Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

CAPRRESI: сбор химеры путем вставки плазмиды и рестрикционной ферментации сайта

11.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/55526

⸱

25 июня 2017 г.

 ,  , 
1Centro de Ciencias Genómicas, Universidad Nacional Autónoma de México, 2Oncomedic Incorporation, Ciudad de México, 3Laboratorio Internacional de Investigación sobre el Genoma Humano, Universidad Nacional Autónoma de México

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы представляем сбор химеры путем восстановления плазмиды и введения сайта рестрикционного фермента (CAPRRESI), протокола, основанного на введении сайтов рестрикционных ферментов в последовательности последовательностей синонимов и восстановления функциональной плазмиды. Этот протокол является быстрым и недорогим методом слияния белок-кодирующих генов.

Аннотация

Здесь мы представляем сбор химеры путем восстановления плазмиды и введения сайта рестрикционного фермента (CAPRRESI). CAPRRESI извлекает выгоду из многих преимуществ исходного метода извлечения плазмиды и вводит переваривание рестрикционного фермента, чтобы облегчить реакции лигирования ДНК (необходимые для сборки химеры). Для этого протокола пользователи клонируют гены дикого типа в одну и ту же плазмиду (pUC18 или pUC19). После выбора силикона областей аминокислотной последовательности, в которых собираются химеры, пользователи получают все последовательности синонимов ДНК, которые их кодируют. Ad hoc Perl-скрипты позволяют пользователям определять все последовательности синонимов ДНК. После этого шага другой скрипт Perl ищет сайты рестрикционных ферментов на всех синонимичных последовательностях ДНК. Это в силиконовом анализе также выполняется с использованием гена устойчивости к ампициллину ( ampR ), обнаруженного на плазмидах pUC18 / 19. Пользователи разрабатывают олигонуклеотиды внутри регионов синонима, чтобы разрушить гены дикого типа и ampR с помощью ПЦР. После obtАфинирующих и очищающих комплементарных фрагментов ДНК, происходит переваривание рестрикционного фермента. Сбор химеры достигается путем лигирования соответствующих комплементарных фрагментов ДНК. Векторы pUC18 / 19 выбраны для CAPRRESI, поскольку они предлагают технические преимущества, такие как малый размер (2686 базовых пар), высокий номер копии, преимущества функции реакции последовательности и коммерческая доступность. Использование рестрикционных ферментов для сборки химеры устраняет необходимость в ДНК-полимеразах, дающих продукты с тупыми концами. CAPRRESI - это быстрый и недорогой метод слияния белок-кодирующих генов.

Введение

Сбор химерных генов широко используется в молекулярной биологии для выяснения функции белка и / или для биотехнологических целей. Существуют различные способы слияния генов, такие как перекрытие амплификации ПЦР-продукта 1 , восстановление плазмиды 2 , гомологичная рекомбинация 3 , системы CRISPR-Cas9 4 , сайт-направленная рекомбинация 5 и сборка 6 Гибсона. Каждый из них предлагает различные технические преимущества; Например, гибкость перекрывающегося проектирования ПЦР, выбор конструкций конструкций во время восстановления плазмиды in vivo или высокая эффективность систем CRISPR-Cas9 и Gibson. С другой стороны, некоторые трудности могут возникать при выполнении некоторых из этих методов; Например, первые два подхода основываются на фрагментах ДНК с тупым концом, и лигирование этих типов продуктов может быть технически сложным по сравнению со стандартнымиKy-end лигирование. Рекомбинация на сайте может оставлять следы дополнительных ДНК-последовательностей (шрамов) на оригинале, как в системе CreloxoxP 5 . CRISPR-Cas9 может иногда модифицировать другие области генома в дополнение к целевому сайту 4 .

