Универсальный метод паттернирования белки и клетки

Summary

В этом отчете описывается простая, легкая в исполнении техника, использующая вакуум низкого давления, для заполнения микрофлюидных каналов клетками и субстратами для биологических исследований.

Abstract

Методы субстрата и построения клеточных структур широко используются в клеточной биологии для изучения межклеточных и межклеточных взаимодействий. Традиционные методы нанесения рисунка хорошо работают только с простыми формами, небольшими участками и выбранными биоматериалами. В данной статье описан метод распределения клеточных суспензий, а также субстратных растворов по сложным, длинным, замкнутым (тупиковым) микроканалам полидиметилсилоксана (PDMS) с использованием отрицательного давления. Этот метод позволяет исследователям моделировать несколько субстратов, включая фибронектин, коллаген, антитела (Sal-1), поли-D-лизин (PDL) и ламинин. Структурирование субстратов позволяет косвенно структурировать различные клетки. Мы протестировали миобласты C2C12, линию нейронных клеток PC12, корковые нейроны эмбрионов крыс и нейроны сетчатки амфибий. Кроме того, мы демонстрируем, что этот метод может непосредственно моделировать фибробласты в микрофлюидных каналах путем кратковременного применения низкого вакуума к клеточным суспензиям. Низкий вакуум существенно не снижает жизнеспособность клеток, как показывают анализы жизнеспособности клеток. Обсуждаются модификации для применения метода к различным типам клеток и субстратов. Этот метод позволяет исследователям моделировать клетки и белки по определенным шаблонам без необходимости использования экзотических материалов или оборудования и может быть выполнен в любой лаборатории с вакуумом.

Introduction

В тканевой инженерии и биодатчиков, способность контролировать пространственную организацию белков и клеток по шкале мкм, приобретает все большее значение в течение последних четырех десятилетий ^{1, 2, 3.} Точная пространственная организация белков и клеток позволило исследователям изучить взаимодействие между клетками и субстратов , содержащих аналогичные или различные типы клеток, чтобы направлять рост клеток, а также для иммобилизации биомолекул для изготовления биосенсоров ^{4, 5, 6, 7, 8, 9.}

Современные методы формирования паттерна белков включают photopatterning и микроконтактной печати. Photopatterning использует светочувствительный материал, который сшивается при воздействии Ultrфиолетовый (УФ) излучения. УФ - свет направлен на фотошаблон (состоящей из прозрачных областей с темными областями для предотвращения передачи УФ - света) вызывает сшиванием в определенных областях , которые затем могут быть использованы для последующего прикрепления биоматериалов или клеток ^{10, 11.} В то время как эта схема является очень точным и позволяет точно контролировать топографии поверхности культуры, она ограничена УФ-чувствительных биомолекул , которые могут быть составлены по образцу с помощью УФ - излучения ^12. Микроконтактной печати является еще одним популярным методом структурирование специфических белков ^{13, 14.} В этом способе, поли-диметил силоксан (PDMS) марка обрабатывают различными модификации поверхности реагентов до того, замачивают в растворе выбранного биомолекул субстрата. Затем аккуратно прижимают покровным стеклом или другой поверхности, таким образом, "штампования" биомолекулу на поверхность культуры. эйВеверу, штамповку ограничивается типом материала , который может быть передан, а также смачиваемость биомолекул на поверхности ПДМС штамп ^15.

Прямое структурирование клеток может быть более сложным и опирается на сложные методы , такие как переключаемые подложек, трафаретов на основе методов или кучность с определенными молекулами клеточной адгезии , ^{16, 17.} Эти методы ограничены в их способности шаблон клеток из-за отсутствия совместимых субстратов клеточной адгезии, Несовместимость процессе работы с чувствительными биологическими клетками и ограничениями, несогласованности в воспроизведении формирования рисунка и сложности процедуры. Например, с переключаемыми субстраты, изготовленные на заказ субстраты , должны быть разработаны для каждого типа клеток, чтобы переключить их присоединение к конкретным типам клеток без деградации под воздействием УФ - света и тепла , используемых в процессе ¹⁷ < вир класс = "Xref"> ^{18, 19, 20.} Методы, основанные паттерна Трафарет являются универсальными в их способности к модели клеток; Тем не менее, трудно изготовить PDMS трафареты при соответствующих толщинах для использования ^{16, 21.} Прямая инъекция клеток в PDMS микроканалов имеют ряд преимуществ, таких как: 1) легкость в изготовлении микроканалов и 2) пригодность для многих различных клеток и субстратов. Тем не менее, распространенной проблемой захвата пузырьков воздуха в процессе инъекции из - за гидрофобности PDMS без использования плазменной очистки, или другие методы , чтобы уменьшить пузырьков воздуха, затрудняет последовательно создавать узорчатые клетки на стеклянных или пластмассовых поверхностей ^21.

