Методическая статья

Очищением протокол заказуНаша ВЭЖХ, который дает высокой чистоты бета-амилоида 42 и бета-амилоида 40 Пептиды, способные олигомеров формирования

DOI:

10.3791/55482

⸱

27 марта 2017 г.

 ,  ,  , 
1Department of Chemistry, University of California, Santa Cruz

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы приводим протокол с учетом очистки ВЭЖХ, которая дает высокой чистоты бета-амилоида (42) и А 42 бета-40 (Aβ40) пептиды амилоида, способными к образованию олигомеров. Амилоида бета является весьма агрегация склонными, гидрофобный пептид участвует в болезни Альцгеймера. Амилоидогенный природа пептида делает его очищение вызов.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Амилоидогенные пептиды, такие как бета-амилоид (Aβ), вызванный болезнью Альцгеймера, могут представлять значительную проблему при попытке получить материал высокой чистоты. В данной статье мы представляем адаптированный протокол очистки ВЭЖХ для получения пептидов бета-амилоида 42 (Aβ42) и бета-амилоида 40 высокой чистоты. Мы обнаружили, что комбинация коммерчески доступной гидрофобной поли(стирол/дивинилбензол) стационарной фазы, полимерной лабораторной обратной фазы - стиролдивинилбензола (PLRP-S) в условиях высокого рН, позволяет достичь высокой чистоты (>95%) Aβ42 за один хроматографический прогон. Очистка обладает высокой воспроизводимостью и может быть изменена как на полупрепаративные, так и на аналитические условия в зависимости от количества материала, который необходимо очистить. Протокол также может быть применен к пептиду Aβ40 с идентичным успехом и без необходимости изменения метода.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Болезнь Альцгеймера является нейродегенеративным расстройством, что эффекты, более 35 миллионов человек во всем мире. 1 сильно замешан в возникновении и развитии заболевания, является высоко агрегация склонными, гидрофобный пептид бета - амилоид (A & beta ; ). 2 A & beta ; в диапазоне от 36 до 43 аминокислот в длину, однако, полагают , что вариант 42-аминокислоты, бета - амилоида 42 ( А 42), является наиболее токсичным формой белка. 3 Это связано в основном со способностью к легко А 42 образовывать диффундирующие олигомерные видов, которые считаются особенно нейротоксические лица. 4 Для того , чтобы углубить наше понимание пептида Ар, важно регулярно получать высокую чистоту материала. Наличие следов примесей было показано, резко изменить свойства агрегации Склонность пептида. 5

Traditionally, высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) разделение гидрофобных пептидов , таких как A & beta ; было сделано за счет использования комбинации C 4 или C 8 на основе диоксида кремния и стационарные фазы кислой подвижной фазы. 6 Тем не менее, такие условия могут представлять проблему для очистки пептида. Низкая изоэлектрической точкой пептида A (ИЭТ приблизительно 5,5) 7 означает , что в кислых условиях, агрегации пептидов увеличивается , и в результате широкие, без разрешенных пиков ВЭЖХ, которые часто трудно выделить производятся (фиг.2А). Кроме того, такие широкие пики часто содержат примеси, которые могут повлиять на профиль агрегации пептида, и обычно требует последующего раундов очистки, которые могут существенно повлиять на количество пептида, полученного.

Поли (стирол / дивинилбензол) стационарная фаза, PLRP-S, представляет собой альтернативное средство Purifлнение гидрофобные пептиды. Неподвижная фаза была использована при очистке ряда различных белков и мессенджеров рибонуклеиновых кислот (мРНК). 8, 9 Неподвижная фаза PLRP-S не требует дополнительного алкильный лиганд для обратного разделения фаз, и что более важно , является химически стабильным при высоких рН , что приводит к дезагрегации пептида. 7 Здесь мы приводим протокол с учетом очистки ВЭЖХ , которая дает высокой чистоты бета - амилоида (42) и А 42 бета - 40 (Aβ40) пептиды амилоида.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Препаративная ВЭЖХ Очистка Aβ40 или пептидом А 42

