Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Оценка кардиомиоцитов подтипов После Транскрипция фактор опосредованного перепрограммирования эмбриональных фибробластов мыши

7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/55456

⸱

22 марта 2017 г.

 , 
1Department of Internal Medicine- Cardiology, UT Southwestern Medical Center

В этой статье

Краткое содержание

В этой рукописи описывается пошаговый протокол для генерации и количественной оценки различных перепрограммированных подтипов сердца с использованием ретровирус-опосредованной доставки Gata4, Hand2, Mef2c и Tbx5.

Аннотация

Прямое перепрограммирование одного типа клеток в другой в последнее время стало мощной парадигмой для регенеративной медицины, моделирования заболеваний и спецификации линий. В частности, превращение фибробластов в индуцированные кардиомиоцитоподобные миоциты (iCLM) с помощью Gata4, Hand2, Mef2c и Tbx5 (GHMT) представляет собой важный путь для генерации de novo сердечных миоцитов in vitro и in vivo. Последние данные свидетельствуют о том, что ГМТ генерирует большее разнообразие подтипов сердца, чем считалось ранее, что подчеркивает необходимость систематического подхода к проведению дополнительных исследований. Однако, прежде чем прямое перепрограммирование может быть использовано в качестве терапевтической стратегии, необходимо детально понять механистические основы линейной конверсии для создания конкретных подтипов сердца. В данной работе мы представляем подробный протокол генерации iCLM путем GHMT-опосредованного перепрограммирования эмбриональных фибробластов (MEF) мыши.

Мы описываем методы выделения MEF, производства ретровирусной инфекции и инфекции MEF для эффективного перепрограммирования. Чтобы определить подвидовую идентичность перепрограммированных клеток, мы подробно описали пошаговый подход к выполнению иммуноцитохимии на iCLM с использованием определенного набора совместимых антител. Также представлены методы конфокальной микроскопии, идентификации и количественной оценки iCLM и отдельных подтипов предсердий (iAM), желудочков (iVM) и кардиостимуляторов (iPM). Наконец, мы обсудим репрезентативные результаты прототипных экспериментов по прямому перепрограммированию и выделим важные технические аспекты нашего протокола для обеспечения эффективного преобразования родословной. В совокупности наш оптимизированный протокол должен обеспечить поэтапный подход для исследователей к проведению значимых экспериментов по перепрограммированию сердца, которые требуют идентификации отдельных подтипов КМ.

Введение

Сердце является первым функциональным органом для развития у эмбриона 1, 2. В сочетании с кровеносной системой, она поставляет кислород, питательные вещества и механизм утилизации отходов в процессе разработки. Через три недели после оплодотворения, человеческое сердце бьется в первый раз, и его надлежащее регулирование поддерживается кардиомиоцитов (КМВ). Поэтому необратимая потеря этих специализированных клеток является фундаментальным вопросом, лежащий в основе прогрессирующей сердечной недостаточности. В то время как некоторые организмы , такие как данио и Xenopus имеют потенциал для регенерации сердца, взрослого сердца млекопитающих является более ограниченным 3, 5, 6. Таким образом, учитывая критическую функцию сердца, это не удивительно , что болезнь сердца является ведущей причиной смерти в мире, что составляет 600000 смертей в одной только 7 Соединенных Штатах.refore, клеточная терапия эффективно отремонтировать или заменить травмированного миокард имеют большой клинический интерес.

Семенной исследование Яманака и его коллеги показали , что 8 принудительная экспрессия четырех факторов транскрипции является достаточным для превращения полностью дифференцированные клетки фибробласты в плюрипотентные стволовые клетки. Тем не менее, онкогенные мощность всех плюрипотентных стволовых клеток стратегий был серьезную озабоченность в их использовании в терапевтических целях. Это побудило научную область для поиска альтернативных методов трансдифференцироваться клеток, избегая при этом плюрипотентных стадии. В последнее время несколько групп показали целесообразность этой стратегии, показывая прямое преобразование фибробластов мыши в индуцированных кардиомиоцитов-подобных клеток (iCLMs) с эктопической экспрессии факторов транскрипции GATA4, MEF2C, Tbx5, а позже, Hand2 (GMT и GHMT , соответственно) 9, 10. Furthermore, та же стратегия может быть выполнена в естественных условиях и в тканях человека , полученных 9, 11, 12. Недавние исследования выделены дополнительные факторы или сигнальных путей , которые могут быть модулированы для дальнейшего повышения эффективности сердечной перепрограммирования 13, 14, 15. Взятые вместе, эти исследования демонстрируют потенциал направленной трансдифференцировки для регенеративной терапии. Тем не менее, низкая эффективность СМ перепрограммирования, неизвестных молекулярных механизмов, несовместимым воспроизводимости из - за методологических различий 16 и гетерогенный характер iCLMs остаются нерешенными.