Здесь мы вводим сбор химеры путем извлечения плазмиды и введения сайта рестрикционного фермента (CAPRRESI), протокола для слияния белок-кодирующих генов, который объединяет способ восстановления плазмиды (PRM) с введением сайтов рестрикционных ферментов на синонимичные последовательности ДНК, повышая эффективность лигирования , Для обеспечения целостности аминокислотных последовательностей сайты рестрикционных ферментов вставляются в синонимичные последовательности ДНК. Среди преимуществ CAPPRESI заключается в том, что он может быть выполнен с использованием обычных лабораторных реагентов / инструментов ( например , ферментов, компетентных клеток, растворов и термоциклеров) и что он может давать быстрые результаты (при использовании соответствующих ферментов). Опираясь на ограничениеСайты ферментов, которые появляются из последовательностей ДНК синонимов, могут ограничить выбор точных точек слияния внутри интересующих белков. В таких случаях гены-мишени следует сливать с использованием перекрывающихся олигонуклеотидов, а сайты рестрикционных ферментов следует вставлять в ген устойчивости вектора.

CAPRRESI состоит из семи простых шагов ( рис. 1 ): 1) выбор вектора клонирования pUC18 или pUC19 6 ; 2) в силиконовом анализе последовательностей дикого типа, подлежащих сплавлению; 3) выбор областей разломов для сборки химеры и разрушения плазмиды; 4) в силиконовой генерации синонимичных последовательностей ДНК, содержащих сайты рестрикционных ферментов; 5) независимое клонирование генов дикого типа в выбранную плазмиду; 6) нарушение плазмиды с помощью ПЦР с последующим расщеплением рестрикционным ферментом; И 7) восстановление плазмиды с использованием лигирования ДНК и бактериальной трансформации. Химерные гены, полученные этой методикой, должны быть проверены wС последовательностью.

Векторы pUC18 / 19 предлагают технические преимущества для клонирования и сборки химеры, такие как малые размеры ( то есть, 2686 пар оснований), высокое количество копий, выгодные функции реакции секвенирования и коммерческая доступность 7 . Здесь хозяин Escherichia coli использовался для сборки и обработки химер, потому что бактериальные культуры дешевы и быстро растут. Учитывая это, потребуется последующее клонирование фрагментов слияния в конечные целевые плазмиды ( например, векторы экспрессии в виде pRK415 у бактерий или pCMV в клетках млекопитающих).

CAPRRESI был протестирован на слияние двух первичных генов сигма-фактора: E. colirpoD и Rhizobium etlisigA . Первичные сигма-факторы являются субъединицами РНК-полимеразы, ответственными за инициирование транскрипции, и они состоят из четырех доменов ( т. Е. Σ1, σ2, σ3 и σ4) 8 . Длина аминокислотной последовательностиЧ белков, кодируемых rpoD и sigA, равны соответственно 613 и 685. RpoD и SigA имеют 48% идентичности (охват 98%). Эти первичные сигма-факторы были разделены на два дополнительных фрагмента между областями σ2 и σ3. В соответствии с этой схемой были собраны два химерных гена: химера 01 (RpoDσ1-σ2 + SigAσ3-σ4) и химера 02 (SigAσ1-σ2 + RpoDσ3-σ4). Продукты слияния ДНК были проверены путем секвенирования.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Протокол CAPRRESI

ПРИМЕЧАНИЕ. На рисунке 1 представлен общий протокол CAPRRESI. Этот метод основан на силиконе и последующей конструкции желаемых химер.