Эта работа расширяет капиллярного micromolding ^{22, 23,}деваха = "Xref"> ^{24, 25, 26} и передает метод впрыснуть белка и клеточные суспензии в микроканалов. Метод, используемый здесь, демонстрирует кучность субстратов и как прямую, так и косвенную структурирование специфических типов клеток. Этот метод позволяет преодолеть высокую гидрофобность PDMS и исключает наличие пузырьков во время инъекции либо субстраты или клетки, воспользовавшись газопроницаемости ПДМС ^27. В этом документе показано использование метода с несколькими различными субстратами и типов клеток. В статье также подчеркивается , изготовление пресс - форм для мягкой литографии с использованием обычного фотолитографии, а также простой и клейкую недорогой метод ленты полезный в условиях ограниченных ресурсов ^{28, 29.}

Protocol

Примечание: Пожалуйста, обратитесь все соответствующие паспорта безопасности материала (MSDS) перед использованием. Некоторые из химических веществ, используемых в данном протоколе являются токсичными и канцерогенными свойствами. Пожалуйста, используйте все надлежащие практики в области безопасности (вытяжной шкаф, перчаточный ящик) и средства индивидуальной защиты (защитные очки, перчатки, лабораторный халат, полные штаны длина, закрытые носок обуви) при использовании токсичных или кислоты / базовых материалов.

1. Изготовление пресс-форм для Master Soft Литография с использованием фотолитографии

1. Нарисуйте расположение микроканала с помощью системы автоматизированного проектирования (САПР) инструмент для рисования.
2. Печать макета на пустой маски пластины с использованием лазерной маски писателя.
3. Полоскание 4 дюйма кремниевой пластины с ацетоном с последующим изопропанола и сушат с воздушным пистолетом азота, чтобы гарантировать, что растворитель не остается на пластине.
4. Обезвоживают вафлю обжигом его на горячей плите при 200 ° С в течение 5 мин.
5. Выберите негативного фоторезиста, предназначенный для желаемой высоты микроканалов. Fили пример, использование негативного фоторезиста SU-8, чтобы получить 50 микроканалов высотой 50 мкм.
6. Дайте вафля остыть до комнатной температуры, а затем выровнять пластину на патроне спина для нанесения покрытий.
7. Разлить по 4 мл (1 мл / дюйм диаметра пластины) от негативного фоторезиста на центр пластины.
8. Спин пальто пластины с отжимом двухступенчатой ​​использованием вертушку. Во-первых, применить спред цикл 500 оборотов в минуту с ускорением 100 оборотов в минуту / с в течение 10 с. Затем применить цикл отжима в 2000 оборотов в минуту с ускорением 300 оборотов в минуту / с ² в течение 30 с , чтобы получить 50 мкм покрытие из фоторезиста с на пластине.
9. Мягкая выпекать пластина в два этапа на горячей плите в соответствии с инструкциями изготовителя. Для получения 50 мкм покрытия фоторезиста в, сначала предварительно испечь пластины при 65 ° С в течение 6 мин, а затем сразу же сползать температуры горячей пластины пост-испечь пластины при 95 ° С в течение 20 мин.
10. Дайте вафля остыть до комнатной температуры, а затем загрузитьполупроводниковой пластине на сцену литографии.
11. Совместите маску на пластине с помощью маски Aligner и разоблачить пластины УФ - излучения (в соответствии с инструкциями изготовителя) при интенсивности 1,5 мВт / см ² для 146 с , чтобы применить общую УФ дозу 220 мДж / см ² требуется для 50 мкм слой фоторезиста.
12. Применить пост выпекать экспозиции пластины в два этапа на горячей плите. Для 50-мкм покрытия фоторезиста в первую предварительно выпекать пластины при температуре 65 ° С в течение 1 мин и сразу же наращиваем температуры горячей пластины пост-выпекать при температуре 95 ° С в течение 5 мин.
13. Разработка пластины в окунанием пластины в СУ-8 разработчик и осторожно встряхивая до тех пор, пока функции станет ясно на пластине. Разработка пластины для ~ 6 мин для толстой фоторезиста 50 мкм.
14. Смойте излишки проявителя с изопропанола и этанола, а затем высушить пластины с воздуха азотом пушки.
15. Жесткий выпекать кремниевой пластины на горячей плите при 150 ° С в течение 15 мин.
16. Поместитевафельные в эксикаторе с 25 мкл silanizing агента tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl-1-трихлорсилана.
    Примечание: silanizing агент является едким веществом, таким образом, должен быть использован в кислотной / щелочной вытяжкой, с соответствующими средствами индивидуальной защиты (защитные очки, перчатки, лабораторный халат, полные штаны длины, закрытые носок обуви).
17. Применение вакуума в течение 5 мин и подвергать облатку к парам силана в течение 30 мин, не отпуская вакуума.
18. Перенос пластины в подходящего размера чашки Петри.

