Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

In Vitro и In Vivo Оценка T, B и миелоидных клеток подавляющих активность и гуморальные ответы от пересадки получателей

14K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/55510

⸱

12 августа 2017 г.

 ,  , 
1Centre de Recherche en Transplantation et Immunologie UMR 1064, INSERM, Université de Nantes, 2Institut de Transplantation Urologie Néphrologie (ITUN), CHU Nantes

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы представляем протокол стимулировать толерантность в трансплантации, и оценить в пробирке и в естественных условиях подавляющей потенциала отдельных клеток подмножеств от получателя и иммунный статус получателя донора или Экзогенные антигены.

Аннотация

Основной проблемой в трансплантации является достижение конкретных терпимости путем индукции регуляторных клеток. Понимание механизмов толерантности требует надежных моделей. Здесь мы описываем модели толерантности к сердечной аллотрансплантата в крыса, вызванных блокадой костимуляции сигналов или upregulation иммунорегуляторное молекул через перенос генов. Каждая из этих моделей позволило в естественных условиях поколения регуляторных клеток таких нормативных Т-клетки (Tregs), регулирующих клетки B (Bregs) или регулирования миелоидных клеток (RegMCs). В этой рукописи мы описываем две дополнительные протоколы, которые были использованы для выявления и определения in vitro и in vivo регулирования клеточной активности, чтобы определить их ответственность в терпимости индукция и поддержание. Во-первых в пробирке подавляющих assay допускается быстрой идентификации клеток с подавляющей мощностью на эффекторные иммунные реакции образом зависит от дозы и могут быть использованы для дальнейшего анализа, например измерение цитокинов или цитотоксичности. Во-вторых приемные переноса клеток от терпимая(ый) обработанных получателей недавно облученного привитые получателю, подчеркнул tolerogenic свойства этих клеток в Управление трансплантата направлены иммунных реакций и/или преобразовании новых регуляторных клеток ( назвать инфекционных толерантности). Эти методы не ограничиваются клетки с известными фенотипические маркеры и может быть расширен для любой популяции клеток. Кроме того доноров направлены allospecificity регуляторных клеток (важной целью в области) можно оценить с помощью сторонних доноров клеток или взяточничество в vitro или в естественных условиях. Наконец чтобы определить конкретные tolerogenic потенциала этих регуляторных клеток, мы предоставляем протоколы для оценки реакции гуморального антитела анти доноров и получателя способность развивать гуморальные ответы против новых или бывших известных антигенов. Модели терпимости описал могут использоваться для дальнейшей характеризации регуляторных клеток, для идентификации нового биомаркерами и иммунорегуляторное молекул и могут быть адаптированы для других трансплантации модели или аутоиммунных заболеваний в грызунов или человека.

Введение

Аллотрансплантата сердца крыс представляет собой надежный орган трансплантации модель для оценки лечения индукции толерантности, чтобы расшифровать механизмы индукции толерантности и обслуживания и имеет потенциал, чтобы побудить функционально компетентным и доминирующей регуляторных клеток. Протоколы ниже описывают полностью несоответствие heterotopic сердечного трансплантата из крыса доноров 1W Льюис (LEW.1W, RT1u) в Льюис 1A получателей крысу (LEW.1A, RT1). В этом сочетании трансплантата острый отказ происходит быстро (около 7 дней) и может быть легко оценены трансплантата, победив измерения посредством пальпации живота. Здесь мы предлагаем три протокола, чтобы стимулировать толерантность к аллотрансплантата сердца крыс. В этих моделях терпимость является индуцированных или поддерживаемых типов различных регулирующих клеток. Во-первых, блокирование CD40-CD40L взаимодействий с аденовирус кодирования CD40Ig (AdCD40Ig) индуцированной поколения CD8+ Tregs, способны индуцировать толерантность когда восприимчивую переданы вторичных получателей привитые1. Кроме того истощение CD8+ клеток (с антител анти CD8α) в AdCD40Ig-лечение получателей генерируется Bregs и RegMCs2. Глубокий анализ CD8+ Tregs свойства подчеркнул ключевую роль несколько иммунорегуляторное молекул определяется как интерлейкин-34 (IL-34) и Fibroleukin-2 (FGL-2)3,4,5,6 . В то время как гиперэкспрессия Ил-34 (с вектора AAV) индуцированных Tregs через поколения RegMCs, гиперэкспрессия FGL-2 индуцированных Bregs, лежащие в основе сложной сети регуляторных клеток.

Потому что хронический отказ развивается медленно и долгосрочные, углубленный анализ требуется различать терпимость против хронического отказа. Трансплантата обычно оценивается для клеток инфильтрата, фиброз, утолщение сосудистой стенки и дополнения C4d осаждения immunohistology7. Хотя гистология методы требуют жертвоприношения животных или графт биопсии, здесь мы опишем простой метод для оценки различных характеристик переносится аллотрансплантата: Эмерджентность и функция регуляторных клеток и ответы специфическое антитело против доноров крови Образец подачей cytometry (здесь, мы использовали активирован флуоресценции клеток, сортируя (FACS)).

Поддержание толерантности к аллотрансплантата после ареста лечения обычно ассоциируется с индукции регуляторных клеток8. В последние десятилетия, исследования фокусировались на CD4+Tregs единогласно характеризуется их ключевых маркеров Foxp3+, CD25высокийи CD127–9,10,11. Аналогичным образом, несколько маркеров были приписаны CD8+ Tregs, как CD122+, CD28-, CD45RCнизкий, PD1+и Гелиос+ 1,12,13,14 , 15 , 16 , 17. за годы, выражение ГИТР, CTLA4 и цитокинов (Ил-10, TGFβ, Ил-34, IL-35, FGL-2) были дополнительно подключены к Treg профиль3,4,6,13, 18,19,,2021. Однако новые нормативные клеточных популяций, например Bregs, RegMCs или NKTregs, отсутствие соответствующих конкретных маркеров. Действительно, Bregs главным образом помечаются как незрелые CD24+ клеток, с неоднозначной CD27 выражение, а иногда и производства Ил-10, TGFβ, или Гранзим B22,23,24. Сложность линии миелоидных клеток требуется сочетание нескольких маркеров, чтобы определить их регулирования или провоспалительных профиль например CD14, CD16, CD80, CD86, CD40, CD209a или CD16325,26. Наконец, были зарегистрированы некоторые маркеры для выявления NKTregs например CD11b+, CD27+, TGFβ+, но больше исследования необходимы для дальнейшего фенотипически описания их27,28,29 ,30,,3132. Таким образом, для дальнейшей легитимизации фенотипического описания для идентификации нового биомаркерами, требуются свидетельства подавляющих деятельность новых иммунорегуляторное посредников и расширить сферу для новой клеточной терапии.

