положительного контроля роста.
      Примечание: В качестве альтернативы, следуйте шаблон на рисунке 1В для библиотек тестирования на наркотики. Каждый 96-луночный планшет может вместить 58 препаратов в одной концентрации. Подготовить этот препарат пластины с использованием двойной желаемой конечной концентрации, так как он будет разбавлен пополам на шаге 4.2.4.
  2. Медикаментозное лечение:
    1. Получение 96-луночный планшет , содержащий MTB -infected макрофаги (MTB / макрофаги агрегаты).
    2. Тщательно сцедить все соответствующие лунки (В2 через G11) с многоканальным пипеткой с.Выполнить это в двухступенчатом образом: сначала удалить 150 мкл без наклона пластины, а затем удалить остатки бумаги (~ 50 мкл) за счет наклона пластины и вставки наконечника пипетки к нижнему краю колодца. Как MTB / макрофаг агрегаты прилипает к нижней части скважины, материал не должен быть потерян.
    3. Осторожно добавьте 100 мкл 7H9-C СМИ ко всем соответствующим колодцах (В2 через G11) пластины , содержащей агрегаты / макрофаги MTB.
    4. Используя пипетку многоканальный, передача 100 мкл из препарата, содержащего 96-луночный планшет (этап 4.1) в соответствующие лунки инфекции пластины.
    5. Место в закрытом пакете и инкубировать в течение 3-х дней при 37 ° С.

5. Количественное Drug Эффективность с использованием анализа ресазурин микротитрами

  1. Подготовка резазурин маточного раствора в конечной концентрации 0,8 мг / мл в H 2 O. Смесь фильтруют через 0,22 мкм фильтр с размером пор PVDF мембраны для стерилизации.
  2. Подготовка ресазурин рабочего раствора путем смешивания резазурин исходного раствора, H 2 O и твин-80 (20% раствор в H 2 O) в соотношении 2: 1: 1. Конечные концентрации 0,4 мг / мл ресазурина и 5% твин-80.
  3. С помощью планшет-ридера, установки программу для чтения флуоресценции при 530 нм возбуждение и 590 нм эмиссии каждые 30 мин в течение 24 ч при 37 ° С. Предварительно теплая пластина для чтения до 37 ° С.
  4. Добавьте 20 мкл рабочего раствора резазурин все соответствующие лунки (В2 через G11) препарата обрабатывают пластины (этап 4.11), используя пипетку многоканальный.
  5. Поместите пластину на планшет-ридере и запустить программу установки на шаге 5.3.
    Примечание: Для облегчения обработки больших объемов аналитических планшетов, достаточно для разработки анализа в C инкубаторе 37 ° и выполнения отдельной флуоресцентной читает каждые 24 часа. Это также относится к пользователям, которые не имеют доступа к ридере с кинетической и инкубационных возможностей.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Для подтверждения надежности адаптации этой модели инфекции до 96-луночного пластины, мы здесь рассмотрели лекарственной чувствительности МТБ , полученного из нашего 96-луночного адаптированный инфекции модели к рифампицину (РИФ) и моксифлоксацин (Moxi) в соответствии с шаблоном , приведенной на рис 1A. Показано , что генерация MTB / макрофаг агрегированных структур ключевых в этом анализе может быть надежно произведено в 96-луночный формат пластины

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Здесь мы подробно описали альтернативную модель MTB инфекции подходит для тестирования эффективности лекарственного средства. Эта модель учитывает два ключевых фактора , которые следует уделять больше внимания в ходе процесса разработки ранней противотуберкулезных препаратов: наличие физиологически соответствующих барьеров на пути проникновения наркотиков и метаболические изменения МТБ во время инфекции. В то время как мы ранее показали преимущества нашей модели инфекции и предложила рассмотреть возмож...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Мы благодарим доктора Франка Вольшендорфа за доступ к автоматизированному считывателю планшетов для визуализации Cytation 3. Эта работа была частично профинансирована грантом NIH R01-AI104499 OK. Часть работы была выполнена на объектах UAB CFAR и UAB CFAR Flow Cytometry Core/Joint UAB Flow Cytometry Core, которые финансируются NIH/NIAID P30 AI027767 и NIH 5P30 AR048311.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
7H9BD Difco271310Следовать рекомендациям производителя
Middlebrook OADCBD Biosciences212351
TyloxapolSigmaT8761Приготовить 20% исходный раствор в H2O; стерилизовать фильтром
D-пантотеновую кислоту гемикальциевую сольSigmaP5710Приготовить стоковый раствор 24 мг/мл в H2О; фильтр стерилизовать
L-лейцинMP Biomedicals194694Приготовить стоковый раствор 50 мг/мл в H2O; фильтр стерилизовать
Hygromycin BEMD Millipore400051Приготовить стоковый раствор 200 мг/мл в H2O
Nalgene Square PETG media bottleThermo Fisher2019-0030
RPMI 1640 mediaHycloneSH30027.01
Фетальная бычья сывороткаAtlanta BiologicalsS12450H
L-глутаминCorningMT25005CI
HEPESHycloneSH30237.01
Cytation 3 планшетный ридерBiotekВзаимозаменяемый с любым флуоресцентным планшетным ридером и микроскопом
Gen5 Программное обеспечениеBiotekРегистрация и анализ резасурин коверсионный
Рифампицин Fisher ScientificBP2679250Приготовьте стоковый раствор 10 мг/мл в H2O
Moxifloxacin hydrochlorideAcros Organics457960010Приготовьте стоковый раствор 10 мг/мл в H2O
Resazurin Sodium SaltSigmaR7017Приготовьте 800 мкм; г/мл стокового раствора в H2O; фильтр стерилизовать
Твин-80Fisher ScientificT164500Приготовить 20% исходный раствор в H2O; стерилизовать фильтром

