Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

В визуализации in vivo трансгенной экспрессии генов в Персональной Ретинального прародителей в химерных эмбрионов данио рерио по изучению мобильных неавтономных Влияния

7.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/55490

⸱

22 марта 2017 г.

 ,  ,  , 
1School of Biosciences, The University of Melbourne, 2Australian Regenerative Medicine Institute (ARMI), Monash University, 3The David J Apple Center for Vision Research, Department of Ophthalmology, Heidelberg University

В этой статье

Краткое содержание

Живая отслеживание отдельных WT клеток-предшественников сетчатки в различных генетических фонов позволяет для оценки вклада клеток неавтономных сигнализации во время нейрогенеза. Здесь, сочетание гена нокдаун, химеры поколения с помощью трансплантации эмбрионов и в естественных условиях покадровой конфокальной микроскопии был использован для этой цели.

Аннотация

Генетические и технические достоинства сделали данио позвоночное ключевой модель организма , в котором последствия генных манипуляций можно проследить в естественных условиях в течение всего периода быстрого развития. Несколько процессов могут быть изучены в том числе пролиферацию клеток, экспрессию генов, миграции клеток и морфогенеза. Важно отметить, что образование химер с помощью трансплантаций могут быть легко выполнены, что позволяет маркировки мозаики и отслеживание отдельных клеток под воздействием принимающей среды. Например, путем комбинирования функциональных генов манипуляциями хозяина эмбриона (например, посредством морфолино микроинъекции) и живого изображения, эффекты примесной, клеточные сигналы неавтономные (предоставляемые генетически модифицированной среды) , на отдельных пересаженных донорских клеток могут быть оценены. Здесь показано, как этот подход используется для сравнения начало флуоресцентного трансгенной экспрессии как прокси-сервер для синхронизации клеточных судеб determinвания в различных средах генетический хост.

В этой статье мы предлагаем протокол для microinjecting эмбрионов данио , чтобы отметить донорских клеток и вызывать ген нокдаун в принимающих эмбрионов, описание методики трансплантации , используемой для получения химерных эмбрионов, а также протокол для подготовки и проведения в естественных условиях покадровой конфокальной визуализация нескольких эмбрионов. В частности, выполняя функции многопозиционного визуализации имеет решающее значение при сравнении времени событий, таких как начало экспрессии генов. Это требует сбора данных из нескольких контрольных и экспериментальных эмбрионов, обработанных одновременно. Такой подход может быть легко расширена для изучения внешних воздействий в любом органе или ткани выбора доступной для живого изображения, при условии, что трансплантация может быть легко направлены в соответствии с установленными эмбриональных карт судьбы.

Введение

Способность визуализировать важные процессы развития в в естественных условиях позвоночных животных способствовало делает данио ключевую модель для изучения нормальных и болезненных условий (обзор в 1, 2). В частности, нейронная сетчатка является доступной частью центральной нервной системы. Сетчатка поддается легко выполнять исследования нейрогенеза в связи с его высокоорганизованной, все же относительно простую структуру, и его высоко консервативных типов нейронов через 3 видов позвоночных. Динамика клеточных поведения, таких как пролиферация, выхода из клеточного цикла, асимметричного деления клеток, спецификации судьбы, дифференциации и формирования нейронной электрической схемы можно проследить на протяжении всего процесса ретиногенеза, который завершается в центральной сетчатки данио на 3 г после оплодотворения ( DPF) 4, 5,исх "> 6, 7.

Кроме того, функциональные требования различных генов в каждом из указанных выше этапов могут быть одновременно оценены в данио сетчатки, обеспечивая преимущество по сравнению с другими позвоночными моделями, в которых фенотипы в результате применения методов нокаут гена может быть оценена только после аутопсии фиксированных тканей. В частности, использование трансгенных линий, в которых мы можем визуализировать и контролировать экспрессию флуоресцентных белков как репортер трансгенов в сетчатке, позволяет получить временное разрешение экспрессии гена, лежащего в основе генезиса определенного нейронного типа клеток. В связи с быстрым развитием данио, эти события могут быть визуализированы в течение всего периода развития, тем самым обеспечивая более глубокое понимание важности временной экспрессии генов в связи с приобретением нейрональной идентичности клеток и поведения клеток.

И, наконец, эти подходы могут быть объединены эффективно в данио рерио, при генерации химер через трансплантаций, в результате проникновения в суть двух ключевых аспектов функции гена. Во-первых, исследуя клетки, пересаженные от донора эмбриона, в котором конкретный ген был нокдаун в то время как они развиваются в среде немеченного дикого типа, позволяет получить необходимую информацию о функции гена в клетке-автономным способом. Это приводит к важным более глубокое представление о функции сетчатки глаза факторов судьбы определителем внутри клеток - предшественников , они , как правило , выражается в. Это можно проиллюстрировать на примере рассмотрения развития исхода судьбы клеток - предшественников , которые больше не могут генерировать функциональный белок из этих генов 4, 6, 8, 9. Используя этот подход, мы показали , что многие судьбы определяющих факторов (например, vsx1, Atoh7, Ptf1a, Barhl2) действуют ячейки-autonomously водить специфические нейронные сетчатку судьбы; отсутствие экспрессии генов в первую очередь , приводит к судьбы переключателя, таким образом, что клетки с геном нокдауна сохраняют жизнеспособность путем принятия альтернативной клеточной судьбы 4, 6, 7, 10. Во-вторых, такие химерные эксперименты могут быть использованы для оценки того, как дикого типа клетки-предшественники ведут себя, когда они развиваются в различных генетических средах. Например, путем сравнения развития клеток WT , которые обычно выражают представляющий интерес ген (и репортер трансгена) в WT в сравнении манипуляций среде хоста (например, ген Нокаут / бросовой), которые воздействуют на экспрессию генов и судьбу клетки могут быть оценены , Отсутствие определенных типов нейронов в принимающей среде, например, было показано, что влияние на поведение клеток-предшественников дикого типа в клетке неавтономных образом, чтобы смещать их к дифференцировке в недопредставленного Oг отсутствуют типы нейронные 4, 7, 11, 12. Учитывая , что нейроны сетчатки рождаются в консервативном histogenic порядке по последовательно приуроченной экспрессии специфических нейрональных генов судьбы определитель (экспрессии генов судьбы) (обзор в 13), мы использовали эти методы , чтобы продемонстрировать , как выбор времени экспрессии генов судьба в предшественниках дикого типа влияет, когда такие клетки-предшественники развиваются в сетчатку средах хозяев с индуцированными аберрантных клеточных композиций. Здесь мы опишем эти подходы в качестве доказательства для того, как сочетание относительно стандартных и широко используемых методов позволяет изучение сроков экспрессии генов судьбы в развитии клеток - предшественников ретинальных 8, 9.