Мы предлагаем два взаимодополняющих методов оценки подавляющих активность клеток. Во-первых, в пробирке метод состоит из культивирования подавляющие клетки с метками эффекторных T клеток стимулируется аллогенной доноров антиген представляющих клеток (БТР) в различных соотношениях более 6 дней, и анализируя эффекторные T мобильных распространения, отражает доноров направленных иммуносупрессия. Клетки из очищенных крыс можно сравнить непосредственно на клетки от крыс наивными и не лечить привитые крыс для подавляющих активность (или любой другой популяции регулирования клеток), в диапазоне соотношений подавитель: эффекторные. Кроме того этот метод не требует каких-либо трансплантации, и результаты будут получены в течение 6 дней. Во-вторых метод в vivo состоит из передачи предполагаемой регуляторных клеток из обработанных крыса недавно облученного привитые получателю. В то время как клетки B, миелоидные клетки или Т-клеток от крыс-лечение наивно обычно не в состоянии препятствовать острый неприятие и продлить трансплантата выживание после приемных передачи, клетки с потенцируется подавляющих активность от лечение получатели имеют эти атрибуты 1,-2,-3,-4,-33. Лимфопения, индуцированных облучением получателя рекомендуется разрешить восприимчивую передаваемых клетки остаются незатронутыми гомеостаз крови и освоить более легко анти доноров иммунных реакций. Для обоих методов, в пробирке использования аллогенной сторонние БТРы или в естественных условиях приемных передачи подавляющие клетки в получателей, привитый сердцем сторонних позволяют анализ специфики анти доноров. В то время как в естественных условиях метода требуется значительное количество клеток, слабо представлены подавляющих активность в vitro33субпопуляции клеток может оцениваться более легко.

Гуморальные ответы также может быть измерена оценить состояние терпимости и управления направленной антитела ответов доноров антигены. Действительно терпимость может характеризоваться отсутствие гуморального иммунного ответа сторону доноров, но сохранение потенциала для получателей разрабатывать гуморальный ответ на новые антигены и сохранение памяти ответов. Во-первых принцип обнаружения alloantibody основана на признании клеток донора получателей антител после инкубации типа клеток донора с сывороткой от привитых получателя. Во-вторых, гуморальные ответы, направленные Экзогенные антигены может быть начисленных следующие стимуляции долгосрочных терпимая(ый) получателей с Keyhole Гемоцианин магнитные (KLH), эмульсии с полным Фройнд в адъювантной. Присутствие специфических IgM и IgG антител против антигенов могут быть обнаружены 4 и 13 дней, соответственно, после иммунизации, с фермента связанных Assay иммуносорбента (ELISA)34. В-третьих сохранение иммунной памяти ответов можно оценить путем инъекций культивированная красных кровяных телец (эритроцитов) дней -7 и + 3 RBCs, окрашивание с получателя сыворотки, собранных в дни + 8 и + 17, после пересадки и трансплантации. Все эти методы позволяют для выявления иммуноглобулинов подтипы, используя вторичные антитела и быстрое приобретение результаты в менее чем 1,5 h СУИМ пятнать или через несколько часов по ELISA.

Наконец эти протоколы предназначены для характеризации трансплантации модели и может быть, в некоторой степени, применяемые к моделям аутоиммунных заболеваний. Принципы метода может быть перенесен на всех видов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Примечание: Здесь все протоколы были одобрены этического Комитета и должны выполняться на основе стерильной.

1. поколение толерантности в модели аллотрансплантата сердца крыс

  1. Lew.1W LEW.1A аллотрансплантата процедуры
    1. Анестезировать доноров мужского LEW.1W крыса, используя изофлюрановая O2 ингаляции, дополненные 1% N2O после 5 минут место животного в спинной пролежни и лечить живота с Бетадин для выполнения торакотомии (то есть, разрез в плевральной полости грудной клетки).
      1. Зажим cavae уступает и Улучшенный полых, лигатура их и сократить их. Затем вырежьте аорты и легочной артерии и сохранить трансплантата в холодных 0,9% NaCl.
    2. Анестезировать 250г мужской LEW.1A получателя крыса (из 8-12 недель) с помощью изофлюрановая O2 ингаляции, дополненные 1% N2O после 5 минут место животного в спинной пролежни и лечить живота с Бетадин для выполнения xyphopubic лапаротомия (то есть, большой разрез от мечевидного отростка лобковой симфиза).
      1. Воплощать кишечника, зажим брюшной кровеносных сосудов, выполняют термино боковое анастомоза (т.е. связь между концом одного канала и стену другого) между Аорта Трансплантат и брюшной аорты и легочной артерии и брюшной верхней полой вены и удалить зажимы.
    3. Шовные мышечной плоскости и кожи и лечить с Бетадин.
    4. Придать налбуфин (обезболивающее) 6 мг/кг подкожно (с.к.) и окситетрациклину (антибиотик) внутримышечно (и.м.) и поместите животное под тепла лампы до тех пор, пока животное просыпается. Бупренорфин (опиоиды) и.м. (50 мкг/кг) и мелоксикам (нестероидные противовоспалительные препараты) (0,3 мг/кг) s.c. день трансплантации и один день после.
  2. Индукции толерантности блокадой костимуляторных взаимодействий
    1. Выполните шаги 1.1.1. до 1.1.2.
    2. В секретной A2 площади животных фонда развести 2 x 1010 инфекционные частицы AdCD40Ig (аденовирусы, кодирование CD40Ig, химерных молекула которая блокирует взаимодействие CD40-CD40L) в раствор рингера лактата достичь окончательный объем 150 мкл и вставляют в 3 очка (3 x 50 мкл) в стенке желудочка верхушки трансплантата.
    3. Выполните шаги 1.1.3 до 1.1.4.
      Примечание: Лечение AdCD40Ig может быть связан с анти CD8α, анти ИКО или анти CD28 антитела инъекции2,35,36.
  3. Индукции толерантности, гиперэкспрессия рекомбинантных белков
    1. Разбавьте 1 x 1012 вирусного генома крысы IL34-рекомбинантных AAV в раствор рингера лактата достичь окончательный объем 100 мкл. анестезировать крыса LEW.1A 150 г с изофлюрановая O2 ингаляции и вводить внутривенно (и.в.) в духе полового члена.
    2. Один месяц после инъекции AAV-IL34, выполняют LEW.1W лоскута на LEW.1A получателя согласно протоколу 1.1.

2. в Vitro оценки подавляющих активности клеток, смешанных лимфоцитов реакций (РСЗО)

Примечание: Подавляющих активность клеток от обработанной терпимая(ый) крыс следует сравнить с эквивалентной населения от сингенных привитые получателей или наивно крыс.