  1. Подготовьте следующие буферы для очистки ВЭЖХ.
    1. Готовят буфера А (20 мМ NH 4 OH), добавляя 1,3 мл NH 4 OH (28% раствор) до 1000 мл сверхчистой воды.
    2. Подготовка буфера В (80% ацетонитрила с 20 мМ NH 4 OH), добавляя 1,3 мл NH 4 OH (28% раствора) к раствору 800 мл ВЭЖХ класса ацетонитрила и 200 мл сверхчистой воды.
    3. Подготовка образца для растворения буфера (0,1% NH 4 OH) путем добавления 100 мкл NH 4 OH (28% раствор) до 100 мл сверхчистой воды.
  2. Установка прибора ВЭЖХ , как показано на рисунке 1.
    1. Установить бутылки с растворителем, которые содержат буфер А и буфер В на входы ВЭЖХ насоса с использованием полимерных труб. Прикрепите полимерную трубку к HPLC насос с цельным Подгонка. Убедитесь в том, что полимерные трубы изКаждый буфер установлен на правильный входной клапан прибора. Установить ВЭЖХ насоса с дегазатор.
    2. Пара ВЭЖХ насос с впускным отверстием 300 ангстрем мкм 25 препаративной колонке 300 мм 8 мм х (Фигура 1В, далеко левый столбец, см список материалов) с использованием полимерной трубки.
      1. Прикрепите полимерную трубку к препаративной колонке с цельным пальца плотно облегающей. Убедитесь, что колонна полимер ориентирован правильным образом.
        Примечание: Стационарная фаза препаративной колонке состоит из поли (стирол-дивинилбензола) частиц. Правильную ориентацию колонны полимера отмечено на внешнем корпусе с одной стрелкой.
    3. Подключите выход колонки к двойственной детектора длины волны с использованием полимерной трубки и установить детектор длины волны до 214 нм и 280 нм.
      1. Alter длину волны путем изменения параметров длины волны детектирования в методе настройки прибора выборувстроенное программное обеспечение высокоэффективной жидкостной хроматографии.
    4. Приложить полимерную трубку к впускному отверстию детектора длины волны с цельным пальца плотно облегающей. Приложить полимерной трубки к выходному клапану детектора длины волны. Прикрепите полимерную трубку к выходному отверстию клапана детектора ВЭЖХ с цельным пальца плотно облегающей. Это будет сбор образцов труб.
      Примечание: Отсутствие сильного хромофора на пептиде Ар диктует, что 214 нм можно использовать в качестве основного ультрафиолетовое (УФ) длины волны для пика сбора.

figure-protocol-1
Рисунок 1: Экспериментальная установка прибора ВЭЖХ , используемого для очистки амилоидного бета пептидов. (A) четвертичной ВЭЖХ насос оснащен дегазатор и детектора с переменной длиной волны , установленной на 214 нм и 280 нм; (В) для ВЭЖХ колонки использовали для очистки амилоидного бета пептидов, изслева направо, 25 х 300 мм 2 колонка большого , 7,5 х 300 мм 2 полу колонка большого и 4,6 х 250 мм 2 аналитическую колонку; (C) Ручной инжектор с 20 мкл петли из нержавеющей стали , используемой для инжекционного аналитической ВЭЖХ; (D) Ручной инжектор с 10 мл из нержавеющей стали петли впрыска , используемого для препаративной и полуприцепа препаративной очистки. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

  1. Программирование программного обеспечения ВЭЖХ для запуска способа очистки , как это показано в таблице 1. Ввод способа очистки путем изменения растворителя параметр расписание (в опции способ установки прибора , встроенного в программное обеспечение для ВЭЖХ). Включите HPLC насос, нажав на кнопку "ON" на программное обеспечение высокоэффективной жидкостной хроматографии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Насос начнет подачу исходного соотношения буфера А и буфер B через препarative колонки и ВЭЖХ инструмент.
    1. Оставьте систему в течение 30 мин до полного уравновешивания.
Время / мин % Буфера A A % Буфера B B Расход d / мл мин -1
0 80 20 6
45 75,5 24.5 6
45.01 80 20 6
52.01 80 20 6
52.02 73 27 6
85 73 27 6
92 5 95 гр 6

<сильный> Таблица 1: График очистки пептидов и Aβ40 А 42 с использованием полимерной колонки мм в 25 × 300. буферным А - Н 2 O 20 мМ NH 4 OH; б 80% MeCN / 20% H 2 O 20 мМ NH 4 OH; с Ран в течение 15 мин , чтобы вымыть колонку до начала следующей инъекции образца; d Для запуска скорости потока 6 мл / мин на ВЭЖХ - измерительных приборов, предельное давление должно быть снижено до 200 бар.