Ссылки

  1. Barry, C. E. Lessons from seven decades of antituberculosis drug discovery. Curr Top Med Chem. 11 (10), 1216-1225 (2011).
  2. Bass, J. B. Jr, et al. Treatment of tuberculosis and tuberculosis infection in adults and children. American Thoracic Society and The Centers for Disease Control and Prevention. Am J Respir Crit Care Med. 149 (5), 1359-1374 (1994).
  3. Koul, A., Arnoult, E., Lounis, N., Guillemont, J., Andries, K. The challenge of new drug discovery for tuberculosis. Nature. 469 (7331), 483-490 (2011).
  4. Palomino, J. C., Martin, A. TMC207 becomes bedaquiline, a new anti-TB drug. Future Microbiol. 8 (9), 1071-1080 (2013).
  5. Zuniga, E. S., Early, J., Parish, T. The future for early-stage tuberculosis drug discovery. Future Microbiol. 10 (2), 217-229 (2015).
  6. Evangelopoulos, D., Fonseca, da, D, J., Waddell, S. J. Understanding anti-tuberculosis drug efficacy: rethinking bacterial populations and how we model them. Int J Infect Dis. 32, 76-80 (2015).
  7. Ekins, S., et al. Looking back to the future: predicting in vivo efficacy of small molecules versus Mycobacterium tuberculosis. J Chem Inf Model. 54 (4), 1070-1082 (2014).
  8. Christophe, T., et al. High content screening identifies decaprenyl-phosphoribose 2' epimerase as a target for intracellular antimycobacterial inhibitors. PLoS Pathog. 5 (10), e1000645(2009).
  9. Hartkoorn, R. C., et al. Differential drug susceptibility of intracellular and extracellular tuberculosis, and the impact of P-glycoprotein. Tuberculosis (Edinb). 87 (3), 248-255 (2007).
  10. Queval, C. J., et al. A microscopic phenotypic assay for the quantification of intracellular mycobacteria adapted for high-throughput/high-content screening. J Vis Exp. (83), e51114(2014).
  11. Sorrentino, F., et al. Development of an intracellular screen for new compounds able to inhibit Mycobacterium tuberculosis growth in human macrophages. Antimicrob Agents Chemother. 60 (1), (2015).
  12. Sarathy, J., Dartois, V., Dick, T., Gengenbacher, M. Reduced drug uptake in phenotypically resistant nutrient-starved nonreplicating Mycobacterium tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother. 57 (4), 1648-1653 (2013).
  13. Dutta, N. K., Karakousis, P. C. Can the duration of tuberculosis treatment be shortened with higher dosages of rifampicin? Front Microbiol. 6, 1117(2015).
  14. van Ingen, J., et al. Why Do We Use 600 mg of Rifampicin in Tuberculosis Treatment? Clin Infect Dis. 52 (9), e194-e199 (2011).
  15. Donald, P. R. Cerebrospinal fluid concentrations of antituberculosis agents in adults and children. Tuberculosis (Edinb). 90 (5), 279-292 (2010).
  16. Schaaf, K., et al. A Macrophage Infection Model to Predict Drug Efficacy Against Mycobacterium Tuberculosis. Assay Drug Dev Technol. 14 (6), 345-354 (2016).
  17. Sampson, S. L., et al. Protection elicited by a double leucine and pantothenate auxotroph of Mycobacterium tuberculosis in guinea pigs. Infect Immun. 72 (5), 3031-3037 (2004).
  18. Jain, P., et al. Specialized transduction designed for precise high-throughput unmarked deletions in Mycobacterium tuberculosis. MBio. 5 (3), e01245-e01214 (2014).
  19. Davis, J. M., Ramakrishnan, L. The role of the granuloma in expansion and dissemination of early tuberculous infection. Cell. 136 (1), 37-49 (2009).
  20. Collins, L., Franzblau, S. G. Microplate alamar blue assay versus BACTEC 460 system for high-throughput screening of compounds against Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium avium. Antimicrob Agents Chemother. 41 (5), 1004-1009 (1997).
  21. Snewin, V. A., et al. Assessment of immunity to mycobacterial infection with luciferase reporter constructs. Infect Immun. 67 (9), 4586-4593 (1999).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

96THP1BSL 2
Высокая пропускная способность Совместимость анализа для оценки эффективности против наркотиков пассировать макрофагов
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.