  1. Изоляция аллогенной БТР: плазмоцитарная дендритных клеток (PDC)
    1. Анестезировать мужской LEW.1W наивно доноров крыс с помощью изофлюрановая O2 ингаляции, дополнен с 1% N2O после 5 минут место животного в спинной пролежни и лечить живота с Бетадин для выполнения спленэктомия. Удаление селезенки, transecting сосуды, сохраните селезенки в холодную 1 X фосфат амортизированное saline (PBS) и шовные животного.
    2. Передача селезенки в блюдо, удалить ПБС и perfuse с 5 мл 0,2% d. коллагеназы Чтобы улучшить пищеварение энзима, мелко нарезать селезенки и инкубировать 15 мин при температуре 37 ° C.
    3. 500 мкл 0,1 М Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА), передача части селезенки в сито и раздавить селезенки с поршень шприца разбить ячейки. Передача в трубку и вымыть клетки с 15 мл ПБС. Центрифуга 10 мин на 430 x g. отбросить супернатант.
    4. Чтобы устранить эритроцитов и тромбоцитов, Ресуспензируйте гранулы splenocyte в 10 мл гипотонический раствор и инкубировать 5 мин при комнатной температуре (RT). Вымойте с ПБС и центрифуги 10 мин на 190 x g. удалить супернатант.
    5. Удалите коллагеновые волокна, фильтрация на фильтр ткани 100 мкм. Подсчет ячеек для регулировки концентрации клеток до 5 x 107 кл/мл в 1 X PBS/2% сыворотке крови плода теленка (FCS) / 0.5 мм ЭДТА.
      Примечание: Количество splenocytes должно составлять 4 x 10-8 и 7 x 108 клеток.
    6. Обогатить для клетки интереса, негативный выбор до сортировки клеток. Инкубируйте 15 мин при температуре 4 ° C с 2 мкг/мл очищенной антитела специфические к Т-клетки (анти TCRαβ, R7/3 клон и анти TCRγδ, V65 клон), B-клетки (анти CD45RA, OX33 клон) и НК-клеток (анти-CD161, 3.2.3 клонировать), промойте 1 X PBS/2% FCS/0.5 мм ЭДТА и центрифуги 10 мин на 430 x g . Выбросите супернатант.
    7. Вымойте с магнитной бусины 3 раза с 1 X PBS/2% FCS/0.5 мм ЭДТА. Используйте 3,5 splenocytes6 бусин/10 мкл, мыть, добавив 30 мл 1 X PBS/2% FCS/0.5 мм ЭДТА, место за 1 мин на магните и отбросить супернатант. Повторите дважды. Ресуспензируйте бисер в 10 томах 1 X PBS/2% FCS/0.5 мм ЭДТА (например, 35 мкл бусины разбавляется в 350 мкл 1 X PBS/2% FCS/0.5 мм ЭДТА).
    8. Удалите ненужные клетки путем смешивания splenocytes с магнитной бусины для 10 мин при 4 ° C при агитации, поместите трубку на магните за 1 мин и передать новой трубки супернатант. Повторите дважды. Подсчитать количество ячеек и регулировка концентрации клеток до 5 x 107 клеток/мл в 1 X PBS/2% FCS/0.5 мм ЭДТА.
      Примечание: Номер обогащенного splenocytes должен колеблется в пределах 5 x 10-7 и 9 x 10-7.
    9. Запятнать клетки, используя обозначенные антитела для дальнейшей сортировки pDCs: исключить оставшиеся ячейки T (анти TCRαβ, R7/3 клон) или B (анти CD45RA, OX33 клон) и сортировать CD4+ (анти CD4, клон OX35) CD45R+ клеток (анти CD45R, His24 клон). Метки бисер с каждой Ab установить матрицу компенсации на СУИМ. Инкубируйте 15 мин при температуре 4 ° C и мыть с 1 X PBS/2% FCS/0.5 мм ЭДТА.
    10. Ресуспензируйте клетки в концентрации 5 x 107 кл/мл, фильтр фильтр ткани 60 мкм и ярлык омертвевшие клетки, добавив DAPI в конечной концентрации 0,1 мкг/мл. Сортировать клетки с 70 мкм сопла клеток сортировщик, стробирования на CD45RA TCR–DAPI––CD4+CD45R+ , как показано на рисунке 1.
  2. Изоляции клеток-эффекторов T ответчика (CD4 + CD25 – Т-клеток)
    1. Урожай хандры от крыс LEW.1A-лечение не привитые наивными и сохранить его в холодную 1 X PBS.
    2. Передача селезенки в сито, помещаются в блюдо и добавляют 10 мл ПБС. Раздавить селезенки с поршень шприца разбить ячейки. Перевести клетки в 50 мл трубки, мыть с ПБС и центрифуги 10 мин на 430 x g. удалить супернатант.
    3. Чтобы устранить эритроцитов и тромбоцитов, Ресуспензируйте гранулы splenocyte в 10 мл гипотонический раствор для 5 мин на RT, затем промыть в 1 ПБС и центрифуги в g. 190 x 10 мин отбросить супернатант.
    4. Удалите коллагеновые волокна, фильтрация на фильтр ткани 100 мкм. Подсчет ячеек для регулировки концентрации клеток до 5 x 107 кл/мл в 1 X PBS/2% FCS/0.5 мм ЭДТА.
      Примечание: Количество splenocytes должно составлять 3 x 108 и 5 x 108 клеток.
    5. Обогатить клетки интереса до сортировки. Инкубируйте 15 мин при температуре 4 ° C с 2 мкг/мл очищенной антитела специфические к CD8 клетки (анти CD8α, OX8 клон), B-клетки (анти CD45RA, OX33 клон), НК-клетки (анти-CD161, 3.2.3 клонировать), миелоидных клеток (анти CD11b/c, OX42 клон), Гамма Дельта T клетки (анти TCRγδ, V65 клон). Затем промойте 1 X PBS/2% FCS/0.5 мм ЭДТА и центрифуги 10 мин на 430 x g. удалить супернатант.
      Примечание: Для сортировки природных CD8+ Tregs от наивного крыс в то же время как CD4+ клеток-эффекторов T, не добавляйте анти CD8α Ab во время истощения.
    6. Вымойте магнитной бусины 3 раза с 1 X PBS/2% FCS/0.5 мм ЭДТА как описано в шаге 2.1.7.
    7. Удалите ненужные клетки путем смешивания splenocytes с магнитной бусины для 10 мин при температуре 4 ° C под агитации, а затем поместить трубку на магните за 1 мин и передачи супернатант новой трубки. Повторите дважды. Подсчитать количество ячеек и регулировка концентрации клеток до 5 x 107 клеток/мл в 1 X PBS/2% FCS/0.5 мм ЭДТА.
      Примечание: Splenocytes номер должна варьироваться от 5 x 10-7 и 8 x 107 клеток.
    8. Добавьте обозначенные антитела для сортировки CD4+CD25– Т-клеток: анти TCRαβ (клон R7/3), анти-CD4 (OX35 клон), анти CD25 (OX39 клон) и инкубировать 15 мин при 4 ° C. Чтобы одновременно сортировать CD8+CD45RCнизкой Tregs, добавить анти CD45RC Ab (OX22 клон). Метки бисер с каждой Ab создать матрицу компенсации для дальнейшей обработки на проточной цитометрии. Вымыть клетки с 1 X PBS/2% FCS/0.5 мм ЭДТА и удалить супернатант.
    9. Ресуспензируйте клетки клетки 5 x 10- 7/мл, фильтр фильтр ткани 60 мкм и ярлык омертвевшие клетки, добавив DAPI в конечной концентрации 0,1 мкг/мл. Сортировать стробирования на TCR DAPI –+CD4 клеток с сортировщик клеток сопла 70 мкм+CD25– клетки как ответчик клетки (и при необходимости TCR DAPI –+CD4–CD45RCнизкой как CD8+ Подавляющие клетки Tregs) как показано на рисунке 2.
  3. Изоляция подавляющие клетки
    Примечание: Разделить селезенки в двух аликвоты: сортировать один на клетки B, миелоидных клеток и НК-клеток, а другой на CD4+ и CD8 клетки+ CD45RCнизкой T, оценить их блокирующая функция.
    Примечание: Для передачи приемным клеток, сохраните splenocytes8 1 x 10 в качестве позитивного управления терпимости приемных переводом, при необходимости.
    1. Сортировка клетки B, миелоидных клеток и NK клеток
      1. Следуйте протоколу 2.1.1 до 2.1.5.
      2. Инкубируйте 15 мин при температуре 4 ° C с 2 мкг/мл Т клеток конкретных без маркировки антител (анти TCRαβ, R7/3 клон и анти TCRγδ, V65 клонировать), промойте с 1 X PBS/2% FCS/0.5 мм ЭДТА и центрифуги 10 мин на 430 x g. удалить супернатант.