Этот протокол описывает экспериментальный подход, включающий покадровой обработки изображений с легкостью вформирование трансплантации в естественных условиях экс развивающегося эмбриона данио следовать отдельному мозаично меченых клеток на протяжении всего периода ретиногенеза развития. Выполняя функциональные манипуляции генов либо в принимающем зародыша, донора эмбриона, оба или ни, можно оценить автономию клеток функции гена. Такой подход может быть широко адаптировано для аналогичных исследовательских вопросов в любой другой системе, для которых отдельные компоненты, описанные здесь, являются подходящими.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все процедуры были проведены в соответствии с положениями Австралийского Национального исследовательского совета по здравоохранению и медицинским кодекс практики по уходу и использованию животных и были одобрены институциональными комитетами по этике.

1. Приготовление данио рерио

  1. Взрослые рыбы спаривание
    1. Установить взрослую рыбу в виде пар (или две пары) в селекционных надлежащего размера резервуаров вечером перед использованием.
    2. Для того, чтобы держать женщину, отделенную от самца, использовать делитель для того, чтобы рыбу, чтобы увидеть, но не касаются друг друга.
    3. Утром, после включения света, снимите разделители и дайте рыбе спариваться спокойно.
    4. После успешного спаривания поместить взрослую рыбу обратно в свои оригинальные танки.
      Примечание: Узлы сети и донорные штаммы могут быть одинаковыми, например, любые дикого типа (WT) штаммами. Для этого исследования эмбрионов - доноров полученные из трансгенных линий Tg (atoh7: gapRFP), Tg (atoh7: gapGFP) илиТд (vsx1: GFP) , в котором выражение факторов судьба определителем вождения рано или поздно нейронная судьбы могут быть визуализированы, соответственно 14, 15, 16. Для того чтобы сравнить эффекты различной генетической среды, принимающих эмбрионы могут быть конкретные мутанты или морфанты, как описано ниже.
  2. коллекция Эмбрион
    1. Используйте ситечко, чтобы собрать яйца из коробки разведения. Проверить яйца каждые 15 минут, чтобы определить время рождения и обеспечить эмбрионов стадии одноклеточные собираются для последующих шагов.
    2. Промыть эмбрионы с средой E3 (5 мМ NaCl, 0,2 мМ KCl, 0,4 мМ CaCl 2, 0,9 мМ MgCl 2 и 2% метиленового синего в дистиллированной воде) и поместить их в чашки Петри , содержащие ~ 40 мл E3 17 при максимальной плотности 50 яиц на 90 мм диаметр чашки Петри.
    3. Этикетка чашки Петри с именем штамма, дату и времярождение. С помощью пипетки Пастера передачи для удаления мусора при просмотре эмбрионов под рассекает микроскопом.
    4. Держите эмбрионов на 28,5 ° С до ~ 3 ч (ФВЧ после оплодотворения) для трансплантации, или продолжить микроинъекций.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для трансплантаций, стремиться к доноров и принимающих эмбрионов на сходных возрастов. Таким образом, используют различные температуры выращивания между 25 - 32 ° C в соответствии с Kimmel и соавт. 18 , чтобы замедлить или ускорить одно сцепление эмбрионов , чтобы соответствовать другим.
    5. Держите ~ 20 из трансгенных эмбрионов-доноров не неинъецированных при 32 ° С с момента сбора до покадровой съемки (24 - 28 ч позже).
      Примечание: Они будут развиваться быстрее, чем экспериментальная когорты и выразит флуоресцентные маркеры ранее. Таким образом, они могут быть использованы для настройки параметров (мощность лазера, усиление) для формирования изображения. В этом конкретном примере, визуализация экспериментальной когорты начинается до трансгенной экспрессии (для оценкиточные сроки этого события).

