Регистрация цельноклеточных патч-фиксаторов для электрофизиологического определения селективности ионов в канале-каналодопсинах

Краткое содержание

В этой статье описывается, как определяется ионная селективность каналродопсина с помощью электрофизиологических записей целых клеток с использованием клеток HEK293. В данной работе показана экспериментальная методика исследования хлоридной селективности анион-селективного каналродопсина. Тем не менее, процедура может быть перенесена на другие каналродопсины с ярко выраженной селективностью.

Аннотация

За последнее десятилетие каналодродоксины стали незаменимыми в неврологических исследованиях, где они используются как инструменты для неинвазивного манипулирования электрическими процессами в клетках-мишенях. В этом контексте особенно важна ионная селективность канала -родопсина. В данной статье описывается исследование селективности хлоридов для недавно идентифицированного анион-проводящего канала -родопсина Proteomonas sulcata посредством электрофизиологических записей патч-струбцины на клетках HEK293. Экспериментальная методика измерения светоизлучающих фототоков требует быстро переключаемого - идеально монохроматического - источника света, подключенного к микроскопу обычной установки патч-струбцины. Подготовительные процедуры перед экспериментом описаны с подготовкой буферных растворов, соображениями о потенциалах жидкого соединения, посевом и трансфекцией клеток и вытягиванием пипетки. Фактическая запись отношения напряжение-напряжениеС для определения обратимых потенциалов для различных концентраций хлоридов происходит через 24 ч до 48 ч после трансфекции. Наконец, электрофизиологические данные анализируются по теоретическим соображениям по хлоридной проводимости.

Введение

Channelrhodopsins (ChR) - световодные ионные каналы, которые происходят в пятне глаз подвижных зеленых водорослей, и служат в качестве первичных фотодатчиков для фототаксиса и фобических ответов ¹ . С момента своего первого описания в 2002 году ² , ChRs проложили путь к появляющейся области оптогенетики и могут применяться во множестве возбудимых клеток, например, в скелетных мышцах, сердце или головном мозге ^{3 , 4 , 5} . Экспрессия ChRs в клетках-мишенях приводит к светопропусканию ионной проницаемости соответствующей клетки. В нейронном контексте это позволяет активацию ^{6 , 7 , 8} или торможение ^{9 , 10} срабатывания потенциала действия (АР), в зависимости от проводимого иона, с пространственным и временнымТочность света, подчеркивающая, как избирательность ионов варианта ChR определяет его оптогенное применение.

Первые обнаруженные ChRs Chlamydomonas reinhardtii и Volvox carteri проницаемы для протонов, но также и с одновалентными катионами, такими как натрий, калий и в меньшей степени с двухвалентными катионами, такими как кальций и магний ^{11 , 12 , 13} . Сегодня более 70 природных катионопроводящих каналов (CCR) ^{14 , 15 , 16 , 17} и несколько инженерных вариантов ^{18 , 19 , 20} с различными свойствами, такими как Размер фототока, спектральная чувствительность, кинетика и селективность по катионам. Тогда как в неврологии CCRs aИспользуемые для активации клеток и запуска AP, световодные микробные насосы были единственными доступными антагонистами для блокирования нейронов в течение многих лет. В 2014 году две группы одновременно показали, что CCRs могут быть преобразованы в анион-проводящий канал -родопсины (ACR) путем изменения полярности вдоль предполагаемой проводящей поры через молекулу ^{9 , 21} . Впоследствии, природные ACR были идентифицированы в нескольких криптофитных водорослях ^{22 , 23 , 24} . Самое главное, легкая активация ACR опосредует хлорид-токи у взрослых нейронов, что позволяет ингибировать активность нейронов при гораздо меньшей интенсивности света, чем микробные насосы, которые переносят только отдельные заряды на поглощенный фотон.

