Запись ЭЭГ в свободно перемещающихся крысах новорожденных с использованием нового метода

Хорошо известно, что для получения нормальной функции мозга требуется непрерывная связь между нейронами. Межнейронная связь в основном происходит в синапсах, где информация от одного нейрона передается второму нейрону. Эта синаптическая передача опосредуется двумя типами специальных структур: электрическими или химическими синапсами ¹ . Электрофизиология - это область, которая фиксирует электрический потенциал, возникающий во время межнейронной коммуникации, который контролирует общие функции и поведение организма ² . ЭЭГ является наиболее часто используемым методом среди многих электрофизиологических методов.

ЭЭГ - метод, используемый для обнаружения изменений электрических сигналов, создаваемых внутренними или внешними стимулами. Кроме того, это важный тест для клинической диагностики и прогноза исходов различных неврологических состояний, таких как эпилепсия, болезнь Паркинсона и болезнь АльцгеймераЕ, а также эффекты фармакологических и токсикологических агентов ³ . Как правило, эпилептический пациент проявляет гипервозбудимость и нарушение функциональной связности в головном мозге; Они суммируются как интериктальные эпилептиформные разряды (ИЭУ) и могут регистрироваться ЭЭГ в виде резких переходных скачков; Острые волны; Комплексы спайк-волн; Или полиспасты ⁴ . Главной особенностью эпилептического мозга является спонтанное возникновение эпилептических припадков, которые могут быть записаны либо с головы, либо из паренхимы головного мозга, чтобы определить местонахождение области мозга, ответственной за приступы ⁵ . Кроме того, ЭЭГ также имеет очень важные последствия в нейродегенеративных расстройствах, таких как болезнь Альцгеймера (AD). Исследования показывают, что измененные записи ЭЭГ и нарушения осцилляторных сетей у пациентов с АД являются общими. Однако наши знания о патофизиологии колебаний сети при нейродегенеративных заболеваниях iУдивительно неполной и нуждается в дальнейшем изучении ⁶ .

В этом протоколе мы разработали простой электрод, с помощью которого можно записывать ЭЭГ, чтобы понять электрическую связь как в нормальном, так и в патологическом мозге. Хирургическая имплантация в этом методе дешевле, чем другие доступные процедуры. ⁷ . Более того, этот метод может быть использован для записи высококачественных и стабильных сигналов ЭЭГ на более длительные временные рамки ( т.е. 2-4 часа в день в течение 1 недели). Кроме того, мы использовали более легкие электроды (весом около 26 мг), которые позволяют животным вести себя более естественно ⁸ . Этот метод широко применим для изучения ЭЭГ у новорожденных крысят новорожденных, для которых требуется усилитель и дигитайзер, обычно используемые в электрофизиологической лаборатории и не требующие дополнительных устройств.

Уход за животными, хирургические процедуры и процедуры регистрации соответствовали руководящим принципам Комитета по уходу и использованию животных Южно-Китайского педагогического университета.

1. Подготовка электродов (фигура 1A-C)

ПРИМЕЧАНИЕ. Локальные контакты на компьютере - это просто контактный контакт в качестве части интерфейса сигнала в устройствах связи. Он состоит из штекерного разъема, который вставляется в гнездовой разъем.

1. Тщательно отделите штырьки мужского и женского пола от лоскутов пальцев компьютера ( рис. 1A ) с помощью клещей. Соедините штыри мужского и женского пола вместе, чтобы сформировать электрод, и нанесите цианоакрилат, чтобы создать прочную адгезионную связь ( рис. 1С ).
2. Поместите электроды в стакан, наполненный дистиллированной водой, и поместите его в ультразвуковой очиститель на 10 мин. Переместите их в сушильную печь при 45 ° C в течение 30 минут. Стерилизовать электроды с помощью УФ-излучения в течение 30 мин.

2. Хирургическая процедура (рис. 1D-F)