Для того, чтобы непосредственно оценить iCLM гетерогенность, мы разработали дискретный и надежный анализ одноклеточного для идентификации развития саркомера и сердечной клонального specificatioп-две необходимые характеристики функциональных кардиомиоцитов. Есть по крайней мере три основных типа КМ в сердце , как это определено их местоположение и уникальными электрическими свойствами: предсердия (AM), желудочковая (VM) и кардиостимулятором (PM) 17, 18, 19, 20. В спланированных комбинации, они позволяют надлежащим перекачку крови. Во время травмы сердца, один или все подтипы могут быть затронуты, и тип клеточной терапии необходимо будет решаться на индивидуальной основе случая. В настоящее время большинство стратегий сосредоточиться на общей генерации кардиомиоцитов, в то время как небольшая работа делается для изучения молекулярных механизмов, которые регулируют спецификацию подтипа.

Следующее исследование подробно описано, как правильно определить количество хорошо организованных саркомеры и определить разнообразный набор кардиомиоцитов подтипов. Использование кардиостимулятора (ПМ) Определённые репортер мыши, мы можем применить Immunocytochemical подход , чтобы отличить наведенные предсердные типа миоцитов (IAM), индуцированное желудочковых типа миоцитов (IVM) и индуцированные PM-как миоциты (IPMS) 21. На основании наших наблюдений, только клетки, которые обладают организации саркомера способны спонтанного избиения. Эта уникальная перепрограммирование платформа позволяет оценить роль определенных параметров в организации саркомера, спецификации подтипа, и эффективность СМ перепрограммирования при разрешении одноклеточных.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все экспериментальные процедуры, связанные с практикой животных были одобрены по уходу и использованию комитета Institutional животных в UT Юго-западного медицинского центра по.

1. Выделение Hcn4-GFP E12.5 мышиных эмбриональных фибробластов (МЭФ)

  1. Настройка таймерные вязки между гомозиготных самцов Hcn4-GFP и CD-1 женщин.
  2. Жертвоприношение беременных женщин на E12.5 по эвтаназии двуокиси углерода и последующего смещения шейных позвонков.
    1. Удалить рогов матки с препаровальный пинцет , как описано выше 22, 23, и поместить их в чашку Петри на льду с 1х забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS) без Са 2+ или Mg 2+.
  3. Выполните все последующие шаги в капюшоне культуры ткани с использованием стерильной техники.
    1. Удалить эмбрионов из матки и амниотической с помощью ножниц и рассекает щипцов. Держите плаценту прикрепленную для лучшей управляемости. Pregnaнт CD-1 самки обычно рождают между 10 и 14 щенков.
    2. Использование рассекает щипцов, возьмите изолированных эмбрионов и быстро промыть их дважды в 70% (об / об) этанола.
      Примечание: Смыв должен быть быстрым, чтобы минимизировать гибель клеток.
    3. Снимите головку, конечности, хвост, и внутренние органы, включая сердце из изолированных зародышей.
    4. Поместите оставшиеся ткани в 10-см чашку с 1 мл 1x PBS и мелко фарша с использованием стерильного лезвия бритвы до приблизительно 1 мм 3 в размере.
    5. Передача измельченной ткани в 50 мл коническую трубку с PBS.
    6. Спин при 300 мкг в течение 3 мин. Тщательно аспирата избыток PBS.
    7. Добавить 1 мл стерильного 0,25% трипсин-ЭДТА в эмбрионе. Инкубируйте клетки в водяной бане C 37 ° в течение 15 мин. Аккуратно перемешайте пробирку каждые 4 мин. Чрезмерная перевариванию ткани значительно снизить урожайность.
    8. смесь клеток Vortex на максимальной скорости (3200 оборотов в минуту) в течение 4 сек.
    9. Добавляют 2 мл фибробластами среды на эмбрион и перемешать. Фильтр тhrough сито ячейки 100 мкм с помощью пипетки, чтобы помочь клеткам через сито. Обратитесь к Таблице 1 для разработки всех последующих сред.
    10. Спин при 300 мкг в течение 4 мин. Тщательно аспирата супернатант.
    11. Добавьте 10 мл свежей фибробластами среды на 3 эмбрионов и растирать 6-10 раз.
    12. Пластина клеток в 1 15 см блюдо культуры ткани на каждые 3 эмбрионов, полученных. Культура в течение ночи в 37 ° C, 5% СО 2 инкубатора.
    13. После инкубации в течение ночи, замените носитель со свежими 30 мл среды на чашку. Поместите клетки обратно в инкубатор на ночь.
      Примечание: Проверьте наличие Hcn4-GFP + загрязнения клеток под флуоресцентным микроскопом. Культура должна быть GFP - и только становятся GFP + на перепрограммирование.
    14. На следующий день, урожай клеток с 3 мл свежего подогретого 0,25% трипсина-ЭДТА. Граф и заморозить клетки. Как правило, замерзают клетки в 3 × 10 6 клеток на мл. Ожидаемый YieЛ.Д. должно быть 3 × 10 6 клеток на эмбрион.