      3. Вымойте с магнитной бусины 3 раза с 1 X PBS/2% FCS/0.5 мм ЭДТА как описано в шаге 2.1.7.
      4. Смешайте splenocytes с магнитной бусины удалить ненужные клетки и проинкубируйте втечение 10 мин при температуре 4 ° C под психомоторное возбуждение, а затем поместить трубку на магните за 1 мин и передать новой трубки супернатант. Повторите дважды. Подсчитать количество ячеек и регулировка концентрации клеток до 5 x 107 клеток/мл в 1 X PBS/2% FCS/0.5 мм ЭДТА.
      5. Добавьте обозначенные антитела splenocytes для сортировки клеток с подозрением подавляющих активность, например миелоидных клеток (анти CD11b/c, OX42 клон), B-клетки (анти CD45RA, OX33 клон) или НК-клеток (анти CD161, 3.2.3 клон). Метки бисер с каждой Ab установить матрицу компенсации на СУИМ. Инкубируйте 15 мин при температуре 4 ° C и мыть с 1 X PBS/2% FCS/0.5 мм ЭДТА.
      6. Ресуспензируйте клетки в концентрации 5 x 107 кл/мл, фильтр фильтр ткани 60 мкм и ярлык омертвевшие клетки, добавив DAPI в конечной концентрации 0,1 мкг/мл. Сортировать клетки с 70 мкм сопла клеток сортировщик стробирования на DAPI–CD11b/c+ для миелоидных клеток CD45RA+ для клетки B и CD161+ для НК-клеток, как показано на рисунке 3.
    2. Сортировка CD4 + и CD8 + CD45RC низкой T клетки
      1. Следуйте протоколу 2.2.1 по 2.2.4.
      2. Для негативный выбор на магнитной столбца, инкубировать 15 мин при температуре 4 ° C с 2 мкг/мл очищенной антитела специфические к B клеток (анти CD45RA, OX33 клон), НК-клетки клетки (анти-CD161, 3.2.3 клонировать), миелоидных клеток (анти CD11b/c, OX42 клон), клетки (Гамма Дельта T анти TCRγδ, V65 клон), вымыть их с 1 X PBS/2% FCS/0.5 мм ЭДТА и центрифуги 10 мин на 430 x g. удалить супернатант.
      3. Вымойте магнитной бусины 3 раза с 1 X PBS/2% FCS/0.5 мм ЭДТА как описано в шаге 2.1.7.
      4. Удалите ненужные клетки путем смешивания splenocytes с магнитной бусины для 10 мин при температуре 4 ° C под агитации, а затем поместить трубку на магните за 1 мин и передачи супернатант новой трубки. Повторите дважды. Подсчитать количество ячеек и регулировка концентрации клеток до 5 x 107 клеток/мл в 1 X PBS/2% FCS/0.5 мм ЭДТА.
      5. Добавьте обозначенные антитела к клеткам для сортировки Tregs: анти TCRαβ (клон R7/3), анти CD4 (OX35 клон), анти CD45RC (OX22 клон). Метки бисер с каждой Ab установить матрицу компенсации на СУИМ. Инкубируйте 15 мин при температуре 4 ° C и мыть с 1 X PBS/2% FCS/0.5 мм ЭДТА.
      6. Ресуспензируйте клетки в концентрации 5 x 107 кл/мл, фильтр на 60 мкм ткани и ярлык омертвевшие клетки, добавив DAPI в конечной концентрации 0,1 мкг/мл. Сортировать клетки с 70 мкм сопла клеток сортировщик стробирования на DAPI–TCR+CD4+CD45RCнизкой как CD4+Tregs и DAPI–TCR+CD4–CD45RC низкой как CD8+Tregs ( рис. 4).
        Примечание: Анти CD8α Ab (OX8 клон) может использоваться вместо анти CD4 Ab если T-клетки подвергаются от CD4+-T клетки, снабдив анти TCR. Избыток CD4+Tregs должны быть отсортированы в ожидании смерти клетки за счет маркировки краситель распространения клеток (ДСП).
  4. Карбоксифлуоресцеина succinimidyl эфира (CFSE) маркировки ответчика клеток для измерения распространения
    1. После сортировки клеток ответчика мыть дважды клетки с ПБС.
    2. Ресуспензируйте клетки в концентрации 1 x 10-7 кл/мл в 1 X PBS и проинкубируйте с 0,5 мкм CFSE 5 мин на RT в темноте. Остановить реакции, добавив FCS в 1,5 раза объем и центрифуги 10 мин на 430 x g при 4 ° C. Выбросите супернатант.
    3. Мыть дважды клетки с полного среднего и подсчитать количество ячеек.
      Примечание: Ожидаете 30% гибели клеток на этот шаг.
  5. ДСП маркировки CD4 + Tregs для супрессивной assay на CD4 + эффекторных клеток
    Примечание: Этот шаг необходим для дискриминации CD4 CFSE–+Tregs CFSE– пролиферирующих ответчика CD4+Т-клеток в день 6 coculture, строб на ДСП– клетки.
    1. После CD4+ Tregs ячейку Сортировка, мыть дважды клетки с ПБС.
    2. Ресуспензируйте клетки в концентрации 1 x 10-7 кл/мл в 1 X PBS и проинкубируйте с 10 мкм V450 ДСП для 20 минут RT в темноте.
    3. Мыть дважды клетки с полного среднего и подсчитать количество ячеек.
      Примечание: Ожидаете 30% гибели клеток на этот шаг.
  6. Советы для coculture
    1. Использование культуры в составе средних: RPMI 1640 среднего дополнена FCS (бета меркаптоэтанол (5 x 10-5 М), пенициллин (100 ед/мл), стрептомицин (0,1 мг/мл), пируват натрия (1 мм), глютамин (2 мм), HEPES буфера (1 мм), несущественные аминокислот (1 X), 10%).
    2. Культура клетки в U 96-луночных нижней плиты.
    3. Добавление ячеек в следующем порядке: подавляющие клетки, клетки ответчика и аллогенных клеток.
    4. Держите постоянное количество клеток ответчика Т и аллогенной БТР и проверить диапазон Tregs номер. Например, соотношение 4:4:1, 5 x 104 подавляющие клетки, клетки 5 х 104 ответчика и 1,25 х 104 аллогенных клеток и соотношение 2:4:1, 2.5 x 104 подавляющие клетки, клетки 5 х 104 ответчика и 1,25 х 104 аллогенной клетки.
    5. Сохранить долю 5 х 104 ответчика клеток для 200 мкл среднего/хорошо.
    6. Для элементов управления включают несколько скважин с ответчика T клетки без аллогенной БТР (отрицательный контроль) и ответчик T клетки с аллогенной БТР без регуляторных клеток (положительный контроль) для CFSE стробирования на день 6 (см. шаг 2.7.6.).
  7. Пятнать СУИМ и анализ после 6 дней coculture
    Примечание: Распространение эффекторных клеток может быть оценена в нескольких точках времени. Обратите внимание, что распространение является Экспоненциальная: как деление клеток увеличивается, может наблюдаться более различия между подавляющих условий и отрицательного контроля.
    1. Клетки перехода от U 96-луночных нижней пластины-96-луночных V дно тарелки и центрифуги 1 мин на 1200 x g при 4 ° C.
    2. Сохраните супернатант в новой пластины при-20 ° C для измерения уровни цитокина, при необходимости.
    3. Вымыть клетки с 200 мкл 1 X PBS/2% FCS/0.5 мм ЭДТА в колодец и центрифуге 1 мин на 1200 x g при 4 ° C.
    4. Добавить антитела к клеткам для дальнейшего ворот на ответчика T клетки: анти TCRab (клон R7/3) и анти CD4 (OX35 клон). Инкубируйте 15 мин при температуре 4 ° C и мыть дважды с 200 мкл 1 X PBS/2% FCS/0.5 мм ЭДТА в хорошо. Выбросите супернатант.
    5. Добавьте 100 мкл DAPI разбавляют в 0,1 мкг/мл в 1 X PBS и читать пластину с помощью анализатора СУИМ.
    6. Анализировать профиль CFSE, строб на DAPI отрицательной (живые клетки) ДСП отрицательный (не CD4+Tregs) TCR+CD4+ клеток. Кератоз ответчика клетки имеют максимальную яркость CFSE, как показано на рисунке 5 нижней левой гистограммы. Присутствии аллогенной БТР ответчик клетки имеют максимальное распространение и минимальной яркости CFSE (нижний, средний). Присутствии аллогенной БТР и регуляторных клеток эффекторные клетки имеют средний распространения и CFSE яркость (внизу, справа).