1. Подготовьте стерилизованные хирургические инструменты и стереотаксическую аппаратуру. Анестезируйте щенка новорожденных крыс, используя изофлуран анестезию (2,5%) с воздухом. Когда щенок подвергается глубокой анестезии, отрегулируйте дозу изофлурана до 1,0%. Выполняйте хвост или пальцы на ноге перед операцией, чтобы обеспечить надлежащую глубину анестезии.
2. Закрепите головку щенка в стереотаксическом аппарате, поместив ушные штанги в ушные каналы и слегка затянув их.
   ПРИМЕЧАНИЕ. Не чрезмерно затягивайте ушные штанги, так как череп новорожденного очень мягкий.
3. Поддерживайте стерильное хирургическое поле, распыляя все оборудование с 70% этанолом. Сделайте разрез 15 мм на голове с помощью скальпеля. Используя щипцы, аккуратно вытяните кожу головы от средней линии на четырех углах. Нанесите пропитанный физиологическим раствором хлопок под кожу, чтобы разрез был широко открыт ( рис. 1D ).
4. Найдите точки брегмы и лямбды на черепеИ пометьте их карандашом. Используйте иглу шприца (26 G), чтобы сделать два отверстия заусенцев в префронтальной коре (PFC) и гиппокампе.
   ПРИМЕЧАНИЕ. ПФУ располагается на расстоянии +1,8 мм сзади от брегмы и -0,5 мм в поперечном направлении от средней линии, в то время как гиппокамп расположен на -2,0 мм впереди брегмы и ± 0,5 мм в поперечном направлении от средней линии ( рис. 1D и E ). Глубина электрода должна быть не более чем на 2 мм ниже поверхности коры, чтобы минимизировать повреждение головного мозга.
5. Используйте щипцы для удержания электродов и вставьте контрольные и записывающие электроды в ПФУ и гиппокамп, соответственно. Применить эритромицин мазь вокруг электрода, чтобы избежать любой возможной инфекции. Закрепите электрод с помощью цианакрилата.
6. Подготовьте зубной акриловый цемент так, чтобы он имел клеевую и вязкую консистенцию. Нанесите зубной цемент, чтобы покрыть электроды и остальную часть черепа.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Тщательно высушите череп перед нанесением зубного цемента. Нанесите 5% -ную пикриновую кислоту на электроды, чтобы защитить их.
   ПРИМЕЧАНИЕ. Вся процедура должна проводиться в вытяжном шкафу для поддержания стерильности.
7. Удалите животное из стереотаксической рамки и введете 300 мкл 10% глюкозы подкожно. Поместите его на обогреваемое одеяло для восстановления. Убедитесь, что животное теплое (37 ° C) и амбулаторное ( т.е. полностью выздоровевшее). Администрирование бупренорфин внутрибрюшинно (0,05 мг / кг) для послеоперационной боли.
   ПРИМЕЧАНИЕ. Не оставляйте животное без присмотра, пока оно не восстановит достаточное сознание (т.е. нормальное поведение и движение).
8. Верните щенка в его клетку с плотиной после того, как она вернется в сознание. Подождите два дня, пока животное не будет полностью выздоровело.

3. Запись ЭЭГ

1. После полного восстановления подсоедините электроды, имплантированные на черепе щенка, к усилителю в его собственной клетке. Подключите усилитель к аналогово-цифровому вИнвертор и присоедините преобразователь к компьютеру; Соединительные линии должны быть тщательно обработаны, чтобы они не запутались.
2. Выберите частоту дискретизации не менее 10000 Гц на блоке сбора данных для записи (полоса пропускания передатчика составляет 1-100 Гц). Убедитесь, что данные правильно взяты.
3. После получения базовой записи, вводите щенка внутрибрюшинно с помощью каиновой кислоты (KA) (2 мг / кг), чтобы вызвать эпилептические приступы. Через 15 мин после инъекции KA наблюдают и записывают эпилептические разряды. Приступы выработки через КА обычно являются физическими.
   ПРИМЕЧАНИЕ. Длительность иктально-тонического воздействия составляет около 15,2 ± 0,9 с, продолжительность схватывания составляет примерно 62 ± 5 с. Приступы могут быть предотвращены у новорожденных крыс, давая IP инъекцию хлоралгидрата (400 мг / кг).
4. Сохраните оцифрованные данные и проанализируйте их с помощью пакетов программ обработки сигналов, таких как spike2. Выявить уровень мощности различных частотных компонентов в сигнале ЭЭГ новорожденных путем перфорацииЧто позволяет проводить анализ спектра мощности. Вычислите мощность в 1-минутном таймфрейме, найдя среднеквадратичную амплитуду от 1 до 100 Гц (диапазон ЭЭГ) ⁹ .

Если вышеуказанные хирургические процедуры будут проведены должным образом, будет выполнена успешная запись ЭЭГ на один канал крысы новорожденного крысы. Через 10 минут после инъекции KA в виде нерегулярных движений и царапин, тремора и потери равновесия появляется регулярная картина поведенческих признаков. На рисунке 2 показаны типичные следы ЭЭГ-сыворотки и интериктальные, иктально-тонические и иктально-клонические расширенные следы. Периодические межприступные и иктальные ЭЭГ разряды начинались через 15-60 мин (30 ± 5,2 мин, среднее ± SEM) после инъекции KA ( фиг. 2А и 2В ). Рисунок 2D и 2E представляют тонико-клонические припадки, которые являются наиболее распространенным типом. Продолжительность иктально-тонического воздействия составляла 15,2 ± 0,9 с ( рисунок 2D ). Репрезентативные результаты показали, что за тоническими разрядами следуют клонические всплески ( рис. 2B, 2D и 2E).

D / 55489 / 55489fig2.jpg "/>
Рисунок 2: KA-индуцированный неонатальный припадок. ( A ) Репрезентативный ЭЭГ-след от крысы P10, которую инъецировали KA (2 мг / кг, внутрибрюшинно), показал рецидивные эпилептические всплески. ( B ) Расширенный вид единичных кластерных эпилептических разрядов из ящика в A. ( C , D и E ) Типичные интериктальные, иктально-тонические и иктально-клонические следы расширены из коробки в B. ( F ) Обобщенные данные, показывающие Средняя мощность ЭЭГ (1 мин. Окно времени) до и после инъекции КА (среднее ± SEM). Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Настройка записи ЭЭГ. Репрезентативная запись трассировкиWn в свободно перемещающемся щенке новорожденных крыс. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Авторы объявили, что нет никаких конфликтов интересов.