2. ретровируса Производство и перепрограммирования

Внимание: Следующий протокол требует производства и обработки инфекционных ретровирусов. Выполните следующие действия в кабинете Уровень биологической безопасности 2 под BSL-2 руководящих принципов и стерильной техники. Используйте 10% отбеливателя утилизацию всех материалов, подверженных ретровирусов.

  1. Ретровируса производство и подготовка MEFs
    Примечание: Следующий протокол для ретровирусов производства в 6-луночные планшеты и MEF-инфекции в 24-луночные планшеты. Для других форматов, обратитесь к таблице 2. MEFs высевают в день -1, так что сроки должны быть согласованы надлежащим образом для каждого эксперимента (смотрите в разделе 2.3 и рисунок 2).
    1. Поддерживать Плат-E (PE) клеток в соответствии с рекомендациями производителя. Вкратце, культура PE клеток в среде DMEM с добавлением 10% FBS, 1 мкг / мл puromyCIN, 10 мкг / мл бластицидин, пенициллин, стрептомицин и. Прохождение клетки 1: 4 раз в два дня, когда культура достигает 70-90% сплошности.
    2. День -2: За день до трансфекции, семена Плат-E клеток в количестве 1 × 10 6 клеток / лунку на 6-луночный планшет в трансфекция средах. Клетки должны быть на 70-80% сплошности во время трансфекции.
  2. Трансфекция с использованием коммерческого агентом трансфекции.
    Примечание: Коммерческие реагенты должны быть при комнатной температуре (RT) до трансфекции. Для трансфекции ДНК, добавьте каждый ретровирусов плазмидной ДНК по отдельности (G, H, M, T) и с образованием GHMT коктейль 9.
    1. День -1: В полистирольной трубке 15 мл коническую, смешивают 60 мкл восстановленного сыворотки среды с 6 мкл реагента для трансфекции на реакцию в течение 6- ти луночного формата пластины. Выдержите смесь в течение 5 мин при комнатной температуре.
      Примечание: Поскольку трансфекция реагент, используемый здесь связывается с пластмассами, Aдд непосредственно к уменьшенному сывороточный сред, чтобы избежать снижения эффективности трансфекции.
    2. Добавить в общей сложности 2 мкг GHMT коктейля на реакцию и осторожно нажмите, чтобы смешать его. Не вихрь. Инкубируют реакционную смесь в течение 15 мин при комнатной температуре.
    3. Добавьте смесь из стадии 2.2.3 к защитному клеток в капле мудрое.
    4. Инкубируйте трансфицированных клеток Плат-E в течение ночи в 37 ° C, 5% СО 2 инкубатора. Запишите время трансфекции.
  3. Посев Hcn4-GFP эмбриональных фибробластов мыши.
    1. За 1 ч до посева MEFs, подготовить 24-луночный планшет для иммуногистохимии.
      1. Добавьте 12 мм фибронектина покровное в каждую лунку.
      2. Coat лунки объемом 300 мкл бычьего раствора коллагена (например, SureCoat) и инкубировать в 37 ° C инкубаторе в течение 1 ч.
      3. Отберите раствор для нанесения покрытия непосредственно перед MEF обшивкой.
    2. Оттепель замороженный флакон Hcn4-GFP MEFs и мыть x1 с подогретым fibroblAST СМИ при 500 мкг в течение 5 мин.
    3. Определение жизнеспособности клеток с использованием трипанового синего или подобные красители. Подсчитайте число жизнеспособных клеток на мл культуры, используя следующую формулу:
      % жизнеспособных клеток = [1,00 - (Число синих клеток / Количество всех клеток)] х 100
      1. Подсчитайте общее число жизнеспособных клеток, используя следующую формулу:
        Жизнеспособные клетки =% жизнеспособных клеток х коэффициент разбавления х 10000 х общий объем клеточной суспензии
    4. Семенной 3 х 10 4 клеток на лунку на 24-луночный планшет с предварительно приготовленным раствором бычьего коллагена-фибронектин покровное.
  4. Трансдукция и перепрограммирование MEFs
    Примечание: В соответствии с примечаниями изготовителя, надлежащим образом Плат-E клетки производят средний титр 1 × 10 7 инфекции ед / мл. Несмотря на то, титр не измеряется непосредственно для каждого эксперимента, контрольная GFP, всегда включается в качестве суррогата эффективность инфекции.Высокая экспрессия GFP и интенсивность (GFP +> 95%) , как правило , коррелирует с успешным GHMT-опосредованной поколения iCLMs.
    1. День 0: 24 ч после трансфекции, фильтровать PE ретровирусов среды через мкм размер пор фильтра 0,45 поверхностно- активных веществ ацетата целлюлозы и переносят в 15 мл коническую трубку. Добавить полибрен до конечной концентрации 8 мкг / мл. Тщательно пополнять клетки с 2 мл свежей среды для трансфекции.
      Примечание: клетки легко отделяются от пластины, если средства массовой информации меняется слишком быстро.
    2. Аспирируйте среду культивируемых MEFs и добавьте свежесобранных ретровирусов среду; она не должна приводить в 1,7 мл среды на лунку 6-луночного планшета. Добавить ~ 800 мкл на лунку 24-луночного планшета. Возвращение MEF пластины в инкубатор и инкубировать в течение ночи.
    3. День 1: Повторите шаги 2.4.1 и 2.4.2. Откажитесь клетки после сбора вируса 2 - го. Возвращение зараженных MEFs в инкубатор и дайте им отдохнуть в течение ночи.
    4. День 2: 48 ч после индукции, аспирация клетка кондиционированной среды и мыть x1 с 1x PBS. Добавьте 500 мкл предварительно нагреты iCLM среды на лунку 24-луночного планшета.
    5. Заменить iCLM СМИ каждые 2 - 3 дня. Процесс пластины 14 дней после вирусной индукции для иммуноцитохимия (МУС) анализа сердечной перепрограммирования.