Активность ChR может быть непосредственно устранена с помощью электрофизиологических патч-клеточных записей светоиндуцированных токов в клетках НЕК293. Патч-зажимТехника была изначально разработана в конце 1970-х годов ²⁵ и дополнительно улучшена Хамилем и др. , Что позволяет регистрировать сущность токов из малой ячейки (режим цельной ячейки) с высоким текущим разрешением и прямым управлением напряжением ²⁶ мембраны. Применяемый в культуре клеток, этот метод обеспечивает точный контроль как ионных, так и электрических условий регистрации, а также позволяет исследовать селективность ионов наряду с относительным вкладом ионов в общий ток. Здесь мы проиллюстрируем исследование избирательности ионов для анион-проводящего канала rhodopsin Proteomonas sulcata ( Ps ACR1) ^{22 , 23} посредством регистрации вольт-амперных отношений при различных концентрациях внеклеточного хлорида, чтобы доказать высокую проводимость хлорида.

Протокол

Рисунок 1: Установка патч-зажима. (1) источник света, (2) оптическое волокно, (3) программируемый затвор, (4) дигитайзер, (5) драйвер затвора, (6) усилитель, (7) перфузионная система, (8) персональный компьютер, (9) монитор , (10) клетка фарадея, (11) ступень микроскопа, (12) перфузионный вход, (13) перфузионный выход, (14) регистрирующая камера, (15) датчик уровня жидкости, (16) электрод ванны с мостиком агара, (17) (19) микроманипулятор, (20) инвертированный микроскоп, (21) корпус лампы микроскопа, (22) источник питания ламп микроскопа, (23) водонаполненная U-образная трубка, (24) трехполосная Клапан, (25) антивибрационный стол, (26) ПЗС-камера. ( A ) Фотографии и ( B ) схематическое представление установки. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию tЕго фигуре.

1. Настройка перед записью

	внутри.	extra.1	extra.2
	Высокий хлорид	Высокий хлорид	Низкий хлорид
	C [мМ]	C [мМ]	C [мМ]
Na-АСП	0	0	140
NaCl	110	140	0
KCl	1	1	1
CsCl	1	1	1
CaCl 2	2	2	2
MgCl 2	2	2	2
HEPES	10	10	10
EGTA	10	0	0
pH	7,2	7,2	7,2
осмолярность	290 мОсм	320 мОсм	320 мОсм

Таблица 1: Ионный состав буферных растворов. Состав внутриклеточных (внутриклеточных) и внеклеточных (экстра.) Буферов для экспериментов с хлоридной селективностью в клетках НЕК. Используемые сокращения: этиленгликольтетрауксусная кислота (ЭГТА), 4- (2-гидроксиэтил) -1-пиперазинэтансульфоновая кислота (HEPES) и аспартат (ASP). Все концентрации указаны в мМ.