2. Подготовка к микроинъекции

  1. подготовка Микроинъекция иглы
    1. С помощью иглы съемника, чтобы вытащить иглы из каждого из боросиликатного стекла капиллярной трубки (1,0 мм OD / 0,78 мм ID / 100 мм длиной стеклянного капилляра) в центре, чтобы получить две иглы одинаковой длины. Цель для игл, которые сужаются с длинными валами.
      Примечание: Пример настройки для иглы съемник используется здесь поставляются в Список материалов.
    2. Хранить растянутой иглы в чашке Петри и зафиксировать, нажав их в полосу формовочную замазки или клейкой ленты.
    3. Перед инъекцией довести кончик иглы в фокусе под микроскопом рассекает и использовать пинцет, чтобы взломать иглу на конце. Цель для острого конического наконечника с небольшим отверстием (рис 1C).
  2. подготовка Morpholino для принимающих эмбрионов
    1. Заказать морфолино олигонуклеотиды, специально предназначенные для представляющего интерес гена, а также стандартного управления морфолино или соответствующего рассогласования 5 пар оснований для контроля за процедурных и обработки эффектами.
      Примечание: В данном случае перевод блокирующий Ptf1a морфолино с последовательностью 5'-TTGCCCAGTAACAACAATCGCCTAC-3 ', что тормозит развитие промежуточных рожденных горизонтальных и амакринных клеток, и стандартный контроль данио морфолино нацеливание бета-глобина мутации интрон человека (5'-CCTCTTACCTCAGTTACAATTTATA -3 ') 7, 19 были использованы.
    2. Подготовьте 1 мМ морфолино исходного раствора (~ 8 - 8,5 нг / нл) и хранить при комнатной температуре.
    3. В день инъекции, нагревать аликвоту (10 мкл) морфолино при 65 ° С в течение 10 мин, на короткое время и место спина на льду, чтобы остыть от 65 ° C (после чего его можно хранить при комнатной температуре во время использования). Thэто будет возмещена любой потенциально агрегации в растворе морфолино, который может снизить эффективность нокдауна.
      1. Для Ptf1a морфолино и эквивалентной стандартной контрольной морфолино, готовят рабочий раствор 6 нг / нл путем разбавления морфолино маточного раствора с дистиллированной водой. Хранить при комнатной температуре.
        Примечание: Используйте 2 нл морфолино на эмбрион в качестве Ptf1a морфолино требует относительно высокой рабочей концентрации 12 нг на эмбрион , как определено ранее 7. Для большинства Morpholinos, 2 - 5 нг на эмбриона является эффективным, поэтому разбавлять запас до 2 - 5 нг / НЛ и вводят 1 Н.Л. в каждого эмбриона.
  3. Подготовка флуоресцентный гистонов фьюжн репортеру конструкции для эмбрионов-доноров маркировки
    Примечание: Для того, чтобы различать / визуализировать донорских клеток в принимающих эмбрионов, существуют разные подходы к этикетке донора эмбриона, в том числе микроинъекции H2A-GFP (при использовании трансгенных доноров скрасные флуоресцентные репортеры) или Н2В-RFP (при использовании трансгенных доноров с зелеными репортерами флуоресцентных) мРНК в желток одноклеточного эмбриона донора стадии.
    1. Линеаризацию по меньшей мере, 1 мкг плазмиды, содержащей ДНК-репортер.
      Примечание: Здесь шт.2 + плазмида (сгенерирован и любезно предоставленный профессором Дэвидом Тернером из Университета Мичигана и профессор Ральф Рапп из биомедицинской центр Мюнхена), содержащий H2A-GFP или H2B-RFP (созданный доктором Кристофером Уилкинсон, Royal Holloway, Лондонский университет) линеаризовали NotI ферментами рестрикции.
    2. Очищают ДНК с использованием коммерчески доступных наборов в соответствии с инструкциями изготовителя.
    3. Расшифруйте мРНК с использованием коммерчески доступных наборов с соответствующими полимеразой в соответствии с инструкциями изготовителя. Для получения плазмиды шт.2 +, используют набор SP6 полимеразы.
    4. Очищают мРНК с использованием коммерческих наборов или экстракции фенолом-хлороформом с последующим осаждением изопропанолом в соответствии с инструкцией производителяs. Растворите мРНК в сверхчистой воде (20 - 30 мкл), измеряют концентрацию с помощью спектрофотометра и хранят при -80 ° С.
    5. В день инъекции, готовят рабочий раствор мРНК в стерильной воде с конечной концентрацией 100 нг / мкл, и держать на льду. Убирайте неиспользованную мРНК запас обратно до -80 ° C.

3. Микроинъекция Morpholinos и / или мРНК в одноклеточные стадии Эмбрионы

Примечание: Микроинъекции используются для обозначения всех донорских клеток и для подготовки различных сред - хозяев (контроль и ген нокдаун) и включают инъекции мРНК или морфолино антисмысловых олигонуклеотидов 20, 21.