3. Иммуноокрашивание перепрограммирован MEFs

  1. 14 дней после индукции, тщательно аспирата СМИ.
  2. Промыть каждую лунку 300 мкл охлажденного на льду 1x PBS. Аспирируйте избыток раствора.
  3. Закрепить клетки с 250 мкл 4% -ного раствора параформальдегида (PFA) на лунку 24-луночного планшета. Инкубировать 15 мин при комнатной температуре.
    Примечание: Фиксированные клетки могут быть сохранены в PBS при 4 ° С в течение 1 - 2 недель перед окрашиванием.
  4. Проницаемыми клетки путем промывки скважин x3 с 300 мкл 0,1% PBS-Тритон 100 (PBST). Выдержите 5 минут при комнатной температуре между стирок. Аспирируйте избыток раствора после последней промывки.
  5. Блок для 10мин при комнатной температуре с 1x универсальный блок буфером при 300 мкл / лунку.
  6. Подготовить (ICC) буфера окрашивания: Добавить 1: 1 из 1x PBS и 1x Универсальный блокирующий буфер. Развести первичных антител в БЦХ буфере окрашивания и инкубировать антител в течение ночи при температуре 4 ° С. Обратитесь к разделу материала для рекомендуемых разведениях.
    1. Пятно одну пару слайдов с мышью альфа-актинин, ветряная αGFP и кролика NPPA для IPM и IAM идентификации.
    2. Пятно одну пару слайдов с помощью мыши альфа-актинин, курица αGFP и кролика Myl2 для IPM и IVM идентификации.
  7. На следующий день, мыть лунки x3 с 300 мкл 0,1% PBST. Выдержите 5 минут при комнатной температуре между стирок. Аспирируйте избыток раствора после последней промывки.
  8. Подготовка вторичных разведений антител в окрашивании ICC буфере. Обратитесь к разделу материала для рекомендуемых разведениях. Инкубируйте вторичными антителами 1 час при комнатной температуре, в защищенном от света.
    1. Пятно все слайды со следующим вторичным antibodies: мышь Alexa-555, курица Alexa-488, и кролик Alexa-647.
  9. Промыть лунки x3 с 300 мкл 0,1% PBST. Выдержите 5 минут при комнатной температуре между стирок. Защита от света.
  10. Добавить 2,4 мкл монтажными среды, содержащей 1,5 мкг / мл 4 ', 6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) на предметное стекло микроскопа. Осторожно удалите покровное из лунке 24-луночного планшета, удаления избытка раствора, и передать на предметное стекло с крепежными средствами массовой информации. Аккуратно нажмите покровное для удаления избытка объема и воздуха.
  11. Печать слайдов с предпочтительным лака для ногтей или пластиковым уплотнителем. Хранить слайды при 4 ° С в защищенном от света.