1. Подготовьте регистрирующие растворы с концентрациями ионов, как указано в таблице 1.
   1. Готовят 15 мл 2 М исходных растворов в сверхчистой воде для MgCl ₂ , CaCl ₂ , KCl и CsCl.
   2. Взвешивают твердые компоненты для 100 мл внутриклеточного и500 мл внеклеточных буферных растворов в соответствии с таблицей 1 в отдельные мензурки и после этого добавить соответствующее количество приготовленных исходных растворов. Например, для внутриклеточного буфера используют 0,3803 г (10 мМ) EGTA, 0,2383 г (10 мМ) HEPES и 0,6428 г (110 мМ) NaCl и добавляют 100 мкл 2 M MgCl ₂ и CaCl ₂ и 50 мкл 2 М KCl и CsCl.
   3. Добавьте сверхчистую воду и тщательно отрегулируйте рН с помощью кислот и оснований, которые не влияют на измерение, т.е. не проводятся ChR, такие как лимонная кислота и N-метил-D-глюкамин (NMG ⁺ ).
   4. Отрегулируйте осмолярность до 290 мОсм для внутриклеточного и до 320 мОсм для внеклеточных растворов с глюкозой.
      Примечание: Немного гипоосмотические внутриклеточные растворы увеличивают частоту успешного применения патчей ²⁶ .
   5. Стерильный фильтр фильтрует все растворы через фильтры 0,22 мкм. Хранить растворы при температуре 4 ° C в течение двух недельС или замораживать при -20 ° C для длительного хранения.
2. Рассчитайте потенциалы жидкого соединения и подготовьте протоколы записи.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Изменение концентрации внеклеточного хлорида после создания цельноклеточной конфигурации приводит к существенному переходу в жидкий контакт (LJP), который необходимо скорректировать ^{27 , 28} . LJP могут быть напрямую измерены или рассчитаны, здесь используется последний вариант. В этом протоколе будет использоваться онлайн-коррекция, требующая одного протокола записи для каждого внешнего буфера. Однако для большего набора внешних решений рекомендуется коррекция позы LJP во избежание ложной коррекции.
   1. Откройте калькулятор потенциала соединения (JPC) ²⁷ и откройте диалог «Новый эксперимент». Затем выберите «Patch-clamp measurements». Выберите «целые ячейки измерений», «Стандартный электрод солей раствор» и введите температуру25oC. Между каждым шагом идите вперед, принимая выбор, нажав кнопку «Далее».
      ПРИМЕЧАНИЕ. Эксперименты проводятся при комнатной температуре 25 ° С в лаборатории с кондиционированием воздуха. Перед запуском экспериментов убедитесь, что буферные растворы имеют комнатную температуру. Для изменения температуры образца можно использовать стадию инкубации или камеру. Температуру ванны можно часто измерять с помощью термометра.
   2. Добавьте все индивидуальные концентрации анионов и катионов пипетированного раствора и буфера с высоким содержанием хлора в соответствии с концентрациями, перечисленными в таблице 1 .
      ПРИМЕЧАНИЕ: JPC рассчитает LJP -0,5 мВ для начальных условий.
   3. Нажмите «New Bath Solution», чтобы ввести анионный и катионный состав хлорида с низким содержанием хлоридов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: JPC теперь рассчитает новый LJP +12,6 мВ в соответствии с измененным внеклеточным решением для записи.
   4. Подготовьте два протокола с исправлением LJP дляДва условия измерения путем вычитания рассчитанного LJP из приложенного удерживающего потенциала; -0,5 мВ для высоких и +12,6 мВ для низких хлоридных внешних растворов. Таким образом, протоколы начинаются с -79,5 мВ (высокий хлорид) и -92,6 мВ (низкий хлорид), соответственно, чтобы получить LJP-скорректированный начальный потенциал удержания -80 мВ в обоих случаях.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Следующие шаги относятся к программному обеспечению сбора данных, указанному в списке материалов.