  1. Выбор клонирующей плазмиды, pUC18 или pUC19.
    1. Выберите вектор pUC, который наилучшим образом соответствует техническим требованиям.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Оба вектора имеют одинаковую последовательность, за исключением ориентации места множественного клонирования. Это важно для разработки олигонуклеотидов и нарушения плазмиды ПЦР.
  2. В силиконовом анализе генов дикого типа и последовательностей pUC18 / 19.
    1. Получите последовательности ДНК генов дикого типа и сохраните их в файле формата FASTA ( например, genes.fas).
      ПРИМЕЧАНИЕ. Последовательности векторов pUC18 / 19 содержатся в файле pUC.fas ( рисунок 1 , шаг 1).
    2. Определить, какое ограничение enzYmes не разрезают гены дикого типа и последовательности pUC18 / 19, запустив скрипт REsearch.pl. Альтернативно, выполните поиск сайта фермента рестрикции с помощью онлайн-инструмента ( рисунок 1 , шаг 2).
      1. Введите в терминал следующее:
        Perl REsearch.pl genes.fas
        Perl REsearch.pl pUC.fas
        ПРИМЕЧАНИЕ. Эти команды создадут следующие выходные файлы: genes_lin.fas, genes_re.fas, pUC_lin.fas и pUC_re.fas.
      2. Выберите подходящие рестрикционные ферменты для клонирования генов дикого типа в сайт множественного клонирования выбранного вектора pUC18 / 19 путем сравнения файлов genes_re.fas и pUC.fas. Выберите ориентацию вставки относительно гена устойчивости к ампициллину ( ampR ) вектора pUC18 / 19.
    3. Разработать форвардные и обратные олигонуклеотиды для усиления кодирующей области генов дикого типа (внешние олигонуклеотиды). Включите подходящий сайт фермента рестрикции на каждом 5'-концеОлигонуклеотидов; Это определит ориентацию вставки.
      1. Включите функциональный сайт связывания рибосомы в передних олигонуклеотидах.
      2. Вставьте оба гена дикого типа в одну и ту же ориентацию внутри вектора.
  3. Выбор областей разломов для сборки химеры и разрушения плазмиды.
    1. Получите аминокислотную последовательность дикого типа и генов ampR , запустив скрипт translate.pl ( рисунок 1 , шаг 3).
      1. Введите в терминал следующее:
        Perl translate.pl genes.fas
        Perl translate.pl ampR.fas
        ПРИМЕЧАНИЕ. Этот скрипт будет создавать следующие выходные файлы: genes_aa.fas и ampR_aa.fas.
    2. В глобальном масштабе выровнять две аминокислотные последовательности дикого типа с помощью соответствующего программного обеспечения ( например, MUSCLE) 9 .
    3. Выберите желаемые области разломов (3-6 аминокислот) для химеры asseMbly, основанный на выравнивании последовательности. Сохраните их в файл в формате FASTA ( например , regions.fas).
    4. Найдите последовательности ДНК, которые кодируют выделенную аминокислоту, простирающуюся на оба гена дикого типа.
  4. В силиконовой генерации синонимичных последовательностей ДНК, содержащих сайты рестрикционных ферментов.
    1. Получите все последовательности синонимов ДНК, которые кодируют для каждой последовательности аминокислотных последовательностей, выбранных в качестве областей разломов ( фиг. 1 , этап 4); Эти последовательности были сохранены в файле regions.fas.
      1. Введите в терминал следующее:
        Perl synonym.pl regions.fas
        ПРИМЕЧАНИЕ. Этот скрипт будет создавать выходной файл regions_syn.fas.
    2. Найдите сайты рестрикционных ферментов, найденные на последовательностях ДНК синонима.