3. в естественных условиях оценки подавляющих активности клеток путем передачи приемным клетки в сердце привитые получателя

Примечание: Облучение необходимо ликвидировать клетки хозяина и пользу доноров клеток приживления и распространения.

  1. Облучить трансплантата получателей рано на день раньше трансплантата для предварительных условий получателя. Анестезировать крыс с i.m. инъекции Ксилазина (8 мг/кг)-кетамин (80 мг/кг) и облучать их в дозе 4,5 гр с Х-лучей.
  2. Следуйте протоколу 2.3 изолировать клетки интереса.
    Примечание: Сохраните splenocytes8 1 x 10 в качестве позитивного управления толерантности приемных переводом, при необходимости.
  3. 12 ч после облучения (накануне трансплантата, вечером), анестезировать крыс при вдыхании 4% изофлюрановая O2 и наполнить клетки (5,0 x 107 Т-клеток, 3.0 x 107 B клеток, 3.0 x 107 миелоидных клеток или 1,50 x 108 splenocytes как положительный контроль терпимости приемных переводом) и.в. в духе полового члена.
    Примечание: Количество клеток, необходимых для терпимости приемных переводом зависит подавляющих активность клеток.
  4. Следующий день, следуйте протокол 1.1 для выполнения аллотрансплантатом. Проследить эволюцию имплантата при пальпации через живот.

4. доноров специфическое антитело обнаружения

Примечание: IgG ответы, направленные донор трансплантата измеряются инкубации клеток от донора с сывороткой получателя. Вычитание фона, вызванных прямым пятная клетки LEW.1W B по инкубации клеток с сингенной LEW.1W сыворотки.

  1. Сбор крови от крыс и центрифуги 15 мин на 1200 x g при 4 ° C. Сохраните сыворотки. Сыворотки можно хранить при-20 ° C или используется сразу. Инактивирует дополнением в sera, инкубации на 30 минут при 56 ° C.
  2. Урожай хандры от крыс LEW.1W доноров и сохранить его в холодную 1 X PBS. Следуйте указаниям 2.2.1. для 2.2.4. Добавьте 2 x 105 клеток/колодец в 96-луночных V нижней пластине. Центрифуга 1 мин на 1200 x g при 4 ° C и удалить супернатант.
  3. Разбавить sera последовательно от 1/10 до 1/270 в 1 X PBS (4 разведений/образец). Инкубируйте клетки за 1 час при температуре 4 ° C с 25 мкл разбавленного сыворотка/хорошо. Предвидеть количество доноров конкретных IgG подтипы (IgG, IgG1, IgG2a, IgG2b) иммунного ответа для анализа на сэмпл (1 сыворотки x 4 разведения x 4 IgG подтипов). Вымыть клетки с 1 X PBS/2% FCS/0.5 мм ЭДТА и удалить супернатант.
  4. Инкубируйте клетки с каждого анти крысы мыши IgG подтипа Ab помечены флюрохром за 30 мин при 4 ° C, один подтип/хорошо.
    Примечание: Если флюрохром помечены анти крыса Ig Ab недоступны, это можно использовать очищенный немеченого мыши анти крыса IgG подтип Ab и флюрохром меченых вторичных анти мышь Ab. в зависимости от имеющихся флуорохромов и цитометр конфигурации, несколько подтипов IgG против крыс может испытываться в одной скважине с соответствующими параметрами.
  5. Вымыть клетки с 1 X PBS/2% FCS/0.5 мм ЭДТА дважды и удалить супернатант.
  6. Добавьте 100 мкл DAPI разбавляют в 0,1 мкг/мл в PBS и читать пластину с помощью анализатора СУИМ.
  7. Читайте интенсивность средняя флуоресцирования (MFI) подтипа IgG против крыс, которое Ab помечены флюрохром на всех DAPI– клетки. Вычесть МФО, полученные с наивным LEW.1A сыворотки на LEW.1W клетки (окрашивания фона, внизу слева) от МФО, полученные с sera от каждого получателя на LEW.1W клетки на соответствующий разрежения (нижний средний для необработанных отвергая получателей, отображения максимального МФО и нижней право для очищенных терпимая(ый) получателей, которые отображаются промежуточные МФО) (рис. 6).

5. Оценка гуморальные ответы на экзогенные антигены (наивный и памяти)

Примечание: Сыворотка от крыс до трансплантации, лечение и иммунизации должны использоваться как негативный контроль гуморальные ответы. В противном случае может использоваться крысы-прививки наивными. Сыворотка от иммунокомпетентных получателей, то есть, пересаженные exoantigen прививки и отвергая получателей, используются в качестве позитивных элементов гуморальные ответы.