  1. Загрузка и калибровки инъекционной иглой
    1. Backload инъекционной иглой с 3 мкл морфолино и / или гистона-флуоресцентный раствора мРНК слитого с использованием microloader пипеток.
    2. Встряхнуть Solutиона к кончику инъекционной иглы, пока не осталось пузырьков. Используйте иглы для инъекций с внутренней стеклянной вставкой, что решение будет в первую очередь обращается к кончику под действием капиллярных сил.
    3. Прикрепите инъекционной иглы к держателю, установленный в микроманипулятора (3D ручной микроманипулятора) и обеспечивают герметичное уплотнение внутри корпуса трубки.
    4. Включите питание и газоснабжение давления регулируется microinjector.
    5. Погрузить кончик иглы в каплю минерального масла в чашке (при использовании координатной сетки окуляра) или зависать кончик иглы непосредственно над стрелочным горкой для калибровки объема капли. Измерьте объем впрыска, нажав на педаль и регулировки давления газа и / или продолжительность времени, пока объем впрыска не эквивалентен 1 нл (диаметр 125 мкм).
      Примечание: Преимущество микрометра слайда является то, что измерения не зависят от увеличения используемого в микроскопе, однако при использовании окуляр картографической сетки иновTEAD, падение впрыска и масштаб может быть в фокусе одновременно.
  2. Эмбрион микроинъекции
    1. Поместите предметное стекло в чашку Петри и использовать пипетки передачи на хранение эмбрионов стадии одноклеточных вдоль края слайда. Совместите в одну колонку, используя наконечник пипетки microloader с половиной тонкий кончик отрезанной. Удалите так много жидкости , как это возможно с помощью тонкой пипетки передачи для предотвращения движения во время инъекции (рис 1А).
    2. Опустите иглу в направлении каждого эмбриона, а также проникают через хориона и желток одним плавным ходом (рис 1B).
    3. После того, как кончик иглы находится в центре желтка, microinject нажатием на педаль. Вводят 1 нл H2A-GFP или мРНК Н2В-RFP в желток одноклеточного эмбриона донора стадии (трансгенного). Вводят 2 Н.Л. стандартного МО или Ptf1a МО в желток сценического одноклеточного дикого типа эмбриона хозяина, нажав на педаль дважды. Успешные инъекции могут быть визуализированы с помощью Smal л пространственная деформация в желтке.
    4. Снимите инъекционную иглу, переместить блюдо, содержащее эмбрионов, чтобы принести следующий эмбриона в исходное положение и продолжать инъекции, пока весь столбец эмбрионов не вводили (50 - 60 эмбрионов).
    5. После введения всех эмбрионов, поднимите тарелку вверх на 30 - 45 ° углом и использовать мягкий поток E3 среды (сжимающей бутылки) для переноса эмбрионов, инъецированные в новую чистую чашку Петри.
    6. Поместите эмбрион блюдо в инкубаторе (либо при 28,5 ° C или другой температуре, чтобы гарантировать, что доноров и принимающих эмбрионы в эквивалентных возрастов).
    7. Повторите шаги 3.2.1 - 3.2.6 по мере необходимости, чтобы получить ~ 100 эмбрионов донора или 200 ~ - 250 принимающих эмбрионов.
    8. На 1 - 2 часов после оплодотворения, проверьте эмбрионов под микроскопом рассекает и удалите неоплодотворенные яйца, которые еще не вышли в 2- или 4-клеточных стадий с передачей пипетки Пастера.

4. Подготовка к трансплантаций

ontent "> Примечание: Трансплантации используются для создания химерных эмбрионов , допускающие воздействия различных средах генетический принимающих быть оценены в пределах эквивалентных клеток - предшественников доноров WT 9, 22, 23.

  1. Выбор эмбрионов донора
    1. В 3-х часов после оплодотворения, проверьте эмбрионов доноров на 2 - 5x увеличением для сигнала маркировки под флуоресцентным микроскопом. Выберите хорошо развитую (симметричную клеточную массу с одинакового размера клеток) эмбрионов с сильным флуоресцентного сигнала с использованием GFP плюс фильтр (460-500 нм возбуждения, 510 нм эмиссия длинный пас) или Texas Red фильтра (540 - 580 нм возбуждения, 610 нм эмиссия длинный пас) (рис 1D). Трансгенные журналисты еще не выражены.
  2. Агарозном пластина инъекции и подготовка чашку Петри
    1. Залить расплавленным 2% агарозы, разбавленного в E3 среды в чашки Петри диаметром 90 мм и дайте ему остыть, пока блюдо не является безопаснымтрогать. Горячий агарозы в противном случае могут деформировать форму.
    2. Поплавок пластиковую форму с клиновидными выступами (6 х 25 / гниль) на агарозы (рис 2D, Е). Избегайте пузырьков воздуха путем размещения на одной стороне литейной формы на агарозе и медленно опустить вниз с другой стороны. Убедитесь, что пресс-форма находится в центре блюдо или в сторону самой глубокой точки клинообразных выступов, чтобы обеспечить достаточное пространство зазора для трансплантации иглы.
    3. Разрешить агарозном полностью затвердеть при комнатной температуре.
    4. Поместите агарозном блюдо при 4 ° С в течение 30 мин и удалить пресс - формы, осторожно поднимая из одного угла (например, пинцетом). Подготовка агарозном инъекций пластин день до эксперимента и хранить при температуре 4 ° С с небольшим объемом E3 уплотнения средней и парафиновой пленки, чтобы предотвратить их от высыхания.
    5. До трансплантации, заполнить агарозном инъекции пластину с E3 среды и поместить в 28,5 ° C инкубаторе в течение не менее 30 мин.
    6. Так как dechorionated эмбрионов придерживаться пластика, либо использовать стеклянные тарелки или пальто внутри чашки Петри (диаметром 90 мм) с тонким слоем 2% агарозы в Е3. Подготовьте одно блюдо для dechorionated эмбрионов хозяев, одно блюдо для dechorionated эмбрионов-доноров и одно блюдо на каждые 40 пересаженных эмбрионов. Хранить, как описано для инъекционного пластины (4.2.4).
  3. Подготовка пипетки передачи
    1. Обрежьте кончик длинной формы мелко вытащил стеклянный наконечник пипетки Пастера (2 мл объема, мм длина 230, длиной 100 мм наконечник) в длину, что позволяет для комфортного маневрирования (по желанию), царапая с алмазным ножом, пока не вращая до кончика падений выкл (рис 1F).
    2. Убедитесь в том, что разрез прямой. Огонь польский стекло пипетки передачи, вращая поверхность среза в горелку для создания гладких концов так, чтобы не повредить dechorionated эмбрионов (рис 1F).
      Примечание: Удерживая наконечник пипетки в пламени слишком долго шзаболел результат в открытии герметизировать вверх или становится слишком маленьким для эмбрионов.
  4. Dechorionating бластула стадии доноров и принимающих эмбрионов
    1. Dechorionate эмбрионы либо вручную , с двумя тонким пинцетом, оторвав открыть каждый хорион , не касаясь эмбрион, или ферментативно с помощью протеаз , чтобы позволить одновременное быстрое dechorionation большого количества зародышей 9.
      1. Приготовьте 100x исходного раствора 50 мг смеси протеазы / мл, составляют 100 мкл аликвоты и хранить их при температуре -20 ° С.
      2. Добавьте 100 мкл основного протеазу до 10 мл среды E3 (конечная концентрация 0,5 мг / мл протеазы).
      3. Поместите хорошо развитые хозяина и доноров эмбрионов в двух отдельных небольших Эрленмейера стеклянных стаканах (10 мл) и удалить как можно больше жидкости, как это возможно.
      4. Добавить 5 мл раствора 0,5 мг / мл в протеаз к каждому стакану и слегка встряхните эмбрионов, а глядя на них под микроскопом рассекает, Следите за любые признаки деформации хориона.
      5. Keep завихрение. Как только первый эмбрион из хориона (рис 1D, отмеченные звездочкой), выполнять три быстрых цикла полоскания с E3 среды для удаления раствора протеазы, выливая большую часть жидкости и заправки колбу аккуратно вливать Е3 вдоль стороны. Не позволяйте dechorionated эмбрионы войти в контакт с воздухом в любой из последующих шагов до конца трансплантации (раздел 5), так как они лопнут. Оставьте адекватное решение в колбе между полосканий.
      6. С отожженной переноса стеклянной пипетки, передача эмбрионов из стакана Эрленмейера в стеклянные чашки Петри или агарозы (2% в E3 среде) с покрытием пластиковой посуды. Аккуратно пипеткой во время передачи, чтобы удалить оставшиеся ослабленные хориона.
  5. Подготовка Трансплантация иглы
    1. С помощью иглы съемника, чтобы вытащить две иглы из каждой боросиликатного тонкие стенки стеклянной трубки (1,0 мм OD/ 0,78 мм ID / длина 100 мм) с теми же параметрами, как микроинъекции пипеток.
      Примечание: Пример настройки для иглы съемник используется здесь поставляются в списке материалов. Трансплантаций иглы не имеют стеклянную вставку, так как это повреждает клетки засасывается в иглу.
    2. Вытащите иглы заранее, хранить в чашку Петри и зафиксировать, нажав в полосу формовочной замазкой или клейкой лентой.
    3. До трансплантации довести кончик иглы в фокусе под микроскопом рассекает и использовать пинцет, чтобы взломать иглу на конце. Используйте тонкий пинцет , чтобы скорректировать форму иглы , чтобы стремиться к флейте форме (рисунок 2G), или использовать альтернативные методы , описанные для создания формы 23 наконечника.