      1. Введите в терминал следующее: perl REsynonym.pl regions_syn.fas
        ПРИМЕЧАНИЕ. Этот скрипт будет создавать выходной файл regions_syn-re.fas,
    3. Выберите один фермент рестрикции, который разделяют между синонимичными последовательностями обоих генов дикого типа; Этот сайт будет использоваться для сборки химер посредством рестрикционного фермента пищеварения. Убедитесь, что выбранный рестрикционный фермент не режет ни гены дикого типа, ни последовательности векторов pUC18 / 19.
      1. Сравните рестрикционные ферменты, найденные в файлах genes_re.fas, pUC_re.fas и regions_syn-re.fas.
    4. В silico заменить оригиналы для их синонимичных последовательностей ДНК в соответствующих локусах на обоих генах дикого типа. Добавить последовательности синонимов ДНК в файл последовательности wildtype (genes.fas).
    5. Получите аминокислотную последовательность генов, содержащихся в файле genes.fas ( perl translate.pl genes.fas ).
    6. Выровняйте аминокислотные последовательности, переведенные из последовательностей ДНК дикого типа и синонима. Убедитесь, что обе последовательности одинаковы.
    7. Повторите все этапы этого раздела с геном ampR , присутствующим на pUC18 / 19 вектор.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Цель состоит в том, чтобы разрушить ген ampR (файл ampR.fas) на две дополнительные части. Рестриктирующий фермент, выбранный для разрушения гена ampR , должен отличаться от того, который используется для сборки химеры.
  5. Независимое клонирование двух генов дикого типа в выбранный вектор pUC18 / 19 (рис. 1, шаг 3).
    1. Очистите выбранную плазмидную ДНК pUC18 / 19 с использованием набора для очистки плазмидной ДНК.
      1. Например, трансформировать DH5α E. coli с плазмидой pUC18 и выращивать трансформанты в течение ночи при 37 ° C на твердом амбициллине LB-0,3 мг / мл (Amp). Выберите колонию трансформанта, инокулируйте новую пластину Amb LB-0,3 мг / мл и вырастите ее в течение ночи при 37 ° C.
      2. Примите участие в предыдущей культуре и вырасти в жидком LB-0,3 мг / мл Amp в течение 6-8 ч при 37 ° C. Экстрагируют плазмидную ДНК с использованием набора.
    2. ПЦР усиливают гены дикого типа из общей геномной ДНК с использованиемRiate внешние олигонуклеотиды. Используйте, если возможно, высококачественную ДНК-полимеразу. Выберите ДНК-полимеразу, которая максимизирует выход. Выполните ПЦР в соответствии с рекомендациями производителя и температурой плавления олигонуклеотидов.
      1. Выполнять циклы ПЦР в зависимости от ДНК-полимеразы, размера ампликона, матрицы и олигонуклеотидов. Например, для амплификации ДНК rpoD , подготовить 50 мкл реакции: 5 мкл 10x буфера, 2 мкл 50 мМ MgSO 4 , 1 мкл 10 мМ смеси dNTP, 2 мкл каждого 10 мкМ олигонуклеотида (таблица 2), 2 Мкл ДНК-матрицы (общая ДНК DH 100), 35,8 мкл ультрачистой воды и 0,2 мкл ДНК-полимеразы высокой точности. Выполнить следующие циклы ПЦР: 1 мин при 94 ° С для начальной денатурации с последующим 30 циклами амплификации (30 с при 94 ° С до денатурации, 30 с при 60 ° С для отжига олигонуклеотидов и 2 мин при 68 ° С расширить).
      2. Растворяют 1,2 гАгарозу в 100 мл дважды дистиллированной воды путем нагревания их в микроволновой печи. Соберите гель-лоток и расчесайте его и поместите в горизонтальный гелевый литейщик. Заполните лоток для геля расплавленным раствором агарозы и дайте ему затвердеть. Удалите гребенку.