  1. Потенциал для разработки гуморальный ответ на новый антигена (рис. 7)
    Примечание: Этот метод является относительной количественную оценку гуморальные ответы, как он не включает стандарт. Абсолютной Ig количественной можно, добавив ряд разведения крыса IgG и IgM анти KLH Ab с известной концентрацией на шаге 5.1.6.
    1. Эмульсию 50 мкг KLH в 200 мкл полного адъюванта 's Фройнд и привнести в хвост длинные выжившие/терпимая(ый) получателей, управления необработанными отвергая получателей или наивно крыс как положительный контроль гуморальные ответы.
    2. Собрать образцы крови на 4 и 13 дней после вакцинации и центрифуги 15 мин на 1200 x g при 4 ° C. Сохранить верхний этап это сыворотки. Урожай сыворотки от крыс прививки для отрицательного контроля. Сыворотке крови могут быть заморожены при-20 ° C до анализа ELISA.
    3. Слой ELISA плиты (плоское дно) с 50 мкл/хорошо KLH разводят в 10 мкг/мл в 1 X PBS на ночь при 4 ° C. Убедитесь, что решение покрытие охватывает все скважины.
    4. Удалите избыток немелованной KLH промывкой. Мыть, добавить 150 мкл/хорошо мыть буфера (ПБС, содержащие 0,1% анимации) и Флик.
    5. Блок неспецифических привязка получателя Ig, инкубировать в течение 1 ч при 37 ° C с 100 мкл/хорошо мыть буфера, содержащий 10% FCS. Мыть раз.
    6. Серийно разбавить получателя sera в буфере мыть, начиная с 1/40 1/512, добавьте 50 мкл/хорошо в дубликаты серийный разрежения на пластину с покрытием и проинкубируйте втечение 2 ч при 37 ° C. Держите некоторые скважины бесплатно сыворотки для отрицательного контроля. Мыть дважды.
    7. Добавьте 50 мкл 1 мкг/мл конъюгированных биотина анти крысы IgM Ab в скважинах содержащих сыворотку собирают на 4 день в получателей, или 50 мкл конъюгированных биотина анти крыса IgG в скважинах содержащих сыворотки, найденным на 13 день и инкубировать 1 час при температуре 37 ° C. Мыть дважды.
    8. Добавьте 50 мкл/колодец HRP-конъюгированных стрептавидина на 1 мкг/мл в течение 45 минут при 37 ° C. Вымойте 3 раза.
    9. Добавьте 50 мкл 3, 3 ', 5, 5 ' тетраметилбензидина (ТМБ) субстрат для < 30 мин на RT и остановить реакции с 25 мкл 2м серной кислоты при положительном, что контроль насыщения.
    10. Читайте поглощения в 405 нм. Сравните полученные с получателя сыворотки для одного, полученные с наивными крысы управления сыворотки оптической плотности.
  2. Оценка потенциала реагирования гуморального памяти (рис. 8)
    1. 7 дней до трансплантации, придать и.в. 109 культивированная RBCs, разбавленных в 800 мкл ПБС в наивной крыс. Эритроцитов может быть от овцы, лошади или любых других видов.
    2. Выполните трансплантации и управлять tolerogenic лечение.
    3. через 3 дня после трансплантата, снова придать i.v.109 РБК, разбавленных в 800 мкл ПБС в трансплантата получателей и не привитые крыс.
    4. Урожай после второй иммунизации и центрифуги 15 мин на 1200 x g при 4 ° C для восстановления этапа верхней сыворотки крови образцы 5 и 14 дней. Сыворотки можно хранить при-20 ° C или используется сразу. Инактивирует дополнением в крыса сера, инкубировать 30 мин при 56 ° C перед использованием.
    5. Добавьте 2 x 105 РБК/хорошо 96-луночных V нижней плиты. Центрифуга 1 мин на 1200 x g при 4 ° C и тщательно удалить супернатант стремлением.
    6. Серийно разбавить sera вдвое от 1/10 до 1/1280 в 1 X PBS (8 разведений/образец). Инкубируйте клетки за 1 час при температуре 4 ° C с 25 мкл разбавленного сыворотка/хорошо. Вымыть клетки с 1 X PBS/2% FCS/0.5 мм ЭДТА и удалить супернатант.
    7. Инкубируйте клетки с РБК адсорбированные видов анти крыса IgG или IgM подтипы помечены флюрохром за 30 мин при 4 ° C, один подтип/хорошо. Оценить крыса IgM и IgG анти РБК в сыворотке крови собирают 5 и 14 дней после иммунизирования, соответственно. Вымыть клетки с 1 X PBS/2% FCS/0.5 мм ЭДТА дважды и удалить супернатант.
      Примечание: Если флюрохром помечены анти крыса Ig Ab недоступны, это можно использовать очищенный немеченого мыши анти крыса IgG подтип Ab и флюрохром меченых вторичных анти мышь Ab.
    8. 100 мкл DAPI разбавляют в 0,1 мкг/мл в 1 X PBS и анализировать клетки с помощью анализатора СУИМ.
    9. МФО представляют как функция разрежения для каждой группы.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Оценка деятельности подавляющих после сортировки БТР (рис. 1), ответчик клеток и Tregs одновременно (рис. 2), или индивидуально (рис. 4), и любые другие предполагаемые регуляторных клеток (рис. 3), может быть сделано в естественных условиях путем прямого впрыска регуляторных клеток и в пробирке путем измерения яркости CFSE (рис. 5

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Приемных передача всего splenocytes в недавно привитых получателя является эффективным способом обнаружить присутствие регуляторных клеток индуцированных или потенцированные лечения. Хост, облучение индуцированной переходных лимфопения способствует выживаемость клеток после передачи и установление терпимости. Кроме того, югу смертоносных облучения листья время для ячеек с tolerogenic свойствами для преобразования в новых регулирующих клеток во время восстановления иммунитета, явление, называемое инфекционных терпимости

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что они не имеют никаких финансовых интересов.