2. Изготовление пресс-форм для Master Soft Литография с помощью клейкой ленты

1. Нарисуйте расположение микроканала, используя инструмент для рисования САПР и напечатать рисунок на белой бумаге.
2. Очистите стеклянный слайд, достаточно большой, чтобы приспособить конструкцию с изопропилового спирта, а затем высушить слайд с воздушным пистолетом.
3. Прикрепите клейкую ленту на очищенную стекло. Будьте осторожны, чтобы не поймать пузырьки воздуха.
4. Заклеивайте стороны GLAсс скользят на бумагу с дизайном, с лентой стороной вверх.
5. Используйте скальпель, чтобы разрезать ленту на предметном стекле с использованием дизайнерской бумаги в качестве эталона, а затем отделите ленту от нежелательных областей стекло.
6. Промыть стекло с изопропанолом и затем сушат с воздушным пистолетом. Выпекать предметное стекло в печи при температуре 65 ° С в течение 30 мин.
7. Аккуратно пролонгировать ленту с помощью резинового валика для удаления пузырьков воздуха и позволить ползун, чтобы охладить до комнатной температуры.

3. Мягкая литография Изготовление из PDMS устройств

1. Смешайте PDMS эластомер и его отвердитель в соотношении 10: 1 (вес: вес), и смесь перемешивали энергично, и затем дегазировать смесь, поместив ее в вакуумную камеру, пока пузырьки воздуха не появляются в смеси.
2. Смесь вылить в силанизированного формы кремния или клейкой ленты формы в чашке Петри, чтобы получить ~ 2 мм толщиной слоя PDMS и Дега, пока все пузырьки воздуха исчезают.
3. Вылечить PDMS в печипри 65 ° С в течение 2 ч.
4. Используйте скальпель, чтобы разрезать слой PDMS по меньшей мере, 5 мм от особенностей, а затем очистить отвержденных PDMS прочь пресс-формы, используя пинцет.
5. Удар одно входное отверстие с биопсией 1 мм удар в любом месте на микроканалов, предпочтительно в конце сети микроканалов , как показано на рисунке 2а и 4b.
6. Очистить PDMS литье с помощью клейкой ленты, чтобы удалить частицы пыли, адсорбированные на устройство. Стерилизация Микроканал устройство PDMS (PDMS CAST) путем промывки раствором 70% -ного этанола с последующей стерильной деионизированной (ДИ) воды и подвергать воздействию УФ в течение 30 мин.
7. Хранить стерильную PDMS устройство в стерильную чашку Петри до использования.

