Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Улучшение силы, силы, мышечной аэробной способности и толерантности к глюкозе благодаря краткосрочной прогрессивной силовой тренировке среди пожилых людей

12.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/55518

⸱

5 июля 2017 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Åstrand Laboratory of Work Physiology, The Swedish School of Sport and Health Sciences, GIH, 2Department of Neuroscience, Karolinska Institutet, 3Department of Physiology and Pharmacology, Karolinska Institutet

В этой статье

Краткое содержание

Эффект краткосрочной тренировки сопротивления для пожилых людей был исследован путем одновременного использования нескольких методов. По сравнению с контрольной группой наблюдалось много улучшений, в том числе по мышечной аэробной способности, толерантности к глюкозе, силе, мощности и качеству мышц ( т. Е. Белка, участвующего в клеточной передаче сигналов и составе типа мышечного волокна).

Аннотация

Этот протокол описывает одновременное использование широкого диапазона методов для изучения мышечной аэробной способности, толерантности к глюкозе, силы и силы у пожилых людей, выполняющих краткосрочную тренировку сопротивления (RET). Наблюдаемое обучение прогрессивному сопротивлению в течение 1 часа три раза в неделю в течение 8 недель проводилось участниками RET (71 ± 1 год, диапазон 65-80). По сравнению с контрольной группой без обучения, RET продемонстрировал улучшения в отношении мер, используемых для указания силы, мощности, толерантности к глюкозе и нескольких параметров мышечной аэробной способности. Силовой тренинг проводился в тренажерном зале с исключительно надежным фитнес-оборудованием. Изокинетический динамометр для прочности разгибателя колена позволил измерить концентрационную, эксцентричную и статическую прочность, которые увеличились для группы RET (8-12% после теста). Мощность (скорость развития силы, RFD) в начальные 0-30 мс также показывала увеличение для группы RET (52%). Тест на толерантность к глюкозе с частотойNt измерения уровня глюкозы в крови показали улучшение только для группы RET с точки зрения значений глюкозы в крови через 2 часа (14%) и площадь под кривой (21%). Липидный профиль крови также улучшился (8%). Из образцов биопсии мышц, полученных с использованием гистохимии, количество волокна типа IIa увеличивалось, а тенденция к уменьшению IIx в группе RET отражала изменение до более окислительного профиля с точки зрения состава волокон. Вестерн-блот (для определения содержания белка, связанного с сигнализацией синтеза мышечного белка) показал увеличение на 69% как у Akt, так и mTOR в группе RET; Это также показало увеличение митохондриальных белков для комплекса OXPHOS II и цитрат-синтазы (как ~ 30%), так и для комплекса IV (90%) только в группе RET. Мы демонстрируем, что этот тип прогрессивной тренировки сопротивления предлагает различные улучшения ( например, сила, сила, аэробная способность, толерантность к глюкозе и профиль липидов в плазме).

Введение

Старение связано с потерей мышечной массы (саркопения), силой и силой. Сниженная сила и, возможно, еще более важно, сила, приводит к неподвижности, повышенному риску травмы и снижению качества жизни. Сопротивление - это хорошо известная стратегия противодействия саркопении и ухудшению мышечной функции. Грубая оценка мышечной силы может быть получена из нагрузки или количества достигнутых повторений. Однако в этом исследовании была получена более подробная и точная информация о функции мышц с использованием изокинетического динамометра для сбора информации о крутящем моменте при изометрическом, концентрическом и эксцентрическом сжатии, а также о кинетике развития силы.

Аэробная емкость, как на уровне всего тела (VO 2max ), так и в скелетных мышцах, снижается у пожилых людей. Снижение частоты сердечных сокращений с возрастом объясняет значительную часть снижения VO 2max 1 , но уменьшаетОкислительная способность, в основном связанная с уменьшенной физической активностью 2 , вносит свой вклад. Нарушенная митохондриальная функция может также участвовать в развитии саркопении и резистентности к инсулину 3 . Мышечная аэробная способность оценивалась в биопсиях мышц посредством биохимического анализа содержания митохондриальных ферментов и белковых комплексов, расположенных как в матрице ( например, цитратсинтазе), так и в внутренней мембране митохондрий. Кроме того, гистохимические методы были использованы для измерения влияния тренировки сопротивления на морфологию мышц ( т. Е. Состав типа волокна, площадь поперечного сечения волокна и плотность капилляров). Альтернативным методом оценки мышечной аэробной способности было бы использование магнитно-резонансной спектроскопии для измерения скорости ресинтеза креатинфосфата после истощения, вызванного упражнениями 4 . Этот метод обеспечивает оценку in vivo мышечной аэробной емкостиНо не могут различать дисфункцию митохондрий и нарушения кровообращения. Кроме того, высокие затраты на оборудование ограничивают использование этого метода в большинстве лабораторий. Аэробная емкость (VO 2max и плотность митохондрий) может быть улучшена благодаря выносливости у молодых и пожилых людей 5 , 6 . Однако эффект тренировки резистентности по этим параметрам был менее изучен, особенно у пожилых людей, и результаты противоречивы 7 , 8 , 9 , 10 .

Диабет типа 2 является распространенным заболеванием у пожилых людей. Физическая инертность и ожирение являются основными факторами, связанными с образом жизни, объясняющими увеличение заболеваемости диабетом типа 2. Аэробные упражнения с низкой интенсивностью часто рекомендуются пациентам с пониженной толерантностью к глюкозе. Однако это неКак силовые тренировки у пожилых людей влияют на толерантность к глюкозе / чувствительность к инсулину 11 , 12 . Самый точный способ измерения чувствительности к инсулину - использовать метод зажима глюкозы, где уровень глюкозы в крови поддерживается постоянным путем вливания глюкозы в условиях повышенного инсулина 13 . Недостатки этой методики заключаются в том, что она требует много времени и инвазивна (артериальная катетеризация) и требует специальных лабораторных установок. В этом исследовании использовался тест на толерантность к глюкозе, который является общим для медицинских единиц. Этот метод подходит, когда несколько предметов подлежат исследованию в течение ограниченного периода времени.