Благодарности

Эта работа осуществлялась в контексте проекта Labex IGO (n ° АНР-11-LABX-0016-01), который является частью программы правительства Франции «Investissements будущее», управляемой НРУ (АНР-11-LABX-0016-01), а также финансируемый IHU-Сести» Investissements будущее» французское правительство программы, управляемые по французского национального исследования агентства (НРА) (АНР-10-IBHU-005). IHU-Сести проект поддерживается также Métropole Нант и округов Луары.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
animals
LEW.1W и крысы LEW.1AJanvier Labs, Франция8 недель, 
BN сторонние донорские крысыJanvier Labs, Франция8 недель, 
name<strong>companyномер в каталоге>comments
>reagents
AdCD40IgViral Vector Core, INSERM UMR 1089, Нант, Франциядомашние плазмиды
IL34-AAVViral Vector Core, INSERM UMR 1089, Нант, Франциядомашние плазмиды
FGL2-AAVViral Vector Core, INSERM UMR 1089, Нант, Франциядомашние плазмиды
анти-TCRabHybridoma из Европейской коллекции клеточных культур, Солсбери, ВеликобританияR7/3 клонДомашняя культура, очистка и связывание флуоророфоров
анти-CD25Hybridoma из Европейской коллекции клеточных культур, Солсбери, ВеликобританияклонOX39Домашняя культура, очистка и связывание флуоророфоров
анти-CD8Hybridoma из Европейской коллекции клеточных культур, Солсбери, ВеликобританияКлон OX8Домашняя культура, очистка и связывание флуоророфоров
анти-CD45RAHybridoma из Европейской коллекции клеточных культур, Солсбери, ВеликобританияКлон OX33Домашняя культура, очистка и связывание флуоророфоров
анти-CD161Hybridoma из Европейской коллекции клеточных культур, Солсбери, Великобритания3.2.3 клонДомашняя культура, очистка и связывание флюорофоров
анти-CD11b/cHybridoma из Европейской коллекции клеточных культур, Солсбери, ВеликобританияOX42 клонДомашняя культура, очистка и связывание флуоророфоров
анти-TCRgdHybridoma из Европейской коллекции клеточных культур, Солсбери, ВеликобританияклонV65Домашняя культура, очистка и связывание флюорофоров
анти-CD45RCHybridoma из Европейской коллекции клеточных культур, Солсбери, ВеликобританияOX22 клонДомашняя культура, очистка и соединение флуорофоров
анти-CD4Hybridoma из Европейской коллекции клеточных культур, Солсбери, ВеликобританияКлон OX35Домашняя культура, очистка и соединение флуоророфоров
анти-CD45RBD Biosciences, Маунтин-Вью, Калифорния#554881, His24 клон
антикрысиного IgG-FITCImmunoResearch Laboratories, INC, Балтимор, США#112-096-071
противокрысиный IgG1Serotec#MCA 194
противокрысиный IgG2aSerotec#MCA 278
противокрысиный IgG2bSerotec#MCA 195
противокрысиный IgM-FITCJackson ImmunoResearch Laboratories, INC, Балтимор, США#115-095-164
стрептавидин HRPBD Biosciences, Маунтин-Вью, Калифорния#554066
KLHSigma Aldrich, Сент-Луис, США#9013-72-3
PBS 1XThermo Fisher  Scientific Inc, СШАФосфатный буферный раствор без кальция и магния, 
Tween 20Sigma, Saint-Louis, США#9005-64-5
Набор реагентов на субстрат TMBBD Biosciences, Маунтин-Вью, Калифорния#555214
CellTraceTM набор для пролиферации клеток CFSEThermo Fisher  Scientific Inc, США#C34554
RPMI 1640 средний 1XThermo Fisher  Scientific Inc, США#31870-025
пенициллин стрептомицинThermo Fisher  Scientific Inc, США# 15140-122
Hepes BufferThermo Fisher  Scientific Inc, США#15630-056
заменимые аминокислотыThermo Fisher  Scientific Inc, США#11140-035
Пируват натрияThermo Fisher  Scientific Inc, США#11360-039
2 бета меркаптоэтанолSigma, Сен-Луи, США#M3148
Пролиферация клеток Краситель eFluor® 450 CellThermo Fisher  Scientific Inc, США#65-0842-85
ГлутаминСигма, Сент-Луи, США#G3126
DAPIThermo Fisher  Scientific Inc, США#D1306
Collagenase DRoche Diagnostics, Германия#11088882001
EDTASigma, Сен-Луи, США#E5134
NaCl 0,9%Fresenius Kabi#B230561
Magnetic dynabeadsDynal, Invitrogen#11033Goat anti-mouse IgG
One Comp eBeadsEbiosciences, Сан-Диего, США#01-1111-42
БетадинОбратитесь к институциональным рекомендациям
ИзофлуранОбратитесь к институциональным рекомендациям
НаплбуфинОбратитесь к институциональным рекомендациям
ТеррамицинОбратитесь к институциональным рекомендациям
БупренорфинОбратитесь к институциональным руководящие принципы
МелоксикамОбратитесь к институциональным рекомендациям
Полный адъювант
РомпунОбратитесь к институциональным рекомендациям
Рингер лактатОбратитесь к институциональным рекомендациям
КетаминОбратитесь к институциональным рекомендациям
для лизиса эритроцитовРазбавьте 8,29 г NH4Cl (Sigma, Saint-Louis, США A-9434), 1 г KHCO3 (Prolabo 26 733.292) и 37,2 мг ЭДТА (Sigma, Сен-Луи, США E5134) в 800 мл H2O. Отрегулируйте pH до 7,2-7,4 и доведите до 1 л с H2O.
Коллагеназа DРазведите 1 г коллагеназы в 500 мл RPMI-1640 + 5 мл Hepes + 2% FCS
PBS-FCS (2%)-ЭДТА (0,5%)Добавьте5 мл ЭДТА 0,1М (Sigma, Saint-Louis, США E5134) и 20 мл FCS в 1 мл PBS 1X
CFSE (Vybrant CFDA SE Cell Tracer Kit Invitrogen)Разбавляйте 50&микро; г (=1 флакон) CFDA SE (компонент А) в 90&м; l DMSO (компонент B) раствор для получения стокового раствора 10mM. Затем разведите стоковый раствор на 1/20 000 в PBS 1X до получения 0,5°; M
раствор полной среды для кокультуры500 мл полной среды RPMI-1640 с 5 мл пенициллина (80 ед/мл)-стептомицина (80 мг/мл), 5 мл L-глутамина, 5 мл заменимых аминокислот (100X), 5 мл пирувата натрия (100 мМ), 5 мл буфера HEPES (1 мл), 2,5 мл b меркаптомметанола (7 мл 2-бмеркаптоэтанола в 10 мл RPMI), 10% FCS
strong>name<strong>company<номер в каталоге>strongcomments
equipments
falcon 50 млBD Biosciences, Маунтин Вью, CA# 227261
сокол 15 млBD Biosciences, Маунтин Вью, CA# 188271
сито
Пластиковые тарелки для культуры CorningVWR, Pessac#391-0439
100&микро; М и 60&микро; м тканевые фильтрыСефар НИТЕКС, Хайден, Швейцария#03-100/44 и #03-60/35
96 лунок U донные пластины для кокультуры  Falcon U-bottom Tissue Culture plate, стерильный, Corning#353077
96 лунок V донные пластины для окрашивания FACSThermoScientifique, Danemark#249570
96 лунок плоскодонные пластины ELISANunc Maxisorb
seringue for spleen crushBD Biosciences, Mountain View, CA#309649
ELISA readerSPARK 10M, Текан, ШвейцарияSPARK 10M, Текан, Швейцария
центрифуга
для хранения марии;
рентгеновский облучательЛинколшир, АнглияФакситрон CP160
солнечный мешалка
FACS Canto IIBD Biosciences, Маунтин-Вью, CA
FACS Aria IIBD Biosciences, Маунтин-Вью, CA
магнитThermo Fisher  Scientific Inc, США12302D
Jackson ФрейндаРаствор <