4. Подложка Образцу

1. Поместите стерильные PDMS отлитые с помощью пинцета на стерильную стеклянную покровного или чашку Петри и применить мягкое давление, используя кончик пинцетом.
   ПРИМЕЧАНИЕ: PDMS литая делает конформное но обратимое уплотнение с ГЛпопка покровное или чашку Петри формирования микроканалов без использования какого-либо клея.
2. Поместите капельку (20 - 40 мкл) раствора субстрата на входе полностью закрывающей входное отверстие. Шаблон поли-D-лизином (PDL), путем размещения 20 мкл капельку PDL а в буфере тетраборат натрия на входе в микроканалов.
3. Поместите чашку Петри в вакууме ~ 254 mmHgA (эквивалент для размещения вакуума в биологических лабораториях) в течение 10 мин, и наблюдать воздух, поступающий из канала в виде пузырьков.
4. Отпустите вакуума и наблюдать раствор субстрата, протекающей в микроканале.
5. Выдержите блюдо в соответствующих условиях для присоединения субстрата. Приведены в таблицах 1 и 2 для условий инкубации (они варьируются в зависимости от подложки). Для PDL кучность, инкубировать в течение 1 ч при 37 ° С.
6. Аккуратно снимите штамп PDMS с помощью стерильных пинцетов и промойте рисунок на стекло покровное трижды дистиллированной водой.
7. Добавить раствор 1% бычьего сывороточного альбумина (БСА) в чашке Петри, чтобы покрыть блюдо или покровного стекла и инкубировать в течение ночи при 37 ° С.
   Примечание: Это приведет к снижению неспецифической соблюдения в непокрытых регионах.
8. Аспирируйте от 1% раствора БСА и узорной субстрат теперь готов к использованию.

5. Косвенное структурирование клеток

1. Приготовьте суспензию клеток в культуральной среде, не содержащей сыворотки. Типа клеток и плотность клеток приведены в таблице 1.
2. Добавить клеточной суспензии в узорной Петри и полностью погрузить в воду узорчатую область в клеточной суспензии.
3. Инкубируйте чашки Петри при температуре 37 ° С в термостате в течение 15 мин, чтобы позволить клеткам прикрепляться к узорной подложки.
4. Аспирируйте избыток суспензии клеток от чашки Петри и мыть узорчатых клеткам трижды фосфатно-солевым буфером (PBS) при осторожном встряхивании в течение 10 с для удаления неприкрепленные клетки.
5. Добавьте Appropriate культуральная среда для узорчатых культур клеток и инкубировать узорчатую клеток при 37 ° С в СО ₂ инкубаторе.

6. Прямой структурирование клеток

Примечание: Этот метод является альтернативой косвенном кучность клеток, описанной в пункте 5. Однако, в отличие на этапе 5, в этой технике клетки узорной на поверхности для культивирования тканей с или без покрытия подложки.

1. Стерилизация микрожидкостных устройств путем промывки раствором 70% этанола с последующим ДИ воды.
2. Замачивание устройство в течение ночи в растворе 1% бычьего сывороточного альбумина, чтобы предотвратить адгезию клеток к PDMS.
3. Высушить устройство при комнатной температуре и прикрепить ее к нижней части культуры ткани, обработанной чашке Петри.
4. Приготовьте суспензию клеток в бессывороточной культуральной среде. Типа клеток и плотность клеток приведены в таблице 2.
5. Поместите капельку (4 - 8 мкл) клеточной суспензии, достаточно, чтобы заполнитьмикроканалов, на входе полностью закрывающей входное отверстие.
6. Поместите чашку Петри в вакууме в течение 10 мин и наблюдать воздух, поступающий из канала в виде пузырьков. Отпустите вакуума и наблюдать клеточную суспензию, протекающей в микроканале.
7. Выдержите чашку Петри в инкубаторе , чтобы способствовать адгезии клеток на условиях инкубации ( в зависимости от типа клетки узорной) , указанным в таблице 2. Добавить PBS в чашке Петри погружая устройство PDMS.
8. Пил PDMS тщательно от чашки Петри с помощью пинцета и мыть шаблон с PBS. Добавить среды для культивирования клеток на чашку Петри и помещают культуры клеток в инкубаторе.