Тестирование и график экспериментальной процедуры можно резюмировать следующим образом. Используйте три отдельных дня для тестирования до и после восьминедельного периода с одинаковой компоновкой и приблизительными расписаниями (≥24 часа между днями, < Strong> Рисунок 1). В первый испытательный день измерьте: антропометрические данные, такие как высота, масса тела, масса без жира (FFM) и окружность верхней ноги ( т. Е. На 15 см выше верхушечной коленной чашечки в расслабленном положении на спине); Субмаксимальная цикличность; И силы коленного сустава, как описано в шагах 4 и 5. Возьмите биопсию мышц из бедра во второй день испытаний. Дальнейшие описания см. В пункте 6.1. Протестируйте огрузочную толерантность к глюкозе (OGTT) в последний день тестирования. Дальнейшие описания см. В п. 7.1. Попросите всех участников избегать энергичной физической активности в течение 24 часов и быстро переносить ночь перед каждым испытательным днем. Однако попросите их избегать интенсивной физической активности в течение 48 часов до дня тестирования OGTT. Попросите их следовать их обычной повседневной физической активности и привычкам к диете. Обратите внимание, что до и после вмешательства, обе группы, принимающие участие в группах, и виды продуктов питания не изменились.

Figimg "src =" / files / ftp_upload / 55518 / 55518fig1.jpg "/>
Рисунок 1: Экспериментальный протокол. Принципиальная схема. Время между тремя предварительными и пост-тестами было одинаковым для каждого субъекта и составляло не менее 24 часов. Более подробная информация приведена в тексте. Эта цифра была изменена от Frank et al. Сканд. J. Med. Sci. Спорт . 2016: 26, 764-73. 28 Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Это исследование предназначалось для исследования влияния краткосрочной тренировки резистентности у пожилых людей на мышечную окислительную способность и толерантность к глюкозе. Вторая цель состояла в том, чтобы изучить влияние на качественные улучшения силы, мощности и мышц ( т. Е. Белки, участвующие в клеточной передаче сигналов и составе типа мышечного волокна).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Региональный комитет по этике Стокгольма, Швеция, одобрил проект расследования.

1. Материал

  1. Привлечение относительно здоровых женщин и мужчин в возрасте 65-80 лет, имеющих ИМТ, составляет от 20 до 30 кг · м -2 . Рандомизируйте их на две группы. Убедитесь, что люди в обеих группах имеют относительно низкий уровень физической активности ( т. Е. Умеренная ежедневная физическая активность и регулярная тренировка).
  2. Исключайте пользователей бета-блокаторов и пациентов с болезнью коронарных артерий и тяжелыми неврологическими или совместными проблемами.
  3. Попросите испытуемых получить их письменное согласие, сообщив им о возможном дискомфорте и рисках на тестовых и учебных занятиях.
  4. Баланс тренировки сопротивления (RET) и контроль без групп обучения (CON) с точки зрения возраста, пола и ИМТ. Попросите одну группу выполнить RET под тренером в течение 1 часа три раза в неделю в течение восьми недель; Другая группа будет выполнять функцииLs (CON).

2. Тестирование и обучение

Примечание: восемь упражнений - это стандартные упражнения по силовому упражнению: сидящий нож для ног, сидящий грудной молоток, пресс для сундуков грудной клетки, посадочное место на спине, сидячий плечевой пресс, сидячий гребля, посадочное расширение для ног (расширение колена) и склонность к ногам (сгибание колена) ; См. Рисунок 8 в разделе «Репрезентативные результаты».

  1. Во время первой тренировки оценивайте максимальную силу при одном максимальном повторении (1 RM) для каждого тренировочного упражнения.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Модель 1 RM обычно используется и определяется как нагрузка, при которой объект может поднимать или толкать сопротивление только один раз, но не дважды.
    1. Перед началом попросите участника выполнить небольшую разминку (с несколькими начальными испытаниями при очень малой нагрузке) испытанного упражнения. Впоследствии увеличьте нагрузку до чуть ниже вероятного значения 1 RM (чаще всего максимум 3-4 увеличиваетсяОбъявления). Зарегистрируйте максимальную нагрузку, которую объект может выполнять только один раз (= 1 RM).
    2. Измерьте 1 RM в восьми стандартных тренировочных упражнениях (см. Рисунок 8 в разделе «Репрезентативные результаты»). Попросите испытуемых отдохнуть в течение не менее 2-3 минут между каждым испытанным упражнением.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Во всех учебных учениях использовались силовые тренажеры, в том числе тесты каждого тренировочного упражнения.
  2. Попросите всю группу RET выполнить 1 ч контролируемой тренировки по силе три раза в неделю в течение восьми недель. Попросите участников выполнить после разминки восемь вышеупомянутых стандартных учебных упражнений. Они должны повторять упражнение 12 раз в каждом наборе и выполнять три набора каждого упражнения. Разрешить отдых в течение 1 мин между каждым набором и 2-3 мин между каждым упражнением.
    1. Попросите испытуемых выполнить каждое упражнение как можно быстрее во время концентрической фазы ( т.е. фазы сокращения мышц) и медленно во времяЭксцентрическая фаза ( т.е. фаза удлинения мышц).
      ПРИМЕЧАНИЕ. Субъекты могут выполнять упражнения в любом порядке. Однако попросите их начать и завершить упражнение на ноге, а также попытаться выполнить восемь упражнений в представленном порядке. Используйте силовые тренажеры для всех восьми упражнений.
    2. Во время каждой тренировки попросите участников выполнить три набора в 75-80% от 1 RM для каждого упражнения. Увеличьте нагрузку примерно на 5% после сеанса, когда участник может выполнить 12 повторений во всех трех наборах упражнений.

3. Субмаксимальный велоспорт

Примечание. Выполняйте тест субмаксимального циклирования в тестовый день 1 (см. Введение и рисунок 1 ).