5. Химера Поколение через бластулы трансплантологии

  1. настройка Трансплантация
    Примечание: В данном случае был использован самособранные трансплантацию аппарат (рис 2А ).
    1. Установите трансплантацию иглу в том же самом держателе иглы , используемой для микроинъекции выше (монтируется на микроманипулятора, шаг 3.1.3) (рис 2А).
    2. Отсоедините инъекционного трубку, которая связывает конец держателя микропипетки к microinjector давления регулируется используемой для микроинъекций. Приложить инъекционной трубки , который связан с 1 мл шприц (рис 2А, В), которая представляет собой трансплантацию буровой установки.
      1. Убедитесь, что все соединения плотно герметизированы с использованием парафиновой пленки или формовочной замазку. Предотвратить эмбрионов от контакта с воздухом, гарантируя, что всегда есть E3 среда в самой трансплантации иглы. Используйте шприц вручную, чтобы сосать клеток / жидкость в и из трансплантационной иглы.
  2. Эмбрион выравнивание
    1. Перенос эмбрионов донора с стеклянной пипеткой в ​​первую колонку агарозы пресс-формы. Передача хозяев эмбрионов в колонках 2до 6 агарозы формы (рис 2F). Поместите эмбрионы с пипеткой так, чтобы сторона бластомеров была обращена вверх.
  3. трансплантация
    1. Осторожно отдохнуть трансплантации иглу на бластомеров в клетки донора эмбриона и медленно высосать около 20 - 50 клеток в трансплантационной иглы (рис 2H). Избегайте сосать желток.
    2. Поднимите трансплантацию иглу из эмбриона донора с использованием микроманипулятора. Перемещение агарозном формы блюдо влево и вставьте кончик иглы Пересадка через боковую сторону клеточной массы в животное полюс первого эмбриона хозяина. Депозит 5 - 10 клеток вблизи поверхности в зависимости от судьбы отображения , показывая , что эта область приводит к области переднего мозга / глаз 24 (Рисунок 2i). Держите кончик иглы, погруженного в среде E3 на протяжении всей процедуры.
  4. Уход за пересаженных эмбрионов
    1. Удалите доноров эмбрионов Aе покидают хозяина эмбрионов в агарозном форме в течение 1 - 2 ч при 28,5 ° С. Заполните стеклянные или пластиковые (покрытые 2% агарозы) чашки Петри со средой E3, содержащей 0,003% N-фенилтиомочевину (PTU), чтобы предотвратить образование пигмента, так как это будет мешать визуализации. Передача хозяев эмбрионов в эти блюда с огнем полированного стекла пипеткой и инкубировать при температуре 28,5 ° CO / N.
      ВНИМАНИЕ: Надевайте перчатки при работе с PTU.

6. Установка Живая съемка

ПРИМЕЧАНИЕ: Небольшой размер и оптическая прозрачность данио в сочетании с быстрым развитием позволили ей стать ключевым модель позвоночное для визуализации в естественных условиях различных клеток и органов. Такая операция может выполняться по различным микроскопов, которые будут отличаться по настройке и параметрам. Ниже описаны подходящие настройки конфокальной микроскопии для визуализации развития сетчатки 5, 8.