  1. В результате очистки пептида образец Ар
    Примечание: Сырой пептид был получен с помощью автоматизированного синтеза пептидов в твердой фазе. 10
    1. Растворите 3 мг неочищенного пептида в Ар 4 мл буфера для образца растворения. Разрушать ультразвуком образца в течение 30-60 с при комнатной температуре и при частоте 40 кГц, чтобы способствовать растворению.
    2. Вводят весь образец на колонку высокоэффективной жидкостной хроматографии с помощью пластикового шприца 5 мл, снабженную 16 мм,стальная игла из нержавеющей стали. Выполнить метод очистки, как описано в подэтапа 1.3.
      Примечание: Система позволяет образец впрыска быть сделано с помощью ручного инжектора , установленного в камере из нержавеющей стали , впрыск топлива 10 мл (рис 1D). Нужный A & beta ; пептид будет элюции между 72 и 74 мин в виде острого пика разрешенного (фиг.2с).
    3. Собирают пробу в коническую центрифужную пробирку на 50 мл. Подтверждение идентичности пика Ар путем прямого впрыска масс-спектрометрии собранного элюента. 11 Магазин Очищенную на срок до 12 часов при -20 ° С.
      Примечание: Хранение раствора на срок более 12 ч не рекомендуется из-за возможного окисления пептида.
    4. Изолируйте очищенного пептида с помощью флэш-замораживание собранной аликвоты / аликвоты пептида Ар в жидком азоте и лиофилизуют. Выполните лиофилизации с помощью сушки вымораживанием образца при температуре от -60 ° С и вруверен в 20 мТорр в течение 24 часов.
    5. Выполните аналитический протокол ВЭЖХ, как указано ниже для определения чистоты пептида Ар. пептиды Хранить в их лиофилизированном виде при -20 ° С в течение периода до 6 месяцев.

2. Аналитический ВЭЖХ-анализ белка Очищенный Ар

  1. Подготовка ВЭЖХ буферов, как описано в подразделе 1.1. указанного выше протокола.
  2. Настройка аналитической ВЭЖХ в соответствии с шагом 1.2.1 и , как показано на рисунке 1 с аналитической колонке 4,6 × 250 мм (рис 1В, далеко правый столбец) и ручной инжектор с 20 мкл петли из нержавеющей стали впрыска (Рисунок 1C) , приспособленный к инструмент.
  3. Программирование программное обеспечение высокоэффективной жидкостной хроматографии , чтобы запустить аналитический метод , как показано в таблице 2 , в соответствии с инструкциями , аналогичные тем , на этапе 1.3.
Время /мин % Буфера A A % Буфера B B Расходная / мл мин -1
0 95 5 1
30 50 50 1

Таблица 2: График для анализа чистоты ВЭЖХ пептида Ар. буферным А - Н 2 O 20 мМ NH 4 OH; б 80% MeCN / 20% H 2 O 20 мМ NH 4 OH.

  1. Чистоту анализ пептида Ар
    1. Приготовьте 1 мг / мл раствора очищенного пептида путем растворения пептида в растворе образца буфера.
      Примечание: Рецепт буфер можно найти в подразделе 1.1. Концентрацию белка определяют путем измерения поглощения белка при 280 нм (А 280 нм). 12 м коэффициент Olar экстинкции (ε) используется для определения концентрации ε = 1490 дм 3 моль -1 см -1. 13
    2. Вводят 20 мкл раствора 1 мг / мл (222 мкМ) на колонку для ВЭЖХ и запустить аналитический метод, который был установки на шаге 2.3.
      Примечание: Оставшийся раствор не используется для анализа могут быть заморожены в жидком азоте и лиофилизуют для восстановления пептида А. Детали лиофилизации можно найти в подразделе 1.4.4. Пептида A & beta ; будет вымывается из аналитической колонки между 16 и 18 мин (рис 2D). С помощью встроенного программного обеспечения для анализа интеграции, сопровождающий прибор ВЭЖХ для определения чистоты пептида Ар. Чистота определяется путем интегрирования каждого из отдельных пиков на спектре и вычисление пептид-пик процентах площади. Как правило, очистка> 95% должно быть установлено.