  1. Выполните тест велоэргометра, включая два субмаксимальных уровня, каждый в течение 4 минут 14 , 15 . Установите первую скорость работы (30 Вт), а вторую - на 60-120 Вт, без паузы между нагрузками на велоэргометр.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Первая нагрузка одинакова для всех субъектов, но второй и последний субмаксимальный уровень должен составлять приблизительно 65-85% от максимальной частоты сердечных сокращений для каждого испытуемого. Обе нагрузки должны быть одинаковыми до и после интервала вмешательства 8 недель обучения.
    1. Основой второго уровня нагрузки на экзаменах по ознакомлению, проведенных перед испытаниями, путем выяснения того, насколько физически активен человек, и того, что субъект первоначально начал цикл на короткое время; Контрольный лидер сформирует мнение, основанное на частоте сердечных сокращений субъекта, относительно того, какая конечная субмаксимальная нагрузка является подходящей.
    2. Запишите среднюю постоянную частоту сердечных сокращений (HR) с помощью монитора сердечного ритма через пояс грудной клетки в течение последней минуты при низких и высоких рабочих скоростях, взяв среднее значение наблюдаемого HR в 3:15, 3:30, 3:45 , И 4:00 мин при каждой рабочей скорости.
    3. Используйте эрго-спирометрическое устройство для определения состава газа (O 2 и CO 2 ) в истекшем и вдохновенном воздухе. Зарегистрируйте коэффициент обмена дыхания (RER, т. Е. CO 2 / O 2 ), и определите средние значения RER в течение последней минуты (из четырех мер каждые 15 с) при обеих нагрузках рабочей нагрузки.

4. Сила растяжения колена: статический, эксцентричный и концентрический пиковый крутящий момент и скорость развития силы

Примечание: выполните измерения прочности колена в день испытания 1 (см. Введение и рисунок 1 ).

  1. Перед записью попросите испытуемого выполнить разминочную обработку на велосипеде в течение 8-10 минут на велоэргометре на уровне субмаксимального уровня (т.е. примерно 65-85% от максимальной частоты сердечных сокращений).
  2. Попросите субъекта сесть на скамью изокинетического динамометра. Закрепите сундук объекта ремнями на плечах и бедрах. Надежно закрепите хвостовик объекта на валу динамометра двумя ремнями: один под коленом, а один - только abovE лодыжки. Совместите ось коленного сустава с центром вращения вала динамометра.
  3. Когда объект защищен, оцените максимальную добровольную силу колена как максимальный крутящий момент, при этом субъект сидит в изокинетическом динамометре. Первоначально разрешить испытуемому выполнить несколько испытаний для ознакомления с оборудованием прочности колена (изокинетический динамометр).
  4. Попросите человека выполнить четыре максимальных добровольных эксцентричных и концентрических расширения колена (поочередно), с правой ногой с постоянной угловой скоростью 30 град / с. Установите диапазон движения между 90 ° и 15 ° (прямой ногой = 0 °).
    1. В эксцентричной задаче попросите испытуемого сопротивляться валу динамометра с максимальным усилием всего движения от угла колена до 15 °. В концентрической задаче попросите испытуемого надавить на нижнюю ногу в вал динамометра на удлинение колена, насколько это возможно, во всем диапазоне движения.
  5. Разрешите 4-минутный отдых после динамических записей. Затем оценивайте статический максимальный произвольный момент сжатия (MVC) четыре раза при 65 ° коленном угле. В каждом статическом испытании попросите испытуемых, сидящих на одном и том же динамометре, как можно быстрее и сильнее ударить по валу динамометра, который теперь фиксируется (при 65 °) и не может быть перемещен.
  6. Для сигналов крутящего момента (силы) преобразуйте аналоговые сигналы крутящего момента в цифровой, используя аналого-цифровой преобразователь, подключенный к изокинетическому динамометру.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Преобразователь автоматически изменяет аналоговые сигналы от динамометра на цифровые сигналы, которые затем автоматически экспортируются на компьютер, на котором собираются данные.
    1. Установите частоту дискретизации на частоте 5 кГц в программе анализа программного обеспечения компьютера. Сохраните цифровые сигналы на компьютере для последующего анализа значения силы с помощью программы анализа программного обеспечения.
  7. В последующем анализе используйтеНаивысшее значение, полученное из четырех испытаний для каждого испытуемого в эксцентрических, концентрических и статических измерениях. В программном обеспечении щелкните самое высокое значение четырех испытаний и запишите значение силы, показанное на экране компьютера.
    1. Зарегистрируйте самый высокий пиковый крутящий момент в эксцентрике и в концентрических записях для каждого предмета и наивысшем значении силы среди четырех статических испытаний.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Изокинетическое динамометрическое испытание прочности разгибателя колена в сидячем положении имеет надлежащую надежность и достоверность 16 , 17 .
  8. Измерьте скорость создания силы (крутящего момента) (RFD) в течение 0-30 мс и 0-200 мс в наивысшем значении, найденном среди статических испытаний. Установите значение нуля на уровне 7.5-Нм для начала сжатия для силы разгибателя колена (время: 0 мс) 18 , 19 . Переместите курсор (в программе для мышцАнализ прочности) до значения «7.5 Нм» на y-шкале, чтобы получить положение для 0 мс.
    1. Для предварительной проверки установите курсор на значение 30 мс (после времени 0 мс). Запишите значение, показывающее повышение в Нм при 30 мс ( т. Е. Увеличение Nm от 7,5 Нм = 0 мс). Сделайте ту же процедуру для значения после теста.
    2. Рассчитайте увеличение процента для значения пост-теста Nm (числитель) по сравнению с предтестовым значением Nm (знаменателем) за период 0-30 мс. Таким образом, предъявите RFD в процентах от предварительного теста до посттеста. Проделайте те же анализы для временного интервала 0-200 мс.

5. Мышечная биопсия

Примечание. Выполняйте биопсию мышц в день испытания 2 (см. Введение и рисунок 1 ).