      3. Поместите гель в камеру электрофореза. Заполните камеру 1 х буфером Трис-ацетат-ЭДТА. Загрузите 50 мкл продуктов ПЦР в гель-лунки. Электрофорезные образцы ( например , при 110 В в течение 1 часа).
      4. После электрофореза окрашивают гель в 100 мл дважды дистиллированной воды, содержащей 100 мкл раствора этидия бромида 1 мг / мл в течение 10 мин с медленным встряхиванием. Вымойте гель в двойной дистиллированной воде еще на 10 мин при медленном встряхивании; Используйте горизонтальный шейкер.
        Осторожно: бромид этидия является токсичным соединением; Носить защитные перчатки и хлопковое лабораторное покрытие.
      5. Очистите ДНК гена дикого типа из соответствующих полос геля с помощью набора. Визуализируйте полосы, поместив окрашенный гель в УФ-камеру (Рекомендуемая длина волны: 300 нм). Следите за тем, чтобы экспозиция геля была минимальной. Используйте комплект для очистки ДНК и следуйте инструкциям производителя.
        Осторожно: УФ-излучение опасно; Носить защитный экран, очки и хлопковое лабораторное покрытие.
    3. Дайджест очищенных генов дикого типа и плазмидной ДНК pUC18 / 19 с рестрикционными ферментами в соответствии с инструкциями производителя. Если возможно, используйте ферменты быстрого расщепления. Например, переварить 6 мкл ДНК pUC18 (300 нг / мкл) в 10 мкл сверхчистой воды, 2 мкл 10X буфера, 1 мкл рестрикционного фермента Kpn I и 1 мкл рестрикционного фермента Xba I. Оставьте реакцию при 37 ° С в течение 30 мин.
      1. Инактивируйте рестрикционные ферменты в соответствии с рекомендациями производителя. Например, инактивируют реакцию двойного расщепления Kpn I- Xba I при 80 ° C в течение 5 мин.
    4. Смешайте вставку: векторную ДНК с объемной крысойO от 3: 1. Следуйте инструкциям производителя для реакции лигирования. При необходимости используйте быстрые лигирующие ферменты (оставьте реакцию при 25 ° C в течение 10 минут).
      ПРИМЕЧАНИЕ. Как правило, концентрация ДНК после очистки с использованием наборов достаточно хороша для реакций переваривания и лигирования. Например, добавьте 6 мкл ДНК rpoD ( Kpn I- Xba I, 150 нг / мкл), 3 мкл ДНК pUC18 ( Kpn I- Xba I, 150 нг / мкл), 10 мкл 2x-буфера, 1 мкл ультрачистого Воды и 1 мкл ДНК-лигазы T4. Оставьте реакцию лигирования при 25 ° С в течение 10 мин.
    5. Трансформируйте DH5α E. coli с 2-4 мкл реакции лигирования, как описано в дополнительных материалах. Платируйте трансформированные клетки в твердые пластины LB / Amp / X-gal / IPTG. Оставьте планшеты на ночь при 37 ° C.
    6. Выделите колонии трансформанта E. coli белого цвета и нанесите их на новую пластину LB / Amp. Оставьте планшеты на ночь при 37 ° C.
    7. Выполните ПЦР колонии, чтобы выбрать кандидатов для последовательности реакции, как описано в дополнительных материалах. Извлеките плазмидную ДНК из кандидатов. Альтернативно, дайджест кандидатной плазмидной ДНК с теми же рестрикционными ферментами, которые используются для клонирования вставок.
    8. Конструкции кандидатов последовательности с поставщиком услуг секвенирования 10 . Соберите последовательность в силиконе, используя ассемблер 11 ДНК ( рисунок 1 , этап 5).
  6. Нарушение плазмиды с помощью ПЦР с последующим расщеплением рестрикционным ферментом.
    1. Дизайн в кремниевых форвардных и обратных олигонуклеотидах в областях разлома для генов дикого типа и ampR , соответственно. Замените в silico фрагмент дикого типа для его соответствующей последовательности синонимов ДНК (полученной на этапе 1.4).