4. Идентификация сердечной подтипов Использование конфокальной микроскопии

ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения изображений, конфокальный микроскоп оснащен по меньшей мере, 2 флуоресцентных детекторов, способных спектрального детектирования при 405, 488, 555 и 639 нм длин волн необходимо для того, чтобы идентифицировать IPMS, Iams и IVMS. Imagе клетки, используя план-Apochromat 20X / 0.75 цели или лучше. Использование программного обеспечения для анализа изображений производителя, сканирование увеличить изображения можно добиться 40X-качества нефти погружения изображения.

  1. Библиотека изображений: принимать 8-битные изображения с DAPI, Alexa-488, Alexa-555 и Alexa-647 каналов (гл.). Пиксель время выдержки 6 с, 1024 размер кадра, линия шага на 2, и усреднение 2 достаточно для изображений с высоким разрешением.
  2. Для каждого слайда, начните с одного края и начать сканирование вверх и вниз в красный флуоресцентный канал (ч.) Для альфа-актинин + саркомера + клеток (на рисунке 3 и на рисунке 5А для примеров). Саркомера страты легче идентифицировать визуально в 555 нм.
    1. После того, как α-актинин + саркомера + клеток был идентифицирован, переключиться на зеленый гл. и держать внимание, если она положительна (IPM). Переключение на компьютер, чтобы оценить далеко красный 647 ч. (IAM или IVM).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ячейкиα-актинин + / саркомера + / Hnc4-GFP + / NPPA - / Myl2 - обозначаются как IPMS. Выражение GFP будет видно в течение всего клеточного (фиг.4А).
    2. Пятно слайды с альфа-актинин (мышь-Alexa555), Hcn4-GFP (курица-Alexa488), NPPA (кролик-Alexa647) и DAPI. Клетки , которые являются α-актинин + / саркомера + / Hnc4-GFP - / + NPPA являются IAM. NPPA окрашивание будет появляться перинуклеарного и (рисунок точечный 4B).
    3. Пятно слайды с альфа-актинин (мышь-Alexa555), Hcn4-GFP (курица-Alexa488), Myl2 (кролик-Alexa647). Клетки для положительных a-актинин + / саркомера + / Hnc4-GFP - / + Myl2 являются IVMS. Myl2 окрашивание будет демонстрировать исчерченную форму вдоль саркомера нити. Из -за различий в качества окрашивания и Z-плоскости, страты не всегда может быть легко видна (рис 4C).

5. квантификация

Примечание: Для того чтобы оценить реальное количество потенциально перепрограммировать MEFs, 2 лунки 24-луночного планшета высевают параллельно с экспериментальными скважин и собирают через один день после посева. Общее количество посеянных клеток затем определяется путем усреднения двух скважин. Это становится фактическим полным посеянных клеток (aTotal).