  1. Возьмите биопсию мышц из средней части бедра мышц бедра, используя conchotome 20 .
    1. Перед биопсией подкожно вводите 1-2 мл местной анестезии и в фасцию. Через пару минут сделайте надрез с маленьким скальпелем через кожу и фасцию, примерно на 1/3 расстояния от коленной чашечки до переднего верхнего подвздошного отдела позвоночника. Извлеките около 100-150 мг мышечной ткани, используя conchotome.
  2. Образцы замораживания для гистохимии в изопентане охлаждают до точки замерзания в жидком азоте и сохраняют при -80 ° C. Храните образец 30-50 мг мышечной ткани.
  3. Быстро заморозить образцы для анализа белка в жидком азоте и хранить их при -80 ° C. Храните образец 30-50 мг мышечной ткани.

6. OGTT

Примечание. Выполняйте OGTT (тест на толерантность к глюкозе в крови) в день испытания 3 (см. Введение и рисунок 1 ). Время между упражнением и OGTT должно превышать 48 часов и должно быть аналогичным между до и после-тестов. 2-часовой устный OGTT используется для исследования того, показывают ли частые образцы крови в это время нормальные или повышенные уровни, указывающие на диабет или преддиабельные состояния.

  1. Выполните тест OGTT утром по предметам, которые постились всю ночь и не делали никаких напряженных упражнений в день тестирования или накануне.
  2. Возьмите образцы крови (4 мл) от участников на спине через венозную канюлю в антекубитальной вене 15 минут до и непосредственно перед введением глюкозы, а затем 15, 30, 60, 90 и 120 минут после приема глюкозы ( 75 г глюкозы в 250 г / л раствора).
  3. Центрифугировать образцы крови при 1500 xg и 4 ° C в течение 10 минут и хранить плазму при -20 ° C для будущего анализа. Используйте образцы для выполнения стандартных тестов уровня глюкозы (шаг 7).
  4. Для глюкозы, инсулина и c-пептида вычислите площадь под кривой (AUC), определив интеграл времени глюкозы над базальным уровнем глюкозы. Использовать результаты OGTTДля расчета чувствительности к инсулину для всего тела с использованием метода Мацуды 21 , согласно уравнению: 10 000 * √ [(базальты глюкозы * базальты инсулина) * ( среднее значение глюкозы * среднее значение инсулина).

7. Анализ образцов крови

  1. Определите концентрацию глюкозы в венозной плазме с помощью автоматизированного анализатора. Установите уровень нарушения глюкозы в крови на уровне глюкозы в крови> 7,8 ммоль / л после 2-часовой OGTT 22 .
  2. Используйте комплекты ELISA 22 для проведения плазменного анализа инсулина и c-пептида. Используйте планшет. Поместите пластины ELISA для инсулина и c-пептида в планшет-ридер (каждый в отдельном случае).
    ПРИМЕЧАНИЕ. Читатель пластины измеряет количество инсулина и количество c-пептида путем измерения образцов на пластине при определенных поглощениях. Липиды крови TG, HDL, аполипопротеин A1 и аполипопротеин B анализировали стандартными методами приКаролинская университетская больница, Стокгольм, Швеция.