      ПРИМЕЧАНИЕ. Эта последовательность синонимов ДНК содержит сайт рестрикционного фермента. Прямые и обратные олигонуклеотиды перекрываются при tОн рестрикционный сайт фермента. Олигонуклеотиды должны варьироваться от 21-27 нуклеотидов, заканчиваться цитозином или гуанином и содержать сайт рестрикционного фермента. Прямой олигонуклеотид имеет такую ​​же последовательность, что и его область-мишень на матричной ДНК. Обратный олигонуклеотид представляет собой обратную комплементарную последовательность области мишени на матричной ДНК.
    2. Используйте две конструкции гена дикого типа в качестве шаблона ДНК для реакций ПЦР ( например, pUC18 rpoD и pUC18 sigA ). Получите две дополнительные части каждой конструкции (pUC18 rpoD σ1-σ2, pUC18 rpoD σ3 -σ4, pUC18 sigA σ1-σ2 и pUC18 sigA σ3 -σ4) ( рис. 1 , этап 6).
    3. Загрузите образцы ДНК в агарозный гель 1-1,2% [мас. / Об.]. Отделите продукты ПЦР из шаблона ДНК электрофорезом ( например, 110 В в течение 1 часа). Альтернативно, переваривать реакции ПЦР с Dpn I, чтобы разрушить шаблон ДНК.
      ПРИМЕЧАНИЕ: DpnI фермент распознает только метилированные последовательности ДНК (5'-ГАТК-3 ').
      1. Очистите образцы с помощью набора для очистки ДНК. Следуйте рекомендациям производителя.
    4. Двойной переваривать все комплементарные фрагменты ДНК с соответствующими рестрикционными ферментами в соответствии с указаниями производителя. При необходимости используйте рестрикционные ферменты с быстрым перевариванием. Например, дважды перевариваем фрагмент ДНК pUC18rpoDσ1-σ2 с Afl II и Spe I, используя протокол производителя. Оставьте реакцию переваривания при 37 ° C в течение 15 минут.
    5. Инактивируйте рестрикционные ферменты в соответствии с рекомендациями производителя. Например, инактивировать Afl II- Spe I при 80 ° C в течение 20 мин.
  7. Выделение плазмиды с использованием лигирования ДНК и бактериальной трансформации.
    1. Смешайте правильные фрагменты ДНК в объемном соотношении 1: 1 для сборки желаемого химерного гена ( рисунок1, шаг 7).
      ПРИМЕЧАНИЕ. Таким образом, целостность гена ampR восстанавливается, производя функциональный белок.
      1. Например, смешивают 4 мкл ДНК pUC18 rpoD σ1-σ2 (расщепляют с помощью Afl II- Spe I, 150 нг / мкл), 4 мкл ДНК pUC18 sigA σ3 -σ4 ( Afl II- Spe I, 150 нг / мкл), 10 мкл 2x-буфера, 2 мкл сверхчистой воды и 1 мкл ДНК-лигазы Т4; Концентрация ДНК после очистки набора достаточна для пищеварения и последующего лигирования. Оставьте реакцию лигирования при 25 ° С в течение 10 мин.
    2. Трансформируйте DH5α E. coli с 3-5 мкл реакции лигирования сборки химеры (дополнительные материалы). Растите клетки трансформанта в пластинах LB / Amp / X-gal / IPTG в течение ночи при 37 ° C в течение ночи.
    3. Выделите колонии трансформанта E. coli белого цвета и нанесите их на новую пластину LB / Amp. Оставить планшеты в течение ночи при 37° С.
    4. Выполните ПЦР колонии, чтобы выбрать кандидатов для реакции секвенирования, как описано в дополнительных материалах. Визуализировать полосы в агарозном геле 1-1,2% (мас. / Об.) Путем проведения электрофореза (описано на этапе 2.3.2.1).
    5. Выращивайте культуры у позитивных кандидатов. Извлеките из них плазмидную ДНК, используя набор для очистки плазмидной ДНК.

