Здесь мы приводим протокол с учетом очистки ВЭЖХ, которая дает высокой чистоты бета-амилоида (42) и А 42 бета-40 (Aβ40) пептиды амилоида, способными к образованию олигомеров. Амилоида бета является весьма агрегация склонными, гидрофобный пептид участвует в болезни Альцгеймера. Амилоидогенный природа пептида делает его очищение вызов.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Очищением протокол заказуНаша ВЭЖХ, который дает высокой чистоты бета-амилоида 42 и бета-амилоида 40 Пептиды, способные олигомеров формирования
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Амилоидогенные пептиды, такие как бета-амилоид (Aβ), вызванный болезнью Альцгеймера, могут представлять значительную проблему при попытке получить материал высокой чистоты. В данной статье мы представляем адаптированный протокол очистки ВЭЖХ для получения пептидов бета-амилоида 42 (Aβ42) и бета-амилоида 40 высокой чистоты. Мы обнаружили, что комбинация коммерчески доступной гидрофобной поли(стирол/дивинилбензол) стационарной фазы, полимерной лабораторной обратной фазы - стиролдивинилбензола (PLRP-S) в условиях высокого рН, позволяет достичь высокой чистоты (>95%) Aβ42 за один хроматографический прогон. Очистка обладает высокой воспроизводимостью и может быть изменена как на полупрепаративные, так и на аналитические условия в зависимости от количества материала, который необходимо очистить. Протокол также может быть применен к пептиду Aβ40 с идентичным успехом и без необходимости изменения метода.
Введение
Болезнь Альцгеймера является нейродегенеративным расстройством, что эффекты, более 35 миллионов человек во всем мире. 1 сильно замешан в возникновении и развитии заболевания, является высоко агрегация склонными, гидрофобный пептид бета - амилоид (A & beta ; ). 2 A & beta ; в диапазоне от 36 до 43 аминокислот в длину, однако, полагают , что вариант 42-аминокислоты, бета - амилоида 42 ( А 42), является наиболее токсичным формой белка. 3 Это связано в основном со способностью к легко А 42 образовывать диффундирующие олигомерные видов, которые считаются особенно нейротоксические лица.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Препаративная ВЭЖХ Очистка Aβ40 или пептидом А 42
- Подготовьте следующие буферы для очистки ВЭЖХ.
- Готовят буфера А (20 мМ NH 4 OH), добавляя 1,3 мл NH 4 OH (28% раствор) до 1000 мл сверхчистой воды.
- Подготовка буфера В (80% ацетонитрила с 20 мМ NH 4 OH), добавляя 1,3 мл NH 4 OH (28% раствора) к раствору 800 мл ВЭЖХ класса ацетонитрила и 200 мл сверхчистой воды.
- Подготовка образца для растворения буфера (0,1% NH 4 OH) путем добавления 100 мкл NH 4 OH (28% раствор) до 100 мл сверхчистой воды.
- Установка прибора ВЭЖХ
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Очистку пептида А 42 с использованием комбинации стационарной фазы PLRP-S и высокое значение рН результаты мобильной фазы в формировании острого, разрешенного пика для пептида Ар при времени удерживания от 72 до 74 мин (фиг.2с). Подтверждение идентичности пика осуществляется путем прямой инжекции масс-спектрометрии собранного элюента. Очищенную можно хранить при -20 ° С в растворе до 12 ч. Продолжительном хранении может привести к окислению белка. Для выделения очищенног.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Очистку ЖХВД пептида Ар сильно зависит от выбора как стационарной фазы, используемой для очистки и подвижной фазы, выбранного для элюирования пептида. Низкая изоэлектрической точкой пептида и высокой склонностью к агрегации оказывают традиционные хроматографические условия для разделения гидрофобных белков (C4 или C8 стационарной фазы в сочетании с кислой подвижной элюента) сложной задачей, с пептидом A & beta; элюирование как пролонгированное широкая, не решен пик (рис 2А).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Благодарности
Авторы хотели бы поблагодарить за их компании Agilent технической помощи. Кейт Маркхэм и Рафаэль Паломино начисляются за их первоначальной помощи в области синтеза и очистки пептида Ар и д-р Hsiau-Вэй Ли выразил благодарность за помощь в подготовке Рисунок 1 рукописи.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Четвертичный насос Agilent 1260 Infinity II | Agilent | G7111B | http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-pumps-vacuum-degassers/1260-infinity-ii-quaternary-pump |
| Agilent 1260 Infinity II Двойной детектор переменной длины волны | Agilent | G7114A | http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-detectors/1260-infinity-ii-variable-wavelength-detector |
| Ручная форсунка Agilent 1260 Infinity II с петлей отбора проб из нержавеющей стали объемом 10 мл | Ручная | 0101-1232 | http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-injection-systems/1260-infinity-ii-manual-injector |
| ручная форсунка Agilent 1260 Infinity II с 20 & микро; L петля для образца из нержавеющей стали | Agilent | G1328C | http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-injection-systems/1260-infinity-ii-manual-injector |
| кольцо Кронштейн для монтажа на подставке | Agilent | 1400-3166 | |
| Agilent PLRP-S 300 Å 5 &микро; м 4,6 x 250 мм (аналитический) | Agilent | PL1512-5501 | http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-columns/biomolecule-separations/plrp-s-for-biomolecules#features |
| Aβ 42 или Aβ 40 пептид | Синтезирован на предприятии с использованием автоматизированного пептидного синтезатора CEM liberty. | ||
| Гидроксид аммония (NH4OH, 28% раствор) | Fisher Scientific | A669-500 | |
| Ацетонитрил | Fisher Scientific | A998-4 | |
| Класс ВЭЖХ для воды | Fisher | Scientific W5-4 | |
| Falcon 50 мл коническая центрифужная трубка | Fisher Scientific | 14-954-49A | |
| Supelco PEEK Фитинг цельный, шт. 5 шт. | Sigma-Aldrich | Z227250 | |
| Normject 5 cc стерильный шприц | Fisher Scientific | 1481729 | |
| 16 калибра SS игла | Rheodyne | 3725-086 |
Ссылки
- Querfurth, H. W., LaFerla, F. M. Alzheimer's Disease. N. Engl. J. Med. 362 (4), 329-344 (2010).
- McGowan, E., et al. Aβ42 Is Essential for Parenchymal and Vascular Amyloid Deposition in Mice. Neuron. 47 (2), 191-199 (2005).
- Gong, Y., et al. Alzheimer's disease....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