8. Анализ образцов мышц

  1. иммуноблоттинг
    1. Во-первых, замораживать сухой образец мышцы в лиофилизаторе при давлении ниже 10 -1 мбар в течение 12 часов. Рассекайте его так, чтобы он был свободен от крови и соединительной ткани, используя иглу и щипцы под световым микроскопом. Хранить при температуре -80 ° C.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Подходящее количество мышц составляет от 1 до 5 мг сухого веса, но протокол можно довести до менее 1 мг, вплоть до отдельных волокон. Из-за небольшого количества мышечной ткани, присутствующей в одной биопсии, значения от этого участника RET не использовались для иммуноблоттинга.
    2. Гомогенизировать образцы мышц (80 мкл / мг), состоящий из 2 мМ 4- (2-гидроксиэтил) -1-пиперазинэтансульфоновой кислоты (HEPES), 1 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), 5 мМ этиленгликоль-бис (Β-аминоэтиловый эфир) -N, N, N ', N'-тетраацет(EGTA), 10 мМ MgCl 2 , 50 мМ ß-глицерофосфат, 1% TritonX-100, 1 мМ Na 3 VO 4 , 2 мМ дитиотреитола, 20 мкг / мл леупептина, 50 мкг / мл апротинина, 1% ингибитора фосфатазы Коктейль и 40 мкг / мкл PMSF (фенилметилсульфонилфторид).
      1. Поместите совок из 0,5 мм гранул оксида циркония в каждую пробирку с мышцей. Добавить буфер и гомогенизировать в течение 2 х 1 мин на шаге 7-8 (здесь максимум равен 10) и 4 ° С.
    3. Центрифугируют гомогенат в течение 10 мин при 10000 х g. Перенесите оставшийся супернатант в новые трубки и отбросьте осадок, содержащий структурные белки.
    4. Спектрофотометрически определяют концентрацию белка в супернатанте с помощью коммерчески доступного набора с использованием планшетного ридера при 660 нм 23 .
      1. Затем разбавляют образцы с помощью 2-х буфера для образцов Laemmli и гомогенизирующего буфера (1: 1) до конечной концентрации белка 1,5 мкг /# 181; л. Нагреть их до 95 ° С в течение 5 мин для денатурации белков. Храните разбавленные образцы при -20 ° C перед анализом.
    5. Для электрофореза на основе полиакриламидного геля (PAGE) загружайте 30 мкг белка из каждого образца в 18-луночные гранулы-градиенты (4-20% акриламида) и проводите электрофорез при 300 В в течение 30 мин на льду.
    6. Уравновешивают гель в переносном буфере (25 мМ Трис-основание, 192 мМ глицин и 10% метанол) в течение 30 мин при 4 ° С. Перенесите белки в мембраны поливинилиденфторида с размерами пор 0,2 мкм при постоянном токе 300 мА в течение 3 ч при 4 ° С.
    7. Чтобы подтвердить равную загрузку и перенос, окрашивайте мембраны общим пятном белка 24 . Для каждого целевого белка загружать все образцы от каждого субъекта на один и тот же гель и одновременно запускать все гели.
    8. Блокируют мембрану в течение 1 часа при комнатной температуре в трис-буферном солевом растворе (20 мМ Трис-основание, 192 мМ NaCl, TBS, pH 7,6), содержащем5% обезжиренного молока.
    9. Инкубируйте мембраны в течение ночи с первичными антителами (см. Список материалов), разведенными в TBS, содержащем 2,5% обезжиренного молока и дополненным 0,1% Tween-20 (TBS-TM).
    10. После первичной инкубации антител промыть мембраны (2 х 1 мин плюс 3 х 5 мин) с помощью TBS-TM и инкубировать со вторичными антителами (см. Список материалов), конъюгированных с пероксидазой хрена, в течение 1 часа при комнатной температуре. Снова промойте TBS-TM (2 х 1 мин и 3 х 10 мин) и снова подвергайте их четырем дополнительным 5-минутным промывкам с TBS.
    11. Нанесите 6-12 мл хемилюминесцентного субстрата на мембрану в течение 5 мин. Поместите мембрану между двумя прозрачными пластиковыми листами. Поместите мембраны перед камерой CCD, блокирующей внешний свет. Возьмите серийные экспозиции с использованием хемилюминесцентного фильтра камеры.
      1. Используйте программное обеспечение для получения 10 экспозиций в течение 2 минут или до тех пор, пока сигналы не будут насыщены. Используйте стандартную настройку, как для настроек оптического фильтра tO получить хемилюминесценцию, а также настройки объектива.
    12. Используйте самую высокую экспозицию, которая не приводит к насыщению и не помещает контуры полосы. Определите диапазоны как интенсивность x мм 2, используя одно и то же программное обеспечение. Вычтите фоновый шум из интенсивности полосы. Представьте результаты относительно общего содержания белка и выражайте его как процентное изменение по сравнению с исходным уровнем.
  2. гистохимия
    ПРИМЕЧАНИЕ. Ниже приведен метод гистохимии, основанный на методах, описанных в более ранней публикации 25 .
    1. Для гистохимии разрезают серийные сечения (10 мкм) при -20 ° С с использованием криостата. Установите поперечные сечения на стеклянных горках, хранящихся в стеклянной кювете, и высушите на воздухе срезы для биопсии при комнатной температуре.
    2. Подготовьте буферные растворы для каждого уровня рН для предварительной инкубации при рН 4,3, 4,6 и 10,3 для окрашивания АТФазой 26 . Для визуализации капилляров, staВ поперечном сечении с использованием метода амилазы-ПАС 27 .
    3. Откалибруйте pH-метр путем заливки калибровочных растворов в маркированные калибровочные стаканы. Нажмите соответствующую кнопку, чтобы выбрать значение pH из главного меню.
      1. Промойте зонд деионизированной водой и поместите зонд в первый калибровочный стакан. Убедитесь, что в мембране нет пузырьков воздуха. Измерить первое решение для калибровки, а затем представить следующее калибровочное решение (на дисплее будет предложено следующее решение).