   5. Откройте редактор протокола в программе сбора данных. Перейдите в меню «Режим» выберите «Эпизодическая стимуляция» и включите 7 разверток.
   6. Переключитесь в меню «Waveform» в редакторе и включите период 200 мс с потенциалом удержания 0 мВ с последующим периодом 2 с с переменным потенциалом удержания, начиная с -79,5 мВ для высокого хлорида. Включите «Дельта-уровень» 20 мВ для второго периода, чтобы увеличить удерживающий потенциал на 20 мВ в каждом прогоне.
   7. В пределах шагов напряжения сигнала edItor применяют 500 мс период освещения с 540 нм света (3,10 мВт / мм²). Для этого измените «цифровую комбинацию битов» подключенного затвора, которая управляет источником света, чтобы быть активным 500 мс после второго периода, описанного выше (см. 1.2.6).
      ПРИМЕЧАНИЕ. Интенсивность света может влиять на биофизические свойства канальных токов, таких как амплитуда или инактивация. Поэтому всегда следует сообщать о плотности мощности света. Чтобы измерить силу света после прохождения через всю оптику и покровное стекло, используйте откалиброванный оптометр. Чтобы вычислить плотность мощности, определите освещенное поле объектива микрометром объекта и разделите измеренную мощность света на определенное освещенное поле.
   8. Сохраните протокол для высокохлоридного внеклеточного раствора. Измените протокол и замените потенциал удержания первого уровня на -92,6 мВ (низкий внешний хлорид). Сохраните этот второй протокол для измерения низкого уровня внеклеточного состояния хлорида.
   9. Лизиновое покрытие стеклянной крышки скользит согласно адаптированному протоколу ²⁹ .
      1. Поместите несколько 100 покровных листов в стеклянную чашку Петри и добавьте 250 мл HCl (1 N).
      2. Поместите чашку Петри с крышкой на линейный шейкер и встряхивайте со скоростью 120 об / мин в течение 72 часов, чтобы очистить чехлы на крышке, а затем ополосните сверхчистой водой, чтобы нейтрализовать pH.
      3. Замочите их в небольшом объеме 95% этанола для дальнейшей очистки.
         ПРИМЕЧАНИЕ. Перед тем, как приступать к работе, очистите покровные стекла перед хранением в 70% этаноле. Работайте под ламинарным колпаком для следующих этапов.
      4. Используя горелку и пинцет Бунзена, пламените каждую покровную пленку и перенесите ее в новую чашку Петри.
      5. Инкубируйте прокладки стеклянной крышки стерильным раствором поли-D-лизина в концентрации 50 мкг / мл в течение по меньшей мере 1 ч (или в течение ночи) при комнатной температуре при встряхивании с помощью линейного шейкера со скоростью 150 об / мин.
      6. Промыть покрытие скользит с помощью сверхчистой воды для удаления избытка поли-D-лизина.
      7. Распределите повязку на стерильной бумаге, чтобы она высохла в течение 10 минут, и предоставьте их ультрафиолетовому свету для стерилизации (не менее 20 минут).
      8. Соберите покровную ложку в стерильную чашку Петри, покрытую алюминиевой фольгой, до использования.
   10. Подготовьте ДНК гена Ps ACR1, слитого с mCherry, используя стандартные методы молекулярной биологии.
       1. Клон оптимизированной человеческим кодоном генной последовательности, кодирующей Ps ACR1, в плазмиду peGFP-C1 (промотор CMV, резистентность к канамицину) в рамке с флуорофором mCherry с использованием рестрикционных ферментов или других установленных методов клонирования.