  1. саркомера +
    1. Осмотрите каждую ячейку на покровное для правильной альфа-актинин + / + саркомера (справа панели Рисунок 3) и записи (рис 5B-I).
    2. Сведите общее количество альфа-актинин + / + саркомера на каждом покровном и разделить на фактическое общее посеянных клеток (aTotal) (рис 5B-III). Например, если были альфа-актинины aTotal = 12500 клеток, а также 100 клеток + / + саркомера тогда, были перепрограммировать 0,8% от посеянных MEFs. В среднемreprograming эксперимент даст 1% альфа-актинин + / саркомера + клеток (рис 5в).
  2. Подтип +
    Примечание: Для следующих шагов, обратитесь к рисунку 5B / C для типичного рабочего процесса iCLM количественной оценки. Если коротко, то для каждого саркомера + клетки, в виде таблицы , если он уникален для любого подтипа (рис 5B-I). Подсчитайте% подтип (рис 5B-III) путем деления числа подтипа + клеток в течение среднего саркомера + -клеток х 100 (рис 5B-I). Для расчета абсолютной эффективности% подтипа (рис 5B-IV), делят подтипа + -клеток число от фиг.5В-I на общее число клеток , посеянных х 100 (фиг.5В-II).
    1. Для каждого из альфа-клеток актинин + / + саркомера, оценить , если они являются GFP +, NPPA +, или Myl2 +.
    2. Сведите общее количество альфа-актинин + / саркомера + / Hnc4-GFP + / NPPA - / Myl2 -, актинин + / саркомера + / Hnc4-GFP - / NPPA +, и α-актинин + / саркомера + / Hnc4-GFP - / Myl2 + клеток (рис 5B-I).
    3. Для того, чтобы вычислить процент каждого подтипа, необходимо разделить количество Подтип + клеток от общего количества альфа-актинин + / саркомера клетки + в этой лунке и умножить на 100. GHMT генерирует IPMS, Iams и IVMS примерно в равных соотношениях (рис 5B-III).
    4. Для того, чтобы вычислить абсолютное число подтипа + клеток, разделить общее число подтипа + клеток для экспериментальных услови х с помощью aTotal и умножить на 100 (Фиг.5В-II). В среднем IPMS составляют 0,3% от общего инфицированной клеточной популяции, Iams на 0,3%, аIVMS 0,25% (рис 5B-IV).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Воспользовавшись PM-специфической репортерной мыши, мы разработали мультиплекс стратегию Иммуноокрашивание для выявления различных эндогенных миоцитов , как показано на рисунке 1. После шагов перепрограммирования , показанные на рисунке 2, индукция специфических подтипов CMs могут быть обнаружены уже в 4 -й день 21, хотя и с низкой скоростью. К 14 -му дню, эксперимент может быть остановлен и оценивали саркомера организации

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Настоящее исследование представляет собой стратегию прямого перепрограммирования для превращения MEFs в разнообразный набор сердечных подтипов с помощью ретровируса-опосредованной экспрессии кардиального факторов транскрипции Gata4, MEF2C, Tbx5 и Hand2 (GHMT). Использование мультиплекс Иммуноокрашивание подход в сочетании с ПМ-специфической репортерной мыши, мы можем определить IAM, IVMS и IPMS в одной резолюции клетки. Такой анализ позволяет экспериментальной системы в пробирке , способной изолировать вклад от...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