      2. Промойте зонд деионизированной водой, а затем поместите его во второй калибровочный стакан. Убедитесь, что в мембране нет пузырьков воздуха. Измерить второй калибровочный раствор и перейти к следующему калибровочному раствору.
      3. Промойте зонд деионизированной водой и поместите его в третий калибровочный стакан. Убедитесь, что в мембране нет пузырьков воздуха. Измерить третий калибровочный раствор.
        ПРИМЕЧАНИЕ. Когда калибровкаХорошо, дисплей на короткое время отобразит «3- й буфер« OK »и затем вернется в главное меню.
    4. Используйте буферы следующим образом для окрашивания ATPase.
      1. Для получения раствора при рН 10,3 используют два разных раствора: (A) 4,506 г глицина, 4,8 г CaCl 2 , 3,51 г NaCl и 600 мл dH 2 O и (B) 2,176 г NaOH и 540 мл DH 2 O. Храните растворы в холодильной или холодильной камере. Используйте их в течение одного месяца.
      2. Для приготовления растворов при рН 4,3 и 4,6 выполняют «предварительную инкубацию кислоты». Подготовьте кислоту для предварительной инкубации, используя: 6,47 г Na-ацетата, 3,7 г KCl и 500 мл dH 2 O. После этого готовьте 1% -ный раствор CaCl 2 , растворяя 2,5 г его в 250 мл dH 2 O. Подготовьте 2 % CoCl 2 путем растворения 5 г его в 250 мл dH 2 O.
      3. Храните и используйте эти решения, как указано выше. Наконец, подготовьте 0,2% сульфида аммонияСмешивая 800 мкл 20% (NH 4 ) 2 S в 40 мл dH 2 O. Подготовьте последний свеже.
    5. Подготовьте растворы при определенных значениях рН следующим образом. После калибровки рН-метра удалите из холодильника кюветы, хлориды кальция и кобальта и дайте им нагреться до комнатной температуры до окрашивания.
      1. Для pH 10.3 добавьте около 25 мл раствора А в маленький (приблизительно 70 мл) стеклянный стакан. Измерьте pH. Продолжайте добавлять раствор B до достижения требуемого рН 10,37. Если окраска слишком темная, увеличьте pH. Если он слишком яркий, уменьшите pH.
      2. Для рН 4,6 добавляют около 25 мл «кислотной предварительной инкубации» в маленький стеклянный стакан. Измерьте pH. Уменьшите pH, используя 5 М уксусную кислоту . Если изображение пятна слишком темное, попробуйте осветлить его с увеличением pH. Если он слишком яркий, темнеет при пониженном рН. Если окрашивание не помогает, попробуйте другой pH: 4.8 instEad 4.6.
      3. Для рН 4,3 делают то же, что и для 4,6, но добавляют больше уксусной кислоты. Уменьшите значение pH, если пятно слишком яркое, и увеличьте значение pH, если слишком темно для определения волокон.
      4. Подготовьте раствор АТФ следующим образом. Взвешивают 0,017 г АТФ на кювету (10 мл), поэтому 0,051 г на 3 кювета или 0,068 г для 4 кювет. Возьмите 30 мл (для 3 кювет, 10 мл / кювету) раствора при рН 10,3 (используйте стекло цилиндра) и положите его в стеклянный стакан со взвешенным АТФ.
        1. Тщательно перемешайте и измерьте pH. Уменьшите pH с помощью концентрированной HCl до тех пор, пока pH не достигнет ровно 9,40.
      5. Для инкубации при различных значениях рН сделайте следующее. Поместите 10,3 раствора в одну кювету и инкубируйте ее на водяной бане при 37 ° С в течение 9 мин. Поместите раствор 4.3 в другую кювету и инкубируйте ее при комнатной температуре в течение 5 мин. Поместите 4.6 раствор в последнюю кювету и инкубируйте при комнатной температуре в течение 1 мин.
      6. После предпочтительного рНИнкубации, применяйте содержимое каждой кюветы следующим образом. Промывают 15 раз с помощью dH 2 O. Добавьте к образцу биопсии раствор АТФ (0,170 г АТФ / 100 мл H 2 O). Инкубировать на водяной бане при 37 ° С в течение 30 мин. Промыть 15 раз с помощью dH 2 O.
      7. Добавьте раствор CaCl 2 (1 г CaCl 2/100 мл H 2 O) к образцу биопсии в кюветах. Инкубируйте при комнатной температуре в течение 3 мин. Промыть 15 раз dH 2 O. Добавить раствор CoCl 2 (2 г CoCl 2/100 мл H 2 O) в образец для биопсии в кюветах. Инкубируйте при комнатной температуре в течение 3 мин. Промыть 15 раз с помощью dH 2 O.
      8. Поместите его в раствор (NH 4 ) 2 S в течение 30 с и быстро промойте 15 раз под вытяжным шкафом. Приклейте кусочки биопсии на стекло. Чтобы избежать пузырей, сжать биопсии, но не слишком сложно.
    6. Выберите одну область поперечного сечения без артефактов или продольных разрезов волокна. Анализ под литомGht с помощью программного обеспечения.
    7. Оцените площадь поперечного сечения (CSA), капилляры и классификацию типа волокна ( например, тип I, IIA или IIX) с помощью компьютерного анализа изображений из среднего по меньшей мере 150-200 волокон на биопсию. Из изображения микроскопа мышечных волокон в поперечном сечении гарантируется, что три типа мышечных волокон ( например, тип I, IIA и IIX) имеют различные оттенки от белого до серого до черного, в зависимости от pH-окрашивания ( т. Е. 4,34, 4,65 и 10,37).
    8. Начните с маркировки некоторых волокон типа I. После этого программа автоматически зарегистрирует другие волокна типа I. Убедитесь, что все волокна типа I отмечены правильно. Чтобы отметить определенное волокно, нажмите кнопку «Вектор». Используйте курсор для измерения площади для каждого индивидуально выбранного мышечного волокна.
    9. После анализа волокон типа I продолжите ту же процедуру для типов IIA и типа IIX. Среднее ± SEM для каждого типа мышечного волокна ( т. Е. Тип I, IIA и IIX) следует рассчитать относительно количества волокна и CSA для групп RET и CON.
      Примечание: площадь поперечного сечения (CSA), капилляры и классификация типа волокна ( например, тип I, IIA и IIx) оценивались по среднему значению 163 ± 9 волокон на биопсию.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

