В методах Vitro для сравнения цели связывания и CDC Индукционные Между терапевтических антител применения в анализе Biosimilarity

Summary

Этот протокол описывает in vitro сравнение двух ключевых функциональных характеристик ритуксимаба: связывание с мишенью и комплемент-зависимую цитотоксичность (CDC). Методы были использованы для сравнения между эталонным ритуксимабом и биоподобным ритуксимабом. Эти анализы можно использовать во время биоподобного развития или в качестве контроля качества в их производстве.

Abstract

Терапевтические моноклональные антитела (mAbs) имеют отношение к лечению различных патологий, включая раковые образования. Разработка биоподобных mAb фармацевтическими компаниями - это рыночная возможность, но это также стратегия увеличения доступности лекарств и снижения затрат, связанных с терапией. Протоколы, подробно описанные здесь, описывают оценку связывания мишеней и индукцию CDC ритуксимабом в клетках Daudi. Эти две функции требуют различных структурных областей антитела и имеют отношение к клиническому эффекту, индуцированному ритуксимабом. Протоколы позволяют проводить параллельное сравнение эталонного ритуксимаба и биодоступного ритуксимаба. Оцененные продукты демонстрировали различия как в связывании с мишенью, так и в индукции CDC, предполагая, что существуют фундаментальные физико-химические различия и подчеркивается необходимость анализа влияния этих различий в клинических условиях. Описанные здесь методы являются простыми и недорогими in vitro </ Em> для оценки активности биосимиляров ритуксимаба. Таким образом, они могут быть полезны при биоподобном развитии, а также для контроля качества в биоподобном производстве. Кроме того, представленные методы могут быть экстраполированы на другие терапевтические mAb.

Introduction

Терапевтические антитела представляют собой рекомбинантные моноклональные антитела (mAb), разработанные для лечения различных патологий, включая рак, аутоиммунные и хронические заболевания, неврологические расстройства и другие. ¹ . В настоящее время FDA одобрило более 40 терапевтических моноклональных антител, и ожидается, что в последующие годы ожидается их появление на рынке.

Ритуксимаб - это высокоаффинное химерное моноклональное антитело IgG1, одобренное для лечения лимфомы CD20 ⁺ В-клеток неходжкинской лимфомы (NHL), CD20 ⁺ фолликулярной NHL, хронического лимфолейкоза и ревматоидного артрита ^{2 , 3} . Признание CD20, который сверхэкспрессируется в В-клетках ритуксимабом, индуцирует апоптоз; Активация комплемента; И антителозависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность (ADCC) ³ . Патенты на этот препарат истекли в Европе и в США в 2013 и 2016 годахСоответственно. Таким образом, фармацевтические компании по всему миру разрабатывают ритуксимаб биоподобий. Как и в любом другом препарате для потребления человека, биоаналоги требуют одобрений регулирующих органов. Международные руководящие принципы показывают , что для МКИ, biosimilarity должна быть продемонстрированы путем сравнения физико - химические характеристики, фармакокинетика, эффективности и безопасности новых и эталонных продуктов ^4.

Соответственно, методики, используемые в таких сравнениях должны оценить структурные и функциональные характеристики мАта, особенно с клинической значимостью. С этой целью, анализы в пробирке показывают несколько преимуществ по сравнению с экспериментами в естественных условиях (обзор в Chapman и др.) ^5: I) в пробирке исследование более чувствительны к различиям между предлагаемым биоподобием и эталонным продуктом; б) в естественных условиях исследования должны быть выполнен в соответствующих видах, которые в течение многого мАта являютсянечеловеческие приматы; и III) , так как механизм действия, доклинической токсикологии, а также клинических эффектов эталонного продукта, хорошо известны, в естественных условиях исследования с биоподобий не могут обеспечить дополнительную полезную информацию. Соответственно, Руководство Европейского Союза по биоподобиям позволяет кандидатам ввести клинические испытания , основанные на надежном в одних только ⁶ лабораторных данных.