          Примечание. Могут использоваться и другие флуорофоры, но убедитесь, что имеются соответствующие наборы фильтров для наблюдения за их флуоресценцией под микроскопом в установке.
       2. Трансформируют плазмидную ДНК в хемокомпетентные клетки XL1Blue E. coli посредством теплового шока согласно стандартному протоколу и накладывают их на чашки с агаром (30 мкг / мл канамицина) ³⁰
       3. На следующий день инокулируют среду бульона с 4 мл лизогениза, дополненную канамицином 30 мкг / мл, клетками из одиночных колоний и инкубируют их в течение ночи при 37 ° С и 180 об / мин в инкубаторе.
       4. После инкубации в течение ночи очищают плазмидную ДНК культур с использованием коммерчески доступного набора (см. Таблицу материалов ) в соответствии с инструкциями производителя.
   11. Посадить клетки
       ПРИМЕЧАНИЕ. Выполните шаги под ламинарным потоком.
       1. В 35-мм чашку Петри рядом помещается до трех стеклянных крышек с лизином.
          ПРИМЕЧАНИЕ. Аккуратно прижмите их к нижней части тарелки, чтобы избежать скольжения друг на друга.
       2. Семя 1,5 × 10 ⁵ клеток НЭК в 2 мл стандартной модифицированной Дульбекко среды Игла (DMEM), дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS) в каждой чашке.
       3. Дополнение all- trans сетчатки приКонечная концентрация 1 мкМ. Выращивайте клетки, по крайней мере, за один день до перехода на шаг 1.6.
   12. Временно трансфекция клеток через lipofection ³¹ .
       1. Для каждой чашки клеток готовят раствор 2 мкг плазмидной ДНК ( приготовленной на стадии 1.4) в 250 мкл DMEM без FBS и 6 мкл трансфекционного реагента (см. Таблицу материалов ).
       2. После 15 минут инкубации осторожно (по каплям) добавляют раствор к клеткам.
   13. Подготовьте агаровые мосты
       1. Добавить 0,75 г агарозы в 50 мл стерильного раствора хлорида натрия (140 мМ) и растворить его нагреванием в микроволновой печи.
          ПРИМЕЧАНИЕ: 2 - 3 М KCl для подготовки агарового моста дополнительно уменьшает LJP из-за более высокой концентрации ( например, постоянной диффузии от мостика) и равной подвижности ионов K ⁺ и Cl ^- , но избегался, чтобы минимизировать утечку ионов (особенно Cl ^- ) В t Раствор для ванны ³² .
       2. Заполните 10 мкл наконечников пипетки (или шланга малого диаметра) жидким раствором агарозы с помощью шприца.
          ПРИМЕЧАНИЕ. Избегайте воздушных пузырьков в мосте.
       3. После охлаждения агаровых мостиков и отверждения их хранят в стерильном 140 мМ растворе хлорида натрия.
   14. Подготовьте записывающие и электроды для ванн.
       1. Удалите серебряные провода ванны и регистрирующий электрод установки патч-струбцины.
       2. Отполируйте провода наждачной бумагой, чтобы удалить хлорид серебра из предыдущих экспериментов. Погрузите чистый серебряный провод в 3 М KCl и подключите его к положительному полюсу батареи 1,5 В для электролитического покрытия с хлоридом серебра.
          ПРИМЕЧАНИЕ. Вместо батареи может использоваться источник питания лаборатории.
   15. Вытяните пипетки с низким сопротивлением (1,5-3,0 МОм) из стеклянных капилляров с помощью съемника микропипетки и полируйте их, как описано Brown et al.Lass = "xref"> 33. Храните пипетки без пыли в течение дня измерения.
   16. Включите все компоненты настройки, чтобы нагреться до рабочей температуры за 30 минут до начала записи. Убедитесь, что буферы находятся при комнатной температуре.