2. Последовательные кандидаты Химерные конструкции

  1. Убедитесь, что качество плазмидной ДНК достаточно хорошо для реакции секвенирования, следуя рекомендациям поставщика услуг последовательности. Извлеките ДНК с помощью наборов для очистки. Например, на интернет-странице поставщика услуг последовательности обратите особое внимание на рекомендуемую концентрацию ДНК для образцов. Получите концентрацию образцов с помощью прибора для количественной оценки ДНК.
  2. Последовательные кандидатные химерные конструкции с поставщиком услуг секвенирования 10 .
  3. Собрать Считывание с использованием в ассемблере 11 силиконовой ДНК.
  4. Выровняйте собранные по сравнению с силиконовыми гибридными последовательностями с помощью инструментов выравнивания последовательностей 9 , 12 . Убедитесь, что химерный ген успешно сплавлен.

3. Подготовка препаратов

ПРИМЕЧАНИЕ. Все шаги, связанные с живыми клетками, должны выполняться в чистом ламинарном вытяжном шкафу с горелкой Бунзена.

  1. Изготовление компетентных клеток DH5α E. coli .
    1. Чтобы продуцировать клетки E. coli -competent, следуйте опубликованным протоколам 13 или см. Дополнительные материалы . Альтернативно, используйте коммерчески доступные компетентные ячейки.
  2. Трансформирование DH5α-компетентных клеток E. coli .
    1. Для химической трансформации культур E. coli следуйте опубликованным протоколамClass = "xref"> 13 или см. Дополнительные материалы . Альтернативно, используйте электропорацию для бактериальной трансформации. Если используются коммерчески доступные компетентные ячейки, следуйте рекомендациям производителя.
  3. Очищающая геномная и плазмидная ДНК от E. coli DH5α.
    1. Выполните экстракцию нуклеиновой кислоты, как указано в дополнительных материалах , с использованием коммерчески доступных наборов или следующих опубликованных протоколов 13 .
  4. Выполните колоние PCR.
    1. Используйте эту методику для идентификации выбранных колоний трансформанта для последующей реакции секвенирования.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Этот метод не представляет собой окончательную проверку целостности последовательностей. Подробное описание этого метода доступно в дополнительных материалах .
  5. Подготовка решений.
    1. Видеть Таблица 1 для получения дополнительной информации о приготовлении раствора.
  6. Загрузите скрипты и файлы последовательности, необходимые для протокола CAPRRESI.
    1. Загрузите файлы генных банков, содержащие полную последовательность генома нужного вида, извлеките ДНК-последовательность выбранного гена с помощью браузера генома и сохраните его в формате файла fasta. Загрузите скрипты Perl, необходимые для протокола CAPRRESI. Храните сценарии и файлы последовательности в том же каталоге.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

На рисунке 1 изображен CAPRRESI. Используя этот метод, два химерных гена были собраны путем обмена доменами двух бактериальных первичных сигма-факторов ( то есть E. coli RpoD и R. etli SigA). Последовательности ДНК генов rpoD и sigA были получены с использованием браузера Artemis Genome Browser 14 из файлов генома GenBank NC_000913 и NC_007761 соответственно. Последовательность ДНК вектора pUC18 была получена из...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