Results

Этот метод позволяет кучность белков и непрямого паттернировании клеток с использованием тупиковых микроканалов с размерами размером до 10 мкм и оборудованием практически во всех биологических лабораториях после того, как мастер-форма изготовлена. Этот метод может быть использован с PDMS микроканалов , созданных с использованием традиционных мягких фотолитографии или с PDMS микроканалов , созданных с изготовлением клейкой лентой (Рисунок 1) ^28,

Discussion

В то время как обычные фотолитографии является хорошо отработанной технологией для создания пресс-форм для мягкой литографии, оборудования, материалов и навыков, необходимых для использования обычного фотолитографии не легко доступны для большинства лабораторий. Для лабораторий, не имеющих доступа к этим ресурсам, мы представили изготовление клейкой ленты в качестве способа создания форм с относительно простыми функциями для микрожидкостных устройств. Этот метод позволяет в любой лаборатории, чтобы создать и использоват...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
CorelDRAW X4 Инструменты для рисования САПР	Corel Corporation, Канада	X4 Версия 14.0.0.701	Инструмент САПР, используемый для рисования макета микрофлюидного устройства
Лазерный принтер HP	Hewlett Packard, CA	1739629	Используемый для печати макета микрофлюидного устройства для техники клейкой ленты
Bel-Art Dessicator	Fisher Scientific, MA	08-594-16B	Используемый для дегазации смеси
PDMSКлейкая скотч-лента	3M Product, MN	Tape 600	Используется для изготовления клейкой ленты Master
PDMS Sylgard 184	Dow Corning, MI	1064291	Литейный полимер
Чашка Петри	Fisher Scientific, MA	08-772-23	Используется для удержания формы для литья с помощью PDMS
Скальпель из нержавеющей стали с лезвием (# 11)	Feather Safety Razor Co. Ltd. Япония	2976 # 11	Используется для резки PDMS
Пинцет	Ted Pella, CA	5627-07	Используется для обработки слепка PDMS во время отслаивания
Стеклянные слайды	Fisher Scientific, MA	12-546-2	Используется в качестве поверхности для моделирования подложки
Стеклянные слайды	Fisher Scientific, MA	12-544-4	Используется в качестве поверхности для моделирования подложки
Резиновый валик	Dick Blick Art Materials, IL	40104-1004	Используется для крепления клейкой ленты к стеклу без улавливания пузырьков воздуха
Laser Mask Writer	Heidelberg Instruments, Германия	DWL66fs	Используется для изготовления кварцевой маски, используемой в процессе изготовления фотолитографии
EVG Mask Aligner (инструмент для фотолитографии с ультрафиолетовым воздействием)	EV Group, Германия	EVG 620T(B)	Используется для воздействия на фоторезист ультрафиолетового излучения
Spin Coater Headway	Headway Research Inc, TX	PWM32-PS-CB15PL	Используется для нанесения слоя фоторезиста на кремниевую пластину
Фоторезисты SU-8 50	MicroChem, MA	Y131269	Негативный фоторезист используется для изготовления пресс-форм
SU-8 Devloper	MicroChem, MA	Y020100	Проявитель фоторезиста
Tridecafluoro-1,1,2,2-Tetrahydrooctyl-1-Trichlorosilane	UCT Specialties, PA	T2492-KG	Форма для покрытия для предотвращения адгезии PDMS
Изопропанол	Sigma-Aldrich, MO	190764	Чистящий растворитель
этанол	Sigma-Aldrich, MO	24102	Стерилизационный растворитель
поли-D-лизина гидробромид (PDL)	Sigma-Aldrich, MO	P0899-10MG	PDL раствор производится в концентрации 0,1 мг/мл в буфере тетрабората натрия
Laminin	Sigma-Aldrich, MO	L2020	Ламинин аликвотируется на 10 & микро; L аликвоты и разбавленные до 20 °; g/µ L в PBS перед использованием
BSA	Fisher Scientific, MA	BP1605100	Клеточная культура
C2C12 Myoblast клеточная линия	ATCC, VA	CRL-1722	Используется для демонстрации паттернинга C2C12
Клеточная линия PC12	ATCC, VA	CRL-1721	Используется для демонстрации паттернинга PC12
Коллаген типа 1, крысиный хвост	BD Biosciences	40236	Клеточная культура
DMEM	GIBCO, MA	11965-084	Клеточная культура
Лошадиная сыворотка, термоинактивированная	Fisher Scientific, MA	26050-070	Клеточная культура
Фаллоидин-тетраметилродамин B изотиоцианат (TRITC)	Sigma-Aldrich, MO	P1951	Для мечения клеток
Кальцеин-AM набор для анализа живых мертвых клеток	Invitrogen, MA	L-3224	Анализ жизнеспособности клеток
Биопсия Дырокол	Тед Пелла, CA	15110-10	Перфорированное отверстие в PDMS