figure-protocol-2"Рисунок 2" SRC = "/ файлы / ftp_upload / 55482 / 55482fig2.jpg" />
Рисунок 2: Представитель ВЭЖХ следы А 42. Очистка (А) Традиционный С 4 кремнезем, условия: буфер А: H 2 O с 0,1% трифторуксусной кислоты (ТФУ), буфер Б: MeCN (ацетонитрил) , с 0,1% TFA, градиент: от 20 до 27% буфера В в течение 40 мин с последующим изократическим 27% буфера В; (Б) Препаративная очистка с использованием 25 х 300 мм 2 полимерную колонку с, условия: буфер А: H 2 O , 20 мМ NH 4 OH, буфер Б: 80% MeCN / 20% H 2 O 20 мМ NH 4 OH, градиент : от 20 до 27% буфера в в течение 70 мин с последующим изократическим 27% буфера в; (С) Оптимизированное препаративного очистки с использованием 2 мм полимерной колонки на 25 х 300, условия описаны в таблице 1 , расположенной в подразделе 1.3 протокола описания текста; (D) Аналитическая ВЭЖХ с использованием 4,6 х 250 мм 2 полимера колонки, кондitions: Буфер A: H 2 O с 20 мМ NH 4 OH, буфер Б: 80% MeCN / 20% H 2 O с 20 мМ NH 4 OH, градиент от 5 до 50% буфера В в течение 30 мин. Для частей А, В и С пик, соответствующий отмечен А 42 звездочкой. Сбор отмеченной пика частично А 42 С показывает чистоту> 95%, как показано в части D. Масс-спектрометрия была использована для определения идентичности пика А 42. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Очистку пептида А 42 с использованием комбинации стационарной фазы PLRP-S и высокое значение рН результаты мобильной фазы в формировании острого, разрешенного пика для пептида Ар при времени удерживания от 72 до 74 мин (фиг.2с). Подтверждение идентичности пика осуществляется путем прямой инжекции масс-спектрометрии собранного элюента. Очищенную можно хранить при -20 ° С в растворе до 12 ч. Продолжительном хранении может привести к окислению белка. Для выделения очищенног...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Очистку ЖХВД пептида Ар сильно зависит от выбора как стационарной фазы, используемой для очистки и подвижной фазы, выбранного для элюирования пептида. Низкая изоэлектрической точкой пептида и высокой склонностью к агрегации оказывают традиционные хроматографические условия для разделения гидрофобных белков (C4 или C8 стационарной фазы в сочетании с кислой подвижной элюента) сложной задачей, с пептидом A & beta; элюирование как пролонгированное широкая, не решен пик (рис 2А).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы хотели бы поблагодарить за их компании Agilent технической помощи. Кейт Маркхэм и Рафаэль Паломино начисляются за их первоначальной помощи в области синтеза и очистки пептида Ар и д-р Hsiau-Вэй Ли выразил благодарность за помощь в подготовке Рисунок 1 рукописи.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Четвертичный насос Agilent 1260 Infinity IIAgilentG7111Bhttp://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-pumps-vacuum-degassers/1260-infinity-ii-quaternary-pump
Agilent 1260 Infinity II Двойной детектор переменной длины волныAgilentG7114Ahttp://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-detectors/1260-infinity-ii-variable-wavelength-detector
Ручная форсунка Agilent 1260 Infinity II с петлей отбора проб из нержавеющей стали объемом 10 млРучная0101-1232http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-injection-systems/1260-infinity-ii-manual-injector
ручная форсунка Agilent 1260 Infinity II с 20 & микро; L петля для образца из нержавеющей сталиAgilentG1328Chttp://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-injection-systems/1260-infinity-ii-manual-injector
кольцо Кронштейн для монтажа на подставкеAgilent1400-3166
Agilent PLRP-S 300 Å 5  &микро; м 4,6 x 250 мм (аналитический)AgilentPL1512-5501http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-columns/biomolecule-separations/plrp-s-for-biomolecules#features
Aβ 42 или Aβ 40 пептидСинтезирован на предприятии с использованием автоматизированного пептидного синтезатора CEM liberty.
Гидроксид аммония (NH4OH, 28% раствор)Fisher ScientificA669-500
АцетонитрилFisher ScientificA998-4
Класс ВЭЖХ для водыFisherScientific W5-4
Falcon 50 мл коническая центрифужная трубкаFisher Scientific14-954-49A
Supelco PEEK Фитинг цельный, шт. 5 шт.Sigma-AldrichZ227250
Normject 5  cc стерильный шприцFisher Scientific1481729
16 калибра SS иглаRheodyne3725-086
форсунка Agilent