CAPRRESI был разработан как альтернатива PRM 2 . Оригинальный PRM - это мощная техника; Он позволяет слияние последовательностей ДНК вдоль любой части выбранных генов. Для PRM ​​гены дикого типа должны быть клонированы в одну и ту же плазмиду. После этого олигонуклеотиды сконструированы внутри генов устойчивости к дикому типу и антибиотикам, обнаруженных на плазмиде. Прерывание плазмиды достигается с помощью ПЦР с использованием ДНК-полимераз с высокой степенью точности и высокой точностью и ране...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана Национальным конгрессом и технологией, КОНАЦИТом, Мексикой (грант № 154833) и Национальной академией штата Мексика. Авторы хотели бы поблагодарить Виктора Гонсалеса, Розу И. Сантамарию, Патрицию Бустос и Соледада Хуареса за их административные и технические консультации.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Платиновая ДНК-полимераза Taq High FidelityThermo Fisher11304011Производит смесь тупых/3'-A продуктов для ПЦР с верхним углом
Набор для выделения плазмидRoche11754785001Используется для всех реакций очистки плазмид Набор
очистки продуктов ПЦР высокой чистотыRoche11732676001Используется для всех реакций очистки ПЦР из агарозных гелей
Фермент рестрикции AflIINew England BiolabsR0520LРаспознает последовательность 5'-CTTAAG-3' и разрезает при 37 °°; C
фермент рестрикции KpnI-HFNew England BiolabsR3142LРаспознает последовательность 5'-GGTACC-3' и разрезает при 37 °°; C
SpeI-HF фермент рестрикцииNew England BiolabsR3133LРаспознает последовательность 5'-ACTAGT-3' и разрезает при 37 °°; C
XbaI фермент рестрикцииNew England BiolabsR0145LРаспознает последовательность 5'-TCTAGA-3' и разрезает при 37 °°; C
Ампициллин натриевая сольSigma AldrichA0166-5GАнтибиотики
Налидиксовая кислотаSigma AldrichN8878-5GАнтибиотики
Дрожжевой экстрактSigma AldrichY1625-1KGБактериальная клеточная культура
Казеин пептонSigma Aldrich70171-500GБактериальная клеточная культура
NaClSigma AldrichS9888-1KGХлорид натрия
AgarSigma Aldrich05040-1KGБактериальная клеточная культура
XbaI фермент рестрикцииThermo FisherFD0684Быстроусвояемый фермент XbaI фермент
KpnI фермент рестрикцииThermo FisherFD0524Fast digest KpnI enzyme
Quick Ligation Kit NewEngland BiolabsM2200SНабор для быстрого лигирования ДНК
AflII фермент рестрикцииThermo FisherFD0834Fast digest AflII enzyme
SpeI фермент рестрикцииThermo FisherFD1253Fast digest SpeI enzyme
для

Ссылки

  1. Horton, R. M., Hunt, H. D., Ho, S. N., Pullen, J. K., Pease, L. R. Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension. Gene. 77 (1), 61-68 (1989).
  2. Vos, M. J., Kampinga, H. H. A PCR amplification strategy for unrestricted generation of chimeric genes. Anal. Biochem. 380 (2), 338-340 (2008).
  3. Hawkins, N. C., Garriga, G., Beh, C. T. Creating Precise GFP Fusions in Plasmids Using Yeast Homologous Recombination. Biotechniques. 34 (1), 1-5 (2003).
  4. Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat Biotechnol. 32 (4), 347-355 (2014).
  5. Nagy, A. Cre recombinase: The universal reagent for genome tailoring. Genesis. 26 (2), 99-109 (2000).
  6. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  7. Norrander, J., Kempe, T., Messing, J. Construction of improved M13 vectors using oligodeoxynucleotide-directed mutagenesis. Gene. 26 (1), 101-106 (1983).
  8. Gruber, T. M., Gross, C. A. Multiple sigma subunits and the partitioning of bacterial transcription space. Annu Rev Microbiol. 57, 441-466 (2003).
  9. Edgar, R. C. MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput. Nucleic Acids Res. 32 (5), 1792-1797 (2004).
  10. Macrogen Inc. , Seoul, Rep. Of Korea. Available from: http://dna.macrogen.com/eng/index.jsp (2016).
  11. Chevreux, B. MIRA: an automated genome and EST assembler. , Available from: http://www.chevreux.org/thesis/index.html 1-161 (2005).
  12. Thompson, J. D., Gibson, T. J., Higgins, D. G. Multiple sequence alignment using ClustalW and ClustalX. Curr Protoc Bioinformatics. , Chapter 2 (Unit 2.3) 1-22 (2002).
  13. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning: A laboratory manual. CSHLP. , (2001).
  14. Rutherford, K., et al. Artemis: sequence visualization and annotation. Bioinformatics. 16 (10), 944-945 (2000).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Синонимичные последовательности ДНКанализ с помощью Perl-скриптадизайн олигонуклеотидовПЦР-амплификацияочистка гелялигирование ДНК
CAPRRESI: сбор химеры путем вставки плазмиды и рестрикционной ферментации сайта
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.