   2. Измерение избирательности

   1. Начните запись через 24-48 часов после временной трансфекции клеток, описанных в 1.6.
   2. Поместите одну крышку в измерительную камеру и запечатайте ее с помощью кремния, чтобы предотвратить утечку внешнего буфера. Храните чашку Петри с другими обложками в инкубаторе для следующего набора экспериментов.
   3. Тщательно заполните камеру внеклеточным буфером (высокая [Cl ^- ]), чтобы предотвратить отделение клеток, затем поместите его под микроскоп и используйте 40X объектив для визуализации клеток.
   4. Поместите агаровый мост над электродом ванны и поместите его в камеру вместе с датчиком уровня жидкости и перфузионным выходом обработчика ванны.
   5. Обменять бывшиеТрацеллюлярного раствора дважды с 1 мл свежего наружного раствора (высокий [Cl ^- ]) для удаления остаточной культуральной среды и отдельных клеток.
   6. Приведите клетки в фокус и ищите трансфицированную (флуоресцентную) клетку, которую нужно изолировать от других клеток. Используйте трехполосный фильтр-набор и оранжевый свет (590 нм, ширина полосы 15 нм, 100% интенсивность), чтобы возбудить и визуализировать mCherry.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Клетки НЭК могут быть электрически соединены со своими соседями с помощью щелевых контактов ^{34, что} приводит к низкому мембранному сопротивлению в цельноклеточной конфигурации.
   7. Заполните одну из вытащенных пипеток внутриклеточным раствором и удалите пузырьки воздуха, несколько раз щелкнув пипеткой.
   8. Установите пипетку на держатель пипетки и приложите некоторое положительное давление, чтобы предотвратить забивание наконечника.
   9. Найдите наконечник пипетки патчей под микроскопом и перемещайте его рядом с клеткой, используя микроманипулятор.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Следующие шаги относятся кMplifier, программное обеспечение для сбора и оценки данных, указанное в списке материалов.
   10. Запустите «мембранный тест» в программе сбора данных и примените шаг напряжения (испытательный импульс, например, 5 мВ в течение 10 мс, базовый уровень при 0 мВ), вручную или автоматически через указанное программное обеспечение с использованием «режима ванны» при выполнении «теста мембраны», В программе сбора данных.
   11. Убедитесь, что сопротивление пипетки находится в необходимом диапазоне (1,5-3,0 МОм).
   12. Токи нулевого смещения, регулируя потенциал пипетки, поворачивая рукоятку смещения пипетки на усилителе, работая в «режиме ванны» «мембранного теста».
   13. Установите патч в конфигурации целых ячеек ²⁶ .
       ПРИМЕЧАНИЕ. Следующие этапы требуют применения положительного и отрицательного давления, подаваемого в боковой порт используемого держателя пипетки. Это можно сделать, используя либо шприц, через рот кусок или электронным ConРегулируемый регулятор давления. В этом протоколе положительное и отрицательное давление прикладывается через рот.
       1. Медленно приближайтесь к камере с помощью пипетки для патчей сверху и снижайте положительное давление прямо перед тем, как прикасаться к нему.
          ПРИМЕЧАНИЕ. Когда наконечник находится близко к ячейке, сопротивление немного повысится; На это указывает уменьшенный размер испытательного импульса.
       2. Измените «мембранный тест» с «режима ванны» на «режим патча», таким образом, удерживая потенциал для ожидаемого потенциала покоя клеток (от -30 до -40 мВ).
       3. В некоторых случаях конфигурация, связанная с клетками, образуется после высвобождения положительного давления (2.13.1), если нет, осторожно применяйте отрицательное давление для облегчения формирования гигазы.
          ПРИМЕЧАНИЕ. Конфигурация, привязанная к клетке, устанавливается, когда тестовый импульс уменьшается до двух малых емкостных пиков в начале и в конце импульса, а сопротивление мембраны находится в диапазоне GΩ; Отрицательное напряжение до -60 мВ мОблегчают формирование гигазы.
       4. Компенсируйте емкость пипетки, поворачивая ручки «Компенсация пипетки», чтобы получить плоский отклик тестового импульса.
       5. Разрыв пластыря без разрушения уплотнения путем приложения коротких импульсов отрицательного давления или отрицательного давления с увеличением силы, чтобы получить целостную конформацию.
          ПРИМЕЧАНИЕ. Успешный переход от ячейки, присоединенной к конфигурации целых ячеек, обозначается увеличением емкостных пиков.
       6. Примените последовательную компенсацию сопротивления, установив параметр целой ячейки и отрегулируйте компенсацию используемого усилителя для точного зажима мембранного потенциала до желаемого удерживающего напряжения.
          1. Включите «мембранный тест» в режим «целые ячейки», в панели «Последовательная компенсация сопротивления» включите «предсказание» и «коррекцию» до 90%, избегая овершотов и колебаний емкостного отклика, включите целую ячейкуВключите компенсацию и отрегулируйте параметры всей ячейки с помощью соответствующих кнопок на передней панели («целостность целых элементов» и «последовательное сопротивление») усилителя итерационным способом, чтобы получить идеально плоский отпечаток пробного отпечатка.
             ПРИМЕЧАНИЕ. Подробное описание последовательной компенсации сопротивления и коррекции см. В руководстве или руководстве по усилителю, так как эта процедура различается у разных производителей.
       7. После установки цельноклеточной конфигурации подождите не менее 2 мин перед записью, чтобы обеспечить достаточную замену внутриклеточного раствора с помощью пипетки ³⁵ .
   14. Регистрируйте индуцированные светом токи при разных потенциалах удержания, используя ранее настроенные протоколы (в 1.2).
   15. Обменивайте внеклеточный буфер на низкий уровень [Cl ^- ] в камере не менее пяти раз, не разрушая пластырь, и запишите другое отношение тока к напряжению ( см. Шаг 1.2) при tНовая хлоридная концентрация.
       ПРИМЕЧАНИЕ. Система перфузии для автоматизированного обмена буферами облегчает этот процесс, но это необязательно.
   16. Повторите пункт 2.15. Для каждого испытуемого ионного состояния, но повторно проверьте качество накладки между измерениями с помощью «мембранного теста», описанного выше.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Для обеспечения точного мембранного напряжения и стабильного внутриклеточного ионного состава мембранное сопротивление должно быть выше 500 МОм, в то время как сопротивление доступа не должно превышать 10 МОм, см . 2.12.6). Не забудьте выключить компенсацию параметров цельной ячейки для теста мембраны.
   17. Повторите 2.2. До 2,15. Для нескольких ячеек, но возьмите новую обложку для каждой серии тестов, чтобы обеспечить здоровость клеток.