Ссылки

  1. Guillonneau, C., et al. CD40Ig treatment results in allograft acceptance mediated by CD8CD45RC T cells, IFN-gamma, and indoleamine 2,3-dioxygenase. J Clin Invest. 117 (4), 1096-1106 (2007).
  2. Bézie, S., et al. Compensatory Regulatory Networks between CD8 T, B, and Myeloid Cells in Organ Transplantation Tolerance. J Immunol. 195 (12), 5805-5815 (2015).
  3. Bézie, S., et al. Fibrinogen-Like Protein 2/Fibroleukin Induces Long-Term Allograft Survival in a Rat Model through Regulatory B Cells. PloS One. 10 (3), e0119686(2015).
  4. Bézie, S., et al. IL-34 is a Treg-specific cytokine and mediates transplant tolerance. J Clin Invest. 125 (10), 3952-3964 (2015).
  5. Li, X. L., et al. Mechanism and localization of CD8 regulatory T cells in a heart transplant model of tolerance. J Immunol. 185 (2), 823-833 (2010).
  6. Guillonneau, C., Bézie, S., Anegon, I. Immunoregulatory properties of the cytokine IL-34. Cell Mol Life Sci. , (2017).
  7. Nickeleit, V., Zeiler, M., Gudat, F., Thiel, G., Mihatsch, M. J. Detection of the complement degradation product C4d in renal allografts: diagnostic and therapeutic implications. J Am Soc Nephrol. 13 (1), 242-251 (2002).
  8. Chiffoleau, E., et al. Induction of donor-specific allograft tolerance by short-term treatment with LF15-0195 after transplantation. Evidence for a direct effect on T-cell differentiation. Am J Transplant. 2 (8), 745-757 (2002).
  9. Khattri, R., Cox, T., Yasayko, S. A., Ramsdell, F. An essential role for Scurfin in CD4+CD25+ T regulatory cells. Nat Immunol. 4 (4), 337-342 (2003).
  10. Liu, W., et al. CD127 expression inversely correlates with FoxP3 and suppressive function of human CD4+ T reg cells. J Exp Med. 203 (7), 1701-1711 (2006).
  11. Sakaguchi, S., Sakaguchi, N., Asano, M., Itoh, M., Toda, M. Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains (CD25). Breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune diseases. J Immunol. 155 (3), 1151-1164 (1995).
  12. Dai, Z., et al. Natural CD8+CD122+ T cells are more potent in suppression of allograft rejection than CD4+CD25+ regulatory T cells. Am J Transplant. 14 (1), 39-48 (2014).
  13. Guillonneau, C., Picarda, E., Anegon, I. CD8+ regulatory T cells in solid organ transplantation. Curr Opin Organ Transplant. 15 (6), 751-756 (2010).
  14. Kim, H. J., et al. Stable inhibitory activity of regulatory T cells requires the transcription factor Helios. Science. 350 (6258), 334-339 (2015).
  15. Manavalan, J. S., et al. Alloantigen specific CD8+CD28- FOXP3+ T suppressor cells induce ILT3+ ILT4+ tolerogenic endothelial cells, inhibiting alloreactivity. Int Immunol. 16 (8), 1055-1068 (2004).
  16. Picarda, E., et al. Transient antibody targeting of CD45RC induces transplant tolerance and potent antigen-specific regulatory T cells. JCI Insight. 2 (3), e90088(2017).
  17. Ménoret, S., et al. Phenotypic and functional characterization of CD8(+) T regulatory cells. Methods Mol Biol. 677, 63-83 (2011).
  18. Boor, P. P. C., et al. Human plasmacytoid dendritic cells induce CD8+ LAG-3+ Foxp3+ CTLA-4+ regulatory T cells that suppress allo-reactive memory T cells. Eur J Immunol. 41 (6), 1663-1674 (2011).
  19. Olson, B. M., Sullivan, J. A., Burlingham, W. J. Interleukin 35: a key mediator of suppression and the propagation of infectious tolerance. Front Immunol. 4, 315(2013).
  20. Shimizu, J., Yamazaki, S., Takahashi, T., Ishida, Y., Sakaguchi, S. Stimulation of CD25(+)CD4(+) regulatory T cells through GITR breaks immunological self-tolerance. Nat Immunol. 3 (2), 135-142 (2002).
  21. Myers, L., Croft, M., Kwon, B. S., Mittler, R. S., Vella, A. T. Peptide-specific CD8 T regulatory cells use IFN-gamma to elaborate TGF-beta-based suppression. J Immunol. 174 (12), 7625-7632 (2005).
  22. Bouaziz, J. D., Le Buanec, H., Saussine, A., Bensussan, A., Bagot, M. IL-10 producing regulatory B cells in mice and humans: state of the art. Curr Mol Med. 12 (5), 519-527 (2012).
  23. Durand, J., Chiffoleau, E. B cells with regulatory properties in transplantation tolerance. World J Transplant. 5 (4), 196-208 (2015).
  24. Pallier, A., et al. Patients with drug-free long-term graft function display increased numbers of peripheral B cells with a memory and inhibitory phenotype. Kidney Int. 78 (5), 503-513 (2010).
  25. Guillonneau, C. Efficacy of Myeloid Derived Suppressor Cells on Transplant Survival. Transplantation. 99 (10), 2017-2019 (2015).
  26. Wood, K. J., Bushell, A., Hester, J. Regulatory immune cells in transplantation. Nat Rev Immunol. 12 (6), 417-430 (2012).
  27. Han, Y., et al. Pathogen-expanded CD11b+ invariant NKT cells feedback inhibit T cell proliferation via membrane-bound TGF-β1. J Autoimmun. 58, 21-35 (2015).
  28. Mesnard, L., et al. Invariant natural killer T cells and TGF-beta attenuate anti-GBM glomerulonephritis. J Am Soc Nephrol. 20 (6), 1282-1292 (2009).
  29. Mi, Q. S., Ly, D., Zucker, P., McGarry, M., Delovitch, T. L. Interleukin-4 but not interleukin-10 protects against spontaneous and recurrent type 1 diabetes by activated CD1d-restricted invariant natural killer T-cells. Diabetes. 53 (5), 1303-1310 (2004).
  30. Sharif, S., et al. Activation of natural killer T cells by alpha-galactosylceramide treatment prevents the onset and recurrence of autoimmune Type 1 diabetes. Nat Med. 7 (9), 1057-1062 (2001).
  31. Wermeling, F., Lind, S. M., Jordö, E. D., Cardell, S. L., Karlsson, M. C. I. Invariant NKT cells limit activation of autoreactive CD1d-positive B cells. J Exp Med. 207 (5), 943-952 (2010).
  32. Yang, S. H., et al. Sulfatide-reactive natural killer T cells abrogate ischemia-reperfusion injury. J Am Soc Nephrol. 22 (7), 1305-1314 (2011).
  33. Picarda, E., et al. MHC-derived allopeptide activates TCR-biased CD8+ Tregs and suppresses organ rejection. J Clin Invest. 124 (6), 2497-2512 (2014).
  34. Guillot, C., et al. Prolonged blockade of CD40-CD40 ligand interactions by gene transfer of CD40Ig results in long-term heart allograft survival and donor-specific hyporesponsiveness, but does not prevent chronic rejection. J Immunol. 168 (4), 1600-1609 (2002).
  35. Guillonneau, C., et al. Inhibition of chronic rejection and development of tolerogenic T cells after ICOS-ICOSL and CD40-CD40L co-stimulation blockade. Transplantation. 80 (4), 546-554 (2005).
  36. Guillonneau, C., et al. Anti-CD28 antibodies modify regulatory mechanisms and reinforce tolerance in CD40Ig-treated heart allograft recipients. J Immunol. 179 (12), 8164-8171 (2007).
  37. Qin, S., et al. "Infectious" transplantation tolerance. Science. 259 (5097), 974-977 (1993).
  38. Picarda, É, Ossart, J., Bézie, S., Guillonneau, C. Key role of allopeptide-specific CD8(+) Tregs in transplantation. Médecine Sci (Paris). 31 (1), 22-24 (2015).
  39. Chevalier, S., Lacroix, H., Moreau, J. F., Soulillou, J. P. Blood transfusion plus allograft--but not blood transfusion alone--induce IL 2-producing suppressor cells in Lew-1A recipients of LEW-1W heart allograft. Transplant Proc. 19 (1 Pt 1), 544-546 (1987).
  40. Fang, C., et al. Autoimmune responses against renal tissue proteins in long-term surviving allograft recipients. Transpl Int. 22 (11), 1091-1099 (2009).
  41. Yang, C. P., Bell, E. B. Persisting alloantigen prevents primed CD45RC- CD4 T cells from inducing allograft rejection: implications for immunological memory. Eur J Immunol. 29 (7), 2177-2186 (1999).
  42. Durand, J., et al. Regulatory B Cells with a Partial Defect in CD40 Signaling and Overexpressing Granzyme B Transfer Allograft Tolerance in Rodents. J Immunol. 195 (10), 5035-5044 (2015).
  43. Iwata, Y., et al. Characterization of a rare IL-10-competent B-cell subset in humans that parallels mouse regulatory B10 cells. Blood. 117 (2), 530-541 (2011).
  44. Newell, K. A., et al. Identification of a B cell signature associated with renal transplant tolerance in humans. J Clin Invest. 120 (6), 1836-1847 (2010).
  45. Sagoo, P., et al. Development of a cross-platform biomarker signature to detect renal transplant tolerance in humans. J Clin Invest. 120 (6), 1848-1861 (2010).
  46. Guillonneau, C., David, L., Anegon, I. Improved Analyses of CD8+ T Cell Specificities Using Multimers of Peptide MHC Complexes Coupled to DNA Barcodes. Transplantation. 101 (2), 219-221 (2017).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Регуляторные Т-клеткирегуляторные B-клеткирегуляторные миелоидные клеткианализ супрессорной активности in vitroадоптивный перенос клетокгуморальные антидонорные антителаблокада костимуляцииповышение экспрессии путем переноса генаанализ методом проточной цитометриипротокол сортировки клеток
In Vitro и In Vivo Оценка T, B и миелоидных клеток подавляющих активность и гуморальные ответы от пересадки получателей
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.