A.F.-P. был поддержан стипендией Национального научного фонда для аспирантов в рамках гранта No2015165336. N.V.M был поддержан грантами от NIH (HL094699), Burroughs Wellcome Fund (1009838) и March of Dimes (#5-FY14-203). Мы выражаем признательность Янг-Чжэ Нам, Кристине Лубчик и Миноти Бхакте за их важный вклад в разработку протокола и анализ данных. Мы также благодарим Джона Шелтона за ценный технический вклад и членов лаборатории Мунши за научную дискуссию.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
DMEMSigmaD5796Компонент среды iCLM, среды Plat-E, фибробластов и трансфекционных сред
Среда 199Thermo Fisher Scientific11150059Компонент среды iCLM
Фетальная бычья сыворотка (FBS)SigmaF2442Компонент среды iCLM, среды Plat-E, фибробластов и трансфекционных сред
Инсулин-трансферрин-селен GThermo Fisher Scientific41400-045Компонент среды iCLM Раствор
витамина MEM ThermoFisher Scientific11120-052Компонент среды iCLM MEM
аминокислотыThermo Fisher Scientific1601149Компонент среды iCLM
Заменимые аминокислотыThermo Fisher Scientific11140-050Компонент среды iCLM
Антибиотик-антимикотикThermo Fisher Научный15240062Компонент среды iCLM
Добавка B-27 ThermoFisher Scientific17504044Компонент среды iCLM
Термоинактивированная лошадиная сывороткаThermo Fisher Scientific26050-088Компонент среды iCLM
NaPyruvateThermo Fisher Scientific11360-70Компонент среды iCLM
Пенициллин/СтрептомицинТермо Научный1514022Фишера Компонент сред Plat-E и фибробластов
Puromycin Thermo Fisher ScientificA11139-03Компонент Plat-E среды
Бластицидин   Gemini Bio-Products400-128PКомпонент среды Plat-E
GlutamaxThermo Fisher Scientific35050-061Компонент среды фибробластов
Конфокальный лазер сканирование LSM700ZeissДля конфокального анализа
Реагент для трансфекции FuGENE 6 РеагентPromegaE2692Реактив для трансфекции 
Opti-MEM Уменьшенная сыворотка MediumThermo Fisher Scientific31985-070Реагент для трансфекции 
PolybreneMilliporeTR-1003-GИндукционный реагент. Использовать при конечной концентрации 8 мкм; M/mL
Platinium-E (PE) Ретровирусная клеточная линия Packagin, EcotropicCellBiolabsRV-101Ретровирусная клеточная линия
Trypsin 0,25% EDTAThermo Fisher ScientificFor MEFs and Plat-E dissociation
Мышиный анти-альфа;-актинин (клон EA-53)SigmaA7811Антитела для конфокального анализа. Используйте в масштабе 1:200
антитела Chicken anti-GFP IgYThermo Fisher ScientificA10262для конфокального анализа. Используйте в 1:200
Rabbit Pab anti-NPPA AbgentAP8534AАнтитела для конфокального анализа. Используйте в 1:400
Rabbit Pab anti Myl2 IgG Антитело ProteinTech10906-1-APдля конфокального анализа. Использование в масштабе 1:200
Раствор Vectashield с DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)Vector LabsH-1500Краситель для конфокального анализа
Superfrost Plus Предметные стекла для микроскопаThermo Fisher Scientific12-550-1525 x 75 x 1,0 мм
BioCoat Fibronectin 12 мм покровные стеклаNeuVitro CorpGG-12-1.5Покровные стекла для конфокального анализа
100 μ m клеточный фильтрThermo Fisher Scientific08-771-19
0,45 μ m Шприцы фильтры SFCA 25MMThermo Fisher Scientific09-740-106Для фильтрации вирусов
6 мл ШприцыCovidien8881516937Для фильтрации вирусов
Goat Anti-Chicken IgY (H& L) A488AbcamAB150169Вторичное антитело для конфокального анализа. Использование в 1:400
Donkey Anti-rabbit A647 IgG(H+L) Thermo Fisher ScientificA31573Вторичное антитело для конфокального анализа. Используйте в соотношении 1:400
Козий антимышиный IgG(H+L) A555Thermo Fisher ScientificA21422Вторичное антитело для конфокального анализа. Используйте в 1:400
Triton X-100Sigma93443-100млДля пермеабилизации клеток 
PBS Dulbecco без CaCl2 и MgCl2 (D-PBS)SigmaD8537
Power Block 10x Универсальный блокирующий реагентThermo Fisher ScientificNC9495720Разбавить до 1x в H2O
16% Параформальдегидный водный раствор (PFA)Electro Microscopy Sciences 15710Использовать при 4% разбавленных в dH2O
6 см  планшетыOlympus25-260
6-луночные планшетыGenesee Scientific25-105
24-луночные планшетыGenesee Scientific25-107
10 см Чашки для культуры тканейCorning4239
15 см  Чашки для культивирования тканейThermo Fisher Scientific5442
15 мл Конические пробиркиCorning4308
50 мл Конические пробиркиCorning4249
0,4% раствор трипанового синего SigmaT8154Для жизнеспособности
Этиловый спирт 200 proofThermo Fisher Scientific7005
ОтбеливательThermo Fisher Научный6009