   3. Оценка данных

   1. Отрегулируйте базовую линию каждого текущего следа, вычитая средний ток перед освещением.
   2. Вычислить средний стационарный фототок I _s ( ПРИМЕЧАНИЕ. Анализ пиковых фототоков или изменение длины усреднения для определения стационарного фототока в зависимости от протокола или научного вопроса.
   3. Повторите шаги 3.1) и 3.2) для всех протестированных условий и разных ячеек.
   4. Выделите определенные фототоки в зависимости от соответствующего удерживающего потенциала.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Если несколько измерений усредняются, отдельные записи могут быть нормализованы в соответствии с заданным условием или емкостью ячейки.
   5. Пересечение отношения напряжение-напряжение с осью напряжения представляет собой потенциал разворота (чистый ток равен нулю). Определите это путем линейной интерполяции между двумя соседними точками данных.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Если инверсия полярности фототоков отсутствует, экстраполируйте линейно из последних двух точек близко к нулю, чтобы получить приближение точки пересечения.
   6. Среднее значение rЭверсальных потенциалов для тех же условий и строить их с концентрацией хлоридов внешних буферных растворов ( см. Рис. 2В ).

Результаты

На рисунке 2 представлены репрезентативные результаты, полученные из измерений, следующих за описанным протоколом. При освещении зеленым светом Ps ACR1 имеет быстрый переходный ток, который быстро распадается до уровня стационарного тока. После выключения света фототоки затухают до нуля в миллисекундах ( рис. 2А ). Обмен концентрации внеклеточного хлорида вызывает сдвиг потенциала реверсии, который может быть непосредственно замечен в полученных...

Обсуждение

Определение потенциалов реверсии при определенных ионных и электрических условиях дает информацию об ионах, транспортируемых после легкой активации ChRs. Если в сложной физиологической среде изменяется только один ионный вид, а полученный потенциал разворота изменяется в соответствии с теоретическим потенциалом Нернста, то этот вид ионов является единственным транспортируемым.