  1. химерных эмбрионоввыбор
    1. Через 24 - 26 часов после оплодотворения, экран пересаженные эмбрионы под флуоресцентным объем рассекает, чтобы выбрать здоровые хорошо развитые эмбрионы, которые показывают пересаженных донорских клеток (H2A-GFP или H2B-RFP меченых) в развивающемся зачатке глаза.
    2. Отложенный до 40 эмбрионов для монтажа пипеткой в ​​новую чашку и добавляют 0,4 мг / мл Tricaine methanesulfate (MS222) анестезировать эмбрионов.
      ВНИМАНИЕ: Надевайте перчатки при работе с MS222.
  2. Монтаж эмбрионов
    Примечание: Используйте соответствующие монтажные блюдо, в зависимости от того, будет ли выполняться визуализация на перевернутом 8 или вертикального микроскопа (описано здесь).
    1. Приготовьте несколько 1,5 мл пластиковые пробирки, содержащие 1 мл 1% агарозном низкой расплава в 0,4 мг / мл MS222 в E3 среды и поддерживать расплавленный на водяной бане 40 ° C.
    2. Сосать до 5 эмбрионов в пипетки для переноса пластиковой и пусть эмбрионы накапливаются в наконечнике под действием силы тяжести. Нажмите пипетки передачина поверхности одного из подготовленных пластиковые пробирки, содержащие 1% агарозы с низкой текучести расплава и 0,4 мг / мл MS222 позволяет эмбрионы тонуть в трубку во время ограничивая объем передачи E3.
    3. Маунт-эмбрионы в 90 мм диаметром чашки Петри для работы с изображениями в вертикальном микроскопом и со стеклянным дном чашки Петри (любого размера) для работы с изображениями в инвертированным микроскопом. Используйте постоянный маркер, чтобы визуально разделить либо блюдо на две половины доноров изображения в составе хозяев WT (на одной стороне) или morphant хостов (с другой стороны) в том же самом эксперименте.
    4. Перенесите пять эмбрионов из пластиковой трубки агарозном либо чашку Петри с 0,5 - 1 мл агарозы. Удалите излишки агарозы с пипетки передачи таким образом, что только небольшое падение (~ 200 - 300 мкл) остается. Если изображения с вертикальной микроскопии, избегать размещения эмбрионов в 1 см от окружности чашки Петри. Погружением в воду окунать объектив , используемый для формирования изображения не может быть в состоянии быть сосредоточены в этой области из - за тарелки стенки Петри (Фигура 3А </ Сильный>).
    5. Используйте microloading пипетку (с наконечником разорвавшейся), чтобы выровнять эмбрионы в боковом направлении, пока агарозном затвердевает. Для обоих типов блюд, эмбрионы в боковом направлении под углом правильно , если оба глаза по обе стороны от головы полностью перекрываются (выровнен в размерности XY) (фигура 3В). Для перевернутой использования микроскопии, глаз вблизи покровного должен быть выдвинут как можно ближе к покровным, насколько это возможно, чтобы включить визуализацию через Z-измерения в пределах ограничений возможных уровней фокусировки.
    6. Продолжить монтаж пять эмбрионов в то время, в отдельных агарозном капель. Использование более 1% агарозы с низкой расплава , чтобы присоединиться к агарозы капли друг к другу и в сторону тарелки , чтобы предотвратить любое оплывание и боковое перемещение во время формирования изображения (фиг.3А).
    7. После того, как полностью затвердевший, накройте блюдо с E3 среда (содержит 0,003% PTU, 0,4 мг / мл MS222), предварительно нагретую до 28,5 ° С.
    8. Используя тот же подход, описанный в пунктах 6.2.2- 6.2.8, крепление ~ 20 трансгенные эмбрионы, поднятые при 32 ° C (этап 1.2.5) в отдельном блюде.
  3. параметры изображения
    Примечание: Визуализация анализировать возникновение флуоресцентного трансгенов не требует высокого пространственного разрешения внутриклеточный. Она может быть выполнена с целью W План-Apochromat 20X / 1,0 ДИК M27 70 мм при 1,5 трансфокации.
    1. Настройка времени мощности лазера и экспозиции на основе интенсивности трансгенов для ~ 20 трансгенных эмбрионов с ускоренным развитием (т.е. поднятых при 32 ° C, шаг 6.2.8).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для изучения начала экспрессии трансгенов, экспериментальные эмбрионы не проявляют флуоресценции в то время, когда в заданный промежуток времени устанавливается и, таким образом, эти ускоренные эмбрионы имеют решающее значение для определения параметров изображения.
    2. Для экспериментального блюда, визуализировать каждый эмбрион и сохранить позицию и сосредоточиться уровни эмбрионов.
      1. Выберите эмбрионы , которые имеют правильный угол монтажа (т.е. с боковой сязь глаза как по горизонтали, как это возможно) и сильное сердцебиение (показатель здоровья). Выберите эмбрионов с нескольких клеток пересаживали доноров (определенных H2A-GFP или маркировки Н2В-RFP) , в основном в передней брюшной квадранте развивающейся сетчатки (где начинается волна экспрессии генов) (рис 3C).
        Примечание: В эмбрионов данио, средняя HeartRate составляет 120 - 180 ударов / мин 25. В наркозом эмбрионов, здоровый сердцебиение может быть в пределах от 60 - 120 ударов / мин. Более медленное сердцебиение может свидетельствовать о пониженной жизнеспособности и эти эмбрионы должны быть исключены из исследования.
    3. Установите Z-стеки оптических срезов с интервалом 2 мкм через сетчатку до 15 эмбрионов.
      Примечание: Общее количество эмбрионов, которые могут быть отображенных в любом данном эксперименте, будет зависеть от индивидуальных параметров (времени экспозиции и размера Z-стека). Время, затраченное на изображение 1 временной точке для всех выбранных эмбрионов должны быть шorter чем интервал между моментами времени. Жертвуя некоторое разрешение по глубине, больше эмбрионов могут быть отображены в пределах временных интервалов. Пределы Z-стека выбраны в качестве латеральной и медиальной крайностями смонтированном эмбрионов глаза и 30 мкм добавляется к боковой стороне в вертикальном установке микроскопии, как глаза развивающихся эмбрионов в этой настройке сдвига в направлении г, как эмбрионы растут в течение ночи. Это приводит к стеками 100 - 170 мкм толщиной (50 - 85 изображений / глаз).