Ссылки

  1. Sissman, N. J. Developmental landmarks in cardiac morphogenesis: comparative chronology. Am J Cardiol. 25 (2), 141-148 (1970).
  2. Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells. Nat Rev Genet. 6 (11), 826-835 (2005).
  3. Ali, S. R., et al. Existing cardiomyocytes generate cardiomyocytes at a low rate after birth in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (24), 8850-8855 (2014).
  4. Bergmann, O., et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science. 324 (5923), 98-102 (2009).
  5. Senyo, S. E., et al. Mammalian heart renewal by pre-existing cardiomyocytes. Nature. 493 (7432), 433-436 (2013).
  6. Lin, Z., Pu, W. T. Strategies for cardiac regeneration and repair. Sci Transl Med. 6 (239), 239rv231(2014).
  7. Writing Group, M., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2016 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 133 (4), e38-e360 (2016).
  8. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  9. Song, K., et al. Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors. Nature. 485 (7400), 599-604 (2012).
  10. Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142 (3), 375-386 (2010).
  11. Qian, L., et al. In vivo reprogramming of murine cardiac fibroblasts into induced cardiomyocytes. Nature. 485 (7400), 593-598 (2012).
  12. Fu, J. D., et al. Direct reprogramming of human fibroblasts toward a cardiomyocyte-like state. Stem Cell Reports. 1 (3), 235-247 (2013).
  13. Zhou, H., Dickson, M. E., Kim, M. S., Bassel-Duby, R., Olson, E. N. Akt1/protein kinase B enhances transcriptional reprogramming of fibroblasts to functional cardiomyocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (38), 11864-11869 (2015).
  14. Zhou, Y., et al. Bmi1 Is a Key Epigenetic Barrier to Direct Cardiac Reprogramming. Cell Stem Cell. 18 (3), 382-395 (2016).
  15. Zhao, Y., et al. High-efficiency reprogramming of fibroblasts into cardiomyocytes requires suppression of pro-fibrotic signalling. Nat Commun. 6, 8243(2015).
  16. Miki, K., Yoshida, Y., Yamanaka, S. Making steady progress on direct cardiac reprogramming toward clinical application. Circ Res. 113 (1), 13-15 (2013).
  17. Atkinson, A., et al. Anatomical and molecular mapping of the left and right ventricular His-Purkinje conduction networks. J Mol Cell Cardiol. 51 (5), 689-701 (2011).
  18. Bootman, M. D., Smyrnias, I., Thul, R., Coombes, S., Roderick, H. L. Atrial cardiomyocyte calcium signalling. Biochim Biophys Acta. 1813 (5), 922-934 (2011).
  19. Miquerol, L., Beyer, S., Kelly, R. G. Establishment of the mouse ventricular conduction system. Cardiovasc Res. 91 (2), 232-242 (2011).
  20. Später, D., Hansson, E. M., Zangi, L., Chien, K. R. How to make a cardiomyocyte. Development. 141 (23), 4418-4431 (2014).
  21. Nam, Y. J., et al. Induction of diverse cardiac cell types by reprogramming fibroblasts with cardiac transcription factors. Development. 141 (22), 4267-4278 (2014).
  22. Conner, D. A. Current Protocols in Molecular Biology. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).
  23. Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. (64), (2012).
  24. Burns, J. C., Friedmann, T., Driever, W., Burrascano, M., Yee, J. K. Vesicular stomatitis virus G glycoprotein pseudotyped retroviral vectors: concentration to very high titer and efficient gene transfer into mammalian and nonmammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (17), 8033-8037 (1993).
  25. Ichim, C. V., Wells, R. A. Generation of high-titer viral preparations by concentration using successive rounds of ultracentrifugation. J Transl Med. 9, 137(2011).
  26. Qian, L., Berry, E. C., Fu, J. D., Ieda, M., Srivastava, D. Reprogramming of mouse fibroblasts into cardiomyocyte-like cells in vitro. Nat Protoc. 8 (6), 1204-1215 (2013).
  27. Yang, R., et al. Direct conversion of mouse and human fibroblasts to functional melanocytes by defined factors. Nat Commun. 5, 5807(2014).
  28. Muraoka, N., Ieda, M. Direct reprogramming of fibroblasts into myocytes to reverse fibrosis. Annu Rev Physiol. 76, 21-37 (2014).
  29. Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. Retroviruses. Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. , (1997).
  30. Bass, G. T., et al. Automated image analysis identifies signaling pathways regulating distinct signatures of cardiac myocyte hypertrophy. J Mol Cell Cardiol. 52 (5), 923-930 (2012).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

GHMT
Оценка кардиомиоцитов подтипов После Транскрипция фактор опосредованного перепрограммирования эмбриональных фибробластов мыши
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.