Однако для ChR сдвиги потенциала обратного хода обычно менее выражены, чем ожидалось из уравнения Нернста из-за прон...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Клетки HEK293	Sigma Aldrich	85120602	Эмбриональные клетки почек человека
	Retina Sigma Aldrich	R2500	All-trans retinal
FuGENE HD	Promega	E2312	Реагент для трансфекции
DMEM	Biochrome	FG 0445	Dulbecco's Modified Eagle Medium
Agarose	Roth	3810	Агаровые мосты
CaCl2	Roth	5239	CaCl2 2H2O
CsCl	Biomol	2452
EGTA	Roth	3054
FBS	Biochrome	S0615	Клеточная культура
глюкозы	Roth	HN06	D(+)-глюкоза
KCl	Roth	6781
MgCl2	Roth	2189	MgCl2 6H2O
NaCl	Roth	3957
NMG	Sigma Aldrich	M2004	N-Methyl-D-glucamine
Na-Aspartate	Sigma Aldrich	A6683	L-аспарагиновая кислота Моногидрат натриевой соли
Лимонная кислота	Roth	6490
AgeI	ThermoFischerScientific	ER1462	Рестрикционный фермент
XhoI	ThermoFischerScientific	ER0695	Рестрикционный фермент
NheI	ThermoFischerScientific	ER0975	Рестрикционный фермент
XL1Blue E. coli	Agilent Technologies	200249	Хемокомпетентный E. coli
Канамицин	Рот	Т832
Лизогения бульон средний	Рот	X964
Агар-Агар	Рот	6494	Агаровые тарелки
Набор для очистки плазмид	Marchery-Nagel	740727.25
Пенициллин/стрептомицин	Биохром	А 2213	Клеточная культура
Поли-D-лизина гидробромид	Сигма Олдрич	P6407-5MG	Крышка скользящее покрытие
Microforge	Изготовленный		Пожарная полировка
Серологические пипетки	TPP		Разные размеры
Чистая скамья	Kojair	Biowizard SL130
Мешалка	IKA	RCT классическая
Серебряная проволока	Science Products	AG-T25; AG-T10	Электроды, 0,64 мм (ванна); 0,25 мм (электрод)
pH-метр	Knick	765 Калиметрический
осмометр	Vogel	OM 815
Микроскоп	Carl Zeiss	ID03	Пожарная полировка
CO2 инкубатор	Binder	CB150
Чашки для клеточных культур	TPP	93040	34 мм внутренние диаметр
Защитные стекла	Roth	P232	диаметр 15 мм
Термометр	Rö ssel Messtechnik	MTM12
Светоделитель	Chroma	21011	Передача 90/10
Держатель для пипеток	ALA Scientific Instruments	PPH-1P-AXU-0-1.5
	Headstage Молекулярные устройства	CV203BU
усилитель	Молекулярные устройства	AxoPatch200B
Дигитайзер	Молекулярные устройства	DigiData1400	Цифровой аналоговый преобразователь
Источник света	TILL Photonics	Polychrome V	Установлен на 540 нм полной интенсивности
Микроскоп	Carl Zeiss	Axiovert 100
Shutter	Vincent Associates	VS25
Драйвер затвора	Vincent Associates	VCM-D1
Стеклянные капиляры	Warner Instruments	G150F-3	Борсиликатные капилляры с полированными концами OD 1,5 мм ID  0,86 мм
Съемник микропипеток	Sutter Instruments	P1000
Бат хэндлер	Lorenz Messgerä tebau	MPCU
Трехполосный фильтр	Chroma	69008	Флуоресцентный фильтр  ECFP/EYFP/mCherry
ПЗС-камера	Watec	Wat-221SCCD
Оптометр	Гигагерц Оптика	P9710	Измерение интенсивности света
Объектив	Carl Zeiss	421462-9900-000	Вт Plan-Apochromat 40X/1.0 DIC
Микроманипулятор	Scientifica	PatchStar
Записывающая камера	Индивидуальный
блок	питанияManson	HCS-3202	Предотвращает электрические помехи от микроскопа Встроенный источник питания
Виброизолированный стол	Newport	M-VW-3636-OPT-01
Клетка Фарадея	Изготовленный на заказ или любой коммерческий подходящий стол
Шланги	Любой коммерческий; например, Roth		Различные размеры и материалы для работы с ванной и приложения давления пипетки; агаровые мосты
Линейные шейкер	Sunlab Instruments	SU 1000
Калькулятор потенциала жидкостного перехода	Molecular Devices или непосредственно от Питера Х. Барри		Программа включена в программное обеспечение для сбора данных Clampex или может быть получена из  p.barry@unsw.edu.au
Программное обеспечение для сбора данных	Molecular Devices	Clampex 10.X
Программное обеспечение для анализа данных	Molecular Devices Clampfit	10.X
PsACR1	GenBank или Addgene	KF992074.1 или Addgene плазмида #85465	Кодирование гена для PsACR1
Руководство по амплиру	Молекулярные устройства Руководство		аксонам