материал

В исследовании участвовали 21 относительно здоровые женщины и мужчины в возрасте 65-80 лет и с показателями ИМТ от 20 до 30 кг · м -2 и были рандомизированы на две группы. Лица в обеих группах имели относительно низкий уровень физической активности ( т. Е. Умеренный уровень повседневной физической активности и отсутствие регулярных тренировок). Одна группа (n = 12, 6 женщин и 6 мужчин) выполняла RET п...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В этом исследовании был использован ряд методов для исследования эффектов краткосрочной прогрессивной тренировки по мышечной функции / морфологии пожилых людей, аэробной способности и толерантности к глюкозе. Основной вывод заключался в том, что по сравнению с контрольной группой было много улучшений в мышечной аэробной способности, толерантности к глюкозе, силе, мощности и качестве мышц ( т. Е. Белке, участвующем в клеточной передаче сигналов и составе мышечных волокон). Увеличение, например, наблюдал...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Авторы выражают благодарность Андре Нинкерку, Деннису Пейрону и Себастиану Скельду за контроль за учебными занятиями и несколькими тестами; Участвующим субъектам; Тиму Кроссфилду для пересмотра языка; И экономической поддержке Шведской школы спорта и наук о здоровье.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Western blot
Pierce 660 нм Набор для анализа белкаThermo Scientific, Рокфорд, Иллинойс, США22662
SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate Thermo Scientific34096
Коктейль ингибиторов протеазы Halt (100x)Thermo Scientific78429
Restore PLUS Western Blot Stripping BufferThermoScientific 46430
Набор для прокалывания обратимого белка для мембран PVDFThermo Scientific24585
10 st - 4– 20% гель Criterion TGX, 18 лунок, 30 и микро; LBio-Rad Laboratories, Ричмонд, Калифорния, США567-1094
Мембрана Immun-Blot PVDF Bio-Rad162-0177
Прецизионный плюс Протеин Двухцветные стандарты Bio-Rad161-0374
2x Laemmli Буфер для пробBio-Rad161-0737
10x Tris/GlycineBio-Rad161-0771
2-меркаптоэтанолBio-Rad161-0710
Tween 20Bio-RadP1379-250ML
Анализ полосы с Quantity One версия 4.6.3.softwareBio-Rad
1% ингибитор фосфатазы CoctailSigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США
Antibodies
mTOR (1:1,000)Cell Signaling, Danvers, Massachusetts, США2983
Akt (1:1,000)Cell Signaling, Danvers9272
Вторичный HRP-связанный против кроликов и мышей (1:10,000)Клеточная сигнализация, цитратсинтаза Дэнверса
(CS) (1:1,000)Gene tex, Сан-Антонио, Калифорния, США
OXPHOS (1:1,000)Abcam, Кембридж, Великобритания
strong>Equipment - Анализ образцов мышц
Bullet Blender 1.5 для гомогенизацииNext Advance, Нью-Йорк, США
Считыватель пластинTecan infinite F200 pro, Mä nnedorf, Швейцария
Histochemistry
Mayer hematoxylinHistoLab, Vä stra Frö lunda, Швеция 1820
Oil Red oSigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США00625-25y
NaClSigma-Aldrich793566-2,5 кг
Хлорид кобальтаSigma-Aldrich60818-50G
АмилазаSigma-AldrichA6255-25MG
АТФSigma-AldrichA2383-5G
ГлицинVWR-химикаты / VWR-international, Spå nga, Швеция101196X
Хлорид кальцияVWR-химикаты / VWR-international22328.262
ИзопентанVWR-химикаты / VWR-international24872.298
Этанол 96%VWR-химикаты / VWR-international20905.296
NaOHMERCK, Стокгольм, Швеция1.06498.1000
АцетатMERCK1.06268.1000
KClMERCK1.04936.1000
Сульфид аммонияMERCKU1507042828
уксусная кислота 100%MERCK1.00063.2511
Schiffs´ РеактивMERCK1.09033.0500
Периодическая кислотаMERCK1.00524.0025
ХлороформMERCK1.02445.1000
pH-метр LANGEHACH LANGE GMBH, Дюссельдорф, Германия
Световой микроскопOlympus BH-2, Olympus, Токио, Япония
Криостат  Leica CM1950Leica Microsystems, Вецлар, Германия
программное обеспечение Leica Qwin V3Leica Microsystems
Gel Doc 2000 - Bio-Rad, настройка камерыBio-Rad Laboratories AB, Сольна, Швеция 
Программа Quantift One - 4.6 (версия 4.6.3; Bio Rad)Bio-Rad Laboratories AB, Сольна, Швеция 
><Пероральный тест на толерантность к глюкозу, OGTT
Glukos APL 75 гAPL, Стокгольм, Швеция323,188
Автоматизированный анализатор Biosen 5140EKF Diagnostics, Барлебен, Германия
Инсулин и С-пептид в плазме Набор ELISAMercodia AB, Уппсала Швеция10-1132-01, 10-1134-01
Планшет считывательTecan infinite F200 pro, Mä nnedorf, Швейцария
Дополнительное оборудование
Измерения безжировой массыFFM-Tanita T5896, Tanita, Tokyo, Japan
Силовое тренировочное оборудование для всех тренировочных упражненийCybex International Inc., Medway, Massachusetts, США 
Велоэргометр Эргометр Monark 893E, Monark Exercises, Варберг, Швеция 
Пульсометр RS800, PolarPolar Electro OY, Кампеле, Финляндия
Oxycin-Pro - автоматический эрго-спирометрический приборErich Jaeger GmbH, Hoechberg, Германия
Изокинетический динамометр, Isomed 2000, сила мышц коленаD& R Ferstl GmbH, Хенау, Германия
система сбора данных CED 1401 и программное обеспечение для передачи сигналовCambridge Electronic Design, Кембридж, Великобритания
Программное обеспечение для анализа мышечной силы, Spike 2, версия 7Signal Hound, Лос-Анджелес Центр, Вашингтон, США
Программное обеспечение Statistica для статистического анализаStatistica, Stat soft. inc, Талса, Оклахома, США
<Оборудование для биопсии мышц>
Вейл Блейксли конхотомаWisex, Mö lndal, Швеция Местная
анестезия Карбокаин, 20 мл, 20 мг/мл; Astra Zeneca, Sö dertä lje, Швеция169,367
Хирургическое лезвиеПерьевая безопасная бритва CO, LTD, Осака, Япония 
<11048030