    4. Делать снимки каждые 24 мин при 32 ° С (эквивалент 0,5 HPF интервалов) с использованием соответствующего лазера / канала к трансгенов.
      Примечание: Эмбрионы остаются на сцене в течение всего времени перерыва в нагретой камере, охватывающей весь микроскоп. Хотя эксперимент может проводиться при температуре 28 ° С, более теплые температуры используются для ускорения разработки и обеспечить, чтобы соответствующие моменты времени в эксперименте изображаются в пределах 16 - 24-часового периода времени покадровой.
    5. Образканалы, представляющие метку донора (H2A-GFP или H2B-ЗП - по желанию) и трансген (Atoh7: ЗП или vsx1: GFP) с использованием последовательного сканирования. Для анализа используют метку донора только выбрать соответствующие зародыши, как описано (один по выбору Z-стек в начале формирования изображения), а затем выполнять времени покадровой только на канале, чтобы захватить экспрессию трансгена.
      Примечание: В качестве альтернативы, используйте ярлык донора только для выбора соответствующих эмбрионов (то есть те , с подтвержденными трансплантированных клеток в передней брюшной квадранте) и изображения только канала трансгенов, примерно сокращение вдвое времени формирования изображений и почти в два раза количество эмбрионов , которые могут быть изображаемых и проанализированы в эксперимент (рисунок 4).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Эта работа представляет собой экспериментальный протокол для оценки изменений в сроках экспрессии генов, когда клетки-предшественники сетчатки дикого типа развиваются в morphant эмбриона хозяина. Экспериментальные эмбрионы хозяева Ptf1a морфанты, которые испытывают недостаток в промежуточных рожденных горизонтальных и амакринных интернейронов сетчатки 7, 26. Они были по сравнению с контрольными хозяев эмбрионов, которые были введ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Понимание того, в какой степени влияют на соседние клетки времени экспрессии решающим клеточных судеб определяющих факторов имеет важное значение при прицеливании эффективно инструктировать эмбриональные или индуцированные мультипотентны стволовых клеток дифференцироваться в определенный тип постмитотическими клеток или даже узорной ткани. Кроме того, изучение этих молекулярных событий в развивающихся клетках живого животного дополнительно обеспечивает соответствующую динамику (временную и пространственную) информацию о...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана ARC Decra к Prj (DE120101311) и исследовательский грант Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) в LP (PO 1440 / 1-1). Австралийский регенеративной медицины Институт финансируется за счет средств от правительства штата Виктория и австралийского федерального правительства. Мы признаем , Доктор Джереми Ng Chi Kei, который проводил эксперименты , описанные здесь, опубликованной в Kei и др. 2016 г. Мы благодарны за положения трансгенной рыбы от профессора Higashijima и благодарят Profs. Тернер и Рапп для предоставления шт.2 + плазмиды и доктора Уилкинсона для генерации Н2В-RFP и H2A-GFP конструкции. Мы благодарим сотрудников объекта FishCore (Monash University) за заботу о наших животных.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
AgaroseBiolineBIO-41025Посуда с агарозным покрытием может быть приготовлена за несколько дней до приготовления, запечатана парапленкой для предотвращения высыхания и храниться при температуре 4 ° C
Агароза с низким содержанием расплаваSigmaA9414-100Gможет быть приготовлена в большем объеме, разогрета в микроволновой печи для сжижения, а затем храниться в расплавленном состоянии при температуре 40 ° C водяная баня. Можно приготовить 1 мл аликвот (по одной на каждую группу эмбрионов).
капиллярная трубка из боросилликатного стекла без нитиSDR Scientfic30-0035с аналогичными диаметрами могут быть использованы;
Капиллярная трубка из боросилликатного стекла с нитью накалаSDR Scientfic30-0038с аналогичными диаметрами 
стеклянные чашки Петри (диаметр 60 мм)Science Supply1070506любой альтернативы стеклу любого размера
Инъекционная трубка (2 м)Eppendorf524616004Это соединяет иглодержатель со шприцем во время трансплантации
Форма для микроинъекций (пластиковая форма с клиновидными выступами)Адаптивные научные инструментыPT-1альтернативы с аналогичной формой могут быть использованы
с помощью микроиглы держательNarishigeM-152любой альтернативой, которая подходит по внешнему диаметру инъекционных игл, может быть использован
микроинъекторNarishige или пневматический инжектор Eppendorf Femtojetс использованием
микроманипуляторадавления газа Coherent ScientificM330IRаналогичные альтернативы могут быть использованы
микрозагрузчик наконечникаEppendorf5242956003
Минеральное маслоSigmaM5904-500ML
иглосъемникSutter InstrumentsModel P-2000Настройки, используемые для этого съемника: H 430, Fil 4, Vel 50, Del 225, Pul 75. Можно использовать любой иглосъемник, если он приводит к соответствующему размеру наконечника
ПарапленкаInterpathPM996любая парафиновая пленка
Пастеровская пипетка пластиковаяSamco Scientific202
Пастеровская пипетка стекляннаяHirschmann Laborgeraete9260101
PronaseSigmaP5942-25MG  Протеаза типа XIV
N-фенилтиомочевинаSigmaP7629-25GPTU токсична и может быть приготовлена в виде стокового раствора во избежание частого воздействия порошка, проконсультируйтесь с MSDS перед покупкой/использованием.
Qiaquick экстракция гелемQiagen28704любые альтернативы для очистки ДНК могут быть использованы
Rneasy Mini kitQiagen74104любые альтернативы для очистки РНК могут быть использованы
SP6 mMessage kitQiagenAM1340любые альтернативы для транскрибирования ДНК с помощью SP6
,