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Querfurth, H. W., LaFerla, F. M. Alzheimer's Disease. N. Engl. J. Med. 362 (4), 329-344 (2010).
  2. McGowan, E., et al. Aβ42 Is Essential for Parenchymal and Vascular Amyloid Deposition in Mice. Neuron. 47 (2), 191-199 (2005).
  3. Gong, Y., et al. Alzheimer's disease-affected brain: Presence of oligomeric Aβ ligands (ADDLs) suggests a molecular basis for reversible memory loss. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100 (18), 10417-10422 (2003).
  4. Selkoe, D. J. Soluble Oligomers of the Amyloid β-Protein Impair Synaptic Plasticity and Behavior. Behav Brain Res. 192 (1), 106-113 (2008).
  5. Zagorski, M. G., Yang, J., Shao, H., Ma, K., Zeng, H., Hong, A. Methodological and Chemical Factors Affecting Amyloid β Peptide Amyloidogenicity. Methods Enzymol. 309, 189-204 (1999).
  6. Kim, W., Hecht, M. H. Mutations Enhance the Aggregation Propensity of the Alzheimer's Aβ Peptide. J Mol Bio. 377 (2), 565-574 (2008).
  7. Fezoui, Y., et al. An improved method of preparing the amyloid beta-protein for fibrillogenesis and neurotoxicity experiments. Amyloid. 7 (3), 166-178 (2000).
  8. Zhelev, N. Z., Barratt, M. J., Mahadevan, L. C. Use of reversed-phase high-performance liquid chromatography on polystyrene-divinylbenzene columns for the rapid separation and purification of acid-soluble nuclear proteins. J Chromatogr A. 763 (1-2), 65-70 (1997).
  9. Thess, A., et al. Sequence-engineered mRNA Without Chemical Nucleoside Modifications Enables an Effective Protein Therapy in Large Animals. Mol Ther. 23 (9), 1456-1464 (2015).
  10. Warner, C. J. A., Dutta, S., Foley, A. R., Raskatov, J. A. Introduction of D-glutamate at a critical residue of Aβ42 stabilizes a pre-fibrillary aggregate with enhanced toxicity. Chem Eur J. 22 (34), 11967-11970 (2016).
  11. Thompson, J. A., Lim, T. K., Barrow, C. J. On-line High-performance Liquid Chromatography/Mass Spectrometric Investigation of Amyloid-β Peptide Variants Found in Alzheimer's Disease. Rapid Commun. Mass Spectrom. 13 (23), 2348-2351 (1999).
  12. Layne, E. Spectrophotometric and turbidimetric methods for measuring proteins. Met. Enzymology. 3, 447-455 (1957).
  13. Ioannou, J. C., Donald, A. M., Tromp, R. H. Characterizing the secondary structure changes occurring in high density systems of BLG dissolved in aqueous pH 3 buffer. Food Hydro. 46, 216-225 (2015).
  14. Rahimi, F., Maiti, P., Bitan, G. Photo-Induced Cross-Linking of Unmodified Proteins (PICUP) Applied to Amyloidogenic Peptides. J. Vis. Exp. (23), e1071(2009).
  15. Bitan, G., Kirkitadze, M. D., Lomakin, A., Vollers, S. S., Benedek, G. B., Teplow, D. B. Amyloid β-protein (Aβ) assembly: Aβ40 and Aβ42 oligomerize through distinct pathways. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100 (1), 330-335 (2003).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

pH

Похожие статьи