Ссылки

  1. Carrick-Ranson, G., et al. The effect of age-related differences in body size and composition on cardiovascular determinants of VO2max. J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci. 68 (5), 608-616 (2013).
  2. Peterson, C. M., Johannsen, D. L., Ravussin, E. Skeletal muscle mitochondria and aging: a review. J. Aging. 2012, 194821(2012).
  3. Russell, A. P., Foletta, V. C., Snow, R. J., Wadley, G. D. Skeletal muscle mitochondria: a major player in exercise, health and disease. Biochim. Biophys. Acta. 1840 (4), 1276-1284 (2014).
  4. Conley, K. E., Jubrias, S. A., Esselman, P. C. Oxidative capacity and ageing in human muscle. J. Physiol. 526 (Pt 1), 203-210 (2000).
  5. Holloszy, J. O. Adaptation of skeletal muscle to endurance exercise. Med. Sci. Sports. 7 (3), 155-164 (1975).
  6. Menshikova, E. V., Ritov, V. B., Fairfull, L., Ferrell, R. E., Kelley, D. E., Goodpaster, B. H. Effects of exercise on mitochondrial content and function in aging human skeletal muscle. J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci. 61 (6), 534-540 (2006).
  7. Balakrishnan, V. S., et al. Resistance training increases muscle mitochondrial biogenesis in patients with chronic kidney disease. Clin. J. Am. Soc. Nephrol. 5 (6), 996-1002 (2010).
  8. Ferrara, C. M., Goldberg, A. P., Ortmeyer, H. K., Ryan, A. S. Effects of aerobic and resistive exercise training on glucose disposal and skeletal muscle metabolism in older men. J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci. 61 (5), 480-487 (2006).
  9. Frontera, W. R., Meredith, C. N., O'Reilly, K. P., Evans, W. J. Strength training and determinants of VO2max in older men. J. Appl. Physiol. (1985). 68 (1), 329-333 (1990).
  10. Toth, M. J., Miller, M. S., Ward, K. A., Ades, P. A. Skeletal muscle mitochondrial density, gene expression, and enzyme activities in human heart failure: minimal effects of the disease and resistance training. J. Appl. Physiol. (1985). 112 (11), 1864-1874 (2012).
  11. Zachwieja, J. J., Toffolo, G., Cobelli, C., Bier, D. M., Yarasheski, K. E. Resistance exercise and growth hormone administration in older men: effects on insulin sensitivity and secretion during a stable-label intravenous glucose tolerance test. Metabolism. 45 (2), 254-260 (1996).
  12. Davidson, L. E., et al. Effects of exercise modality on insulin resistance and functional limitation in older adults: a randomized controlled trial. Arch. Intern. Med. 169 (2), 122-131 (2009).
  13. DeFronzo, R. A., Tobin, J. D., Andres, R. Glucose clamp technique: a method for quantifying insulin secretion and resistance. Am. J. Physiol. 237 (3), E214-E223 (1979).
  14. Åstrand, P. O., Ryhming, I. A nomogram for calculation of aerobic capacity (physical fitness) from pulse rate during sub-maximal work. J. Appl. Physiol. 7 (2), 218-221 (1954).
  15. Björkman, F., Ekblom-Bak, E., Ekblom, Ö, Ekblom, B. Validity of the revised Ekblom Bak cycle ergometer test in adults. Eur. J. Appl. Physiol. 116 (9), 1627-1638 (2016).
  16. Seger, J. H., Westing, S. H., Hanson, M., Karlson, E., Ekblom, B. A new dynamometer measuring eccentric and eccentric muscle strength in accelerated, decelerated and isokinetic movements: validity and reproducibility. Eur. J. Appl. Physiol. 57 (5), 526-530 (1988).
  17. Westing, S. H., Seger, J. Y., Karlson, E., Ekblom, B. Eccentric and concentric torque-velocity characteristics of the quadriceps femoris in man. Eur. J. Appl. Physiol. 58 (1-2), 100-104 (1988).
  18. Aagaard, P., Simonsen, E. B., Andersen, J. L., Magnusson, P., Dyhre-Poulsen, P. Increased rate of force development and neural drive of human skeletal muscle following resistance training. J. Appl. Physiol. 93 (4), 1318-1326 (2002).
  19. Andersen, L. L., Aagaard, P. Influence of maximal muscle strength and intrinsic muscle contractile properties on contractile rate of force development. Eur. J. Appl. Physiol. 96 (1), 46-52 (2006).
  20. Henriksson, K. G. "Semi-open" muscle biopsy technique. A simple outpatient procedure. Acta Neurol. Scand. 59 (6), 317-323 (1979).
  21. Matsuda, M., DeFronzo, R. A. Insulin sensitivity indices obtained from oral glucose tolerance testing: comparison with the euglycemic insulin clamp. Diabetes Care. 22 (9), 1462-1470 (1999).
  22. American Diabetes, Association. Diagnosis and classification of diabetes mellitus. Diabetes Care. 28, Suppl 1. S37-S42 (2005).
  23. Moberg, M., Apró, W., Ekblom, B., van Hall, G., Holmberg, H. C., Blomstrand, E. Activation of mTORC1 by leucine is potentiated by branched-chain amino acids and even more so by essential amino acids following resistance exercise. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 310 (11), C874-C884 (2016).
  24. Antharavally, B. S., Carter, B., Bell, P. A., Krishna Mallia,, A, A high-affinity reversible protein stain for Western blots. Anal. Biochem. 329 (2), 276-280 (2004).
  25. Brooke, M. H., Kaiser KK, Muscle fiber types: how many and what kind? Arch. Neurol. 23 (4), 369-379 (1970).
  26. Brooke, M. H., Kaiser, K. K. Three "myosin adenosine triphosphatase" systems: the nature of their pH lability and sulfhydryl dependence. J. Histochem. Cytochem. 18 (9), 670-672 (1970).
  27. Andersen, P. Capillary density in skeletal muscle of man. Acta Physiol. Scand. 95 (2), 203-205 (1975).
  28. Frank, P., Andersson, E., Pontén, M., Ekblom, B., Ekblom, M., Sahlin, K. Strength training improves muscle aerobic capacity and glucose tolerance in elderly. Scand. J. Med. Sci. Sports. 26 (7), 764-773 (2016).
  29. Blomstrand, E., Celsing, F., Fridén, J., Ekblom, B. How to calculate human muscle fibre areas in biopsy samples--methodological considerations. Acta Physiol. Scand. 122 (4), 545-551 (1984).
  30. Cuthbertson, D., et al. Anabolic signaling deficits underlie amino acid resistance of wasting, aging muscle. FASEB J. 19 (3), 422-424 (2005).
  31. Vincent, K. R., Braith, R. W., Feldman, R. A., Kallas, H. E., Lowenthal, D. T. Improved cardiorespiratory endurance following 6 months of resistance exercise in elderly men and women. Arch. Intern. Med. 162 (6), 673-678 (2002).
  32. Cadore, E. L., et al. Effects of strength, endurance, and concurrent training on aerobic power and dynamic neuromuscular economy in elderly men. J. Strength Cond. Res. 25 (3), 758-766 (2011).
  33. Jubrias, S. A., Esselman, P. C., Price, L. B., Cress, M. E., Conley, K. E. Large energetic adaptations of elderly muscle to resistance and endurance training. J. Appl. Physiol. (1985). 90 (5), 1663-1670 (1985).
  34. Benton, C. R., Wright, D. C., Bonen, A. PGC-1alpha-mediated regulation of gene expression and metabolism: implications for nutrition and exercise prescriptions. Appl. Physiol. Nutr. Metab. 33 (5), 843-862 (2008).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Akt mTOR
Улучшение силы, силы, мышечной аэробной способности и толерантности к глюкозе благодаря краткосрочной прогрессивной силовой тренировке среди пожилых людей
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.