Ссылки

  1. Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8, 353-367 (2007).
  2. Scholpp, S., Poggi, L., Zigman, M. Brain on the stage - spotlight on nervous system development in zebrafish: EMBO practical course, KIT, Sept. 2013. Neural Dev. 8, 23(2013).
  3. Cayouette, M., Poggi, L., Harris, W. A. Lineage in the vertebrate retina. Trends Neurosci. 29, 563-570 (2006).
  4. Poggi, L., Vitorino, M., Masai, I., Harris, W. A. Influences on neural lineage and mode of division in the zebrafish retina in vivo. J Cell Biol. 171, 991-999 (2005).
  5. Poggi, L., Zolessi, F. R., Harris, W. A. Time-lapse analysis of retinal differentiation. Curr Opin Cell Biol. 17, 676-681 (2005).
  6. Jusuf, P. R., et al. Biasing amacrine subtypes in the Atoh7 lineage through expression of Barhl2. J Neurosci. 32, 13929-13944 (2012).
  7. Jusuf, P. R., et al. Origin and determination of inhibitory cell lineages in the vertebrate retina. J Neurosci. 31, 2549-2562 (2011).
  8. Jusuf, P., Harris, W. A., Poggi, L. Imaging retinal progenitor lineages in developing zebrafish embryos. Cold Spring Harb Protoc. 2013, (2013).
  9. Jusuf, P., Harris, W. A., Poggi, L. Preparation of transgenic zebrafish embryos for imaging the developing retina. Cold Spring Harb Protoc. 2013, (2013).
  10. Vitorino, M., et al. Vsx2 in the zebrafish retina: restricted lineages through derepression. Neural Dev. 4, 14(2009).
  11. Reh, T. A. Cell-specific regulation of neuronal production in the larval frog retina. J Neurosci. 7, 3317-3324 (1987).
  12. Reh, T. A., Tully, T. Regulation of tyrosine hydroxylase-containing amacrine cell number in larval frog retina. Dev Biol. 114, 463-469 (1986).
  13. Livesey, F. J., Cepko, C. L. Vertebrate neural cell-fate determination: lessons from the retina. Nature reviews. Neuroscience. 2, 109-118 (2001).
  14. Zolessi, F. R., Poggi, L., Wilkinson, C. J., Chien, C. B., Harris, W. A. Polarization and orientation of retinal ganglion cells in vivo. Neural Dev. 1, 2(2006).
  15. Kimura, Y., Okamura, Y., Higashijima, S. alx, a zebrafish homolog of Chx10, marks ipsilateral descending excitatory interneurons that participate in the regulation of spinal locomotor circuits. J Neurosci. 26, 5684-5697 (2006).
  16. Kimura, Y., Satou, C., Higashijima, S. V2a and V2b neurons are generated by the final divisions of pair-producing progenitors in the zebrafish spinal cord. Development. 135, 3001-3005 (2008).
  17. Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio Rerio). , University of Oregon Press. (2007).
  18. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
  19. Kei, J. N., Dudczig, S., Currie, P. D., Jusuf, P. R. Feedback from each retinal neuron population drives expression of subsequent fate determinant genes without influencing the cell cycle exit timing. J Comp Neurol. 524, 2553-2566 (2016).
  20. Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. J Vis Exp. , (2009).
  21. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. , (2009).
  22. Zou, J., Wei, X. Transplantation of GFP-expressing blastomeres for live imaging of retinal and brain development in chimeric zebrafish embryos. J Vis Exp. , (2010).
  23. Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation. J Vis Exp. , (2009).
  24. Schier, A. F., Talbot, W. S. Molecular genetics of axis formation in zebrafish. Annu Rev Genet. 39, 561-613 (2005).
  25. De Luca, E., et al. ZebraBeat: a flexible platform for the analysis of the cardiac rate in zebrafish embryos. Sci Rep. 4, 4898(2014).
  26. Lin, J. W., et al. Differential requirement for ptf1a in endocrine and exocrine lineages of developing zebrafish pancreas. Dev Biol. 274, 491-503 (2004).
  27. Hollyfield, J. G. Histogenesis of the retina in the killifish, Fundulus heteroclitus. J Comp Neurol. 144 (3), 373-380 (1972).
  28. La Vail, M. M., Rapaport, D. H., Rakic, P. Cytogenesis in the monkey retina. J Comp Neurol. 309 (1), 86-114 (1991).
  29. Rapaport, D. H., Wong, L. L., Wood, E. D., Yasumura, D., LaVail, M. M. Timing and topography of cell genesis in the rat retina. J Comp Neurol. 474 (2), 304-324 (2004).
  30. Sharma, S. C., Ungar, F. Histogenesis of the goldfish retina. J Comp Neurol. 191 (3), 373-382 (1980).
  31. Stiemke, M. M., Hollyfield, J. G. Cell birthdays in Xenopus laevis retina. Differentiation. 58 (3), 189-193 (1995).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

В визуализации in vivo трансгенной экспрессии генов в Персональной Ретинального прародителей в химерных эмбрионов данио рерио по изучению мобильных неавтономных Влияния
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.