Здесь мы представляем два быстрых, экономические и простые анализы , которые оценивают биологическую активность ритуксимаба с использованием CD20 ⁺ культивируемых клеток. Эти анализы могут быть включены как часть сопоставимости упражнения для ритуксимаба биоподобных кандидатов.

Protocol

1. Оценка связывания мишени с помощью проточной цитометрии

1. Получение биологических материалов и реагентов
   1. Сделать 500 мл культуральной среды RPMI с добавлением 10% инактивированной нагреванием фетальной бычьей сыворотки (H-IFBS).
   2. Лимфома (Даудите) клетка культуры Дауди Беркитта и Даудите GFP ⁺ клетки с использованием RPMI и 75-см ² колбы с культурой. Поддерживать культуру при 37 ° С в 5% СО ₂ увлажненной атмосфере , пока они не достигают 6 - 9 × 10 ⁵ клеток / мл.
   3. Сделать 50 мл окрашивающего буфера путем разбавления 1/100 H-IFBS в PBS; этот буфер стабилен при 2 - 8 ° C в течение по крайней мере, одного месяца.
   4. Подготовка тестовых решений для справки и биоподобных моноклональных. Сделать десять 1: 2 серийных разведений (500 мкл каждого) в буфере окрашивания, начиная с 5 мкг / мл.
   5. С помощью окрашивания буфера для разбавления человеческого IgG (контроль изотипа) до 5 мкг / мл и РЕ-Су5 мыши против человеческого IgG (вторичного антитела) к концентровка предложенный производителем.
   6. Подготовьте 4% параформальдегида в PBS (фиксация буфера).
2. Целевое связывание
   1. Сбор Дауди и суспензий Дауди GFP ⁺ клеток из колбы с культурой 75 см ² и передавать их в центрифужную пробирку 15 мл. Центрифуга при 400 мкг в течение 5 мин.
   2. Промывают клетки путем добавления 5 мл PBS и центрифугирование клеточной суспензии при 400 мкг в течение 5 мин.
   3. Ресуспендируют клеток в PBS и выполнять подсчет клеток и анализ жизнеспособности с трипановым синим. Использование культур с уровнями жизнеспособности клеток ≥ 95% для анализа.
   4. Развести клеточную суспензию до 4 × 10 ⁶ клеток / мл с холодным буфером окрашивания.
   5. В микропробирок 1,5 мл, добавляют 50 мкл клеточной суспензии в 100 мкл различных концентраций испытании эталонного или биоподобных мАт. Включите повторы для каждого экспериментального условия.
   6. Подготовьте дополнительные трубки дляконтроль изотипа (IgG1 человека вместо ритуксимаба) и отрицательный контроль (вторичное антитело без первичного антитела).
   7. Инкубируют при температуре 4 ° С в течение 20 - 30 мин.
   8. Промывают клетки путем добавления 1 мл PBS и центрифугирование клеточной суспензии при 400 мкг в течение 5 мин при 10 ° С. Жидкость над осадком сливают.
   9. Суспендирования клеток в 100 мкл вторичного антитела и инкубируют в течение 20 - 30 мин при 4 ° С, в защищенном от света месте.
   10. Вымойте клетки дважды с PBS и подвесить их в 200 мкл буфера фиксации.
   11. Анализ клеток на цитометр потока.
       Примечание: Сигнал остается стабильным в течение нескольких дней, если образцы хранили при 4 ° С в защищенном от света.
3. Получение данных
   1. Открыто два дот-участки на листе потока цитометрии операционного программного обеспечения. Установите FSC-A в сравнении с FSC-H в первой и FSC-A в сравнении с SSA-А во втором. Открыть гистограмму для канала PE-Cy5.
   2. На графике FSC-A и FSC-H сделайте выбор (R1) для выбора синглетных событий ( рисунок 1A ).
   3. Задайте населенность R1 в точках FSC-A и SSA-A, а затем создайте новый затвор (R2), выбрав целевые ячейки ( рисунок 1B ). Задайте населенность R2 в гистограмме интенсивности PE-Cy5 для просмотра частотного распределения ячеек.
   4. Отрегулируйте нижнюю интенсивность флуоресценции (FI) для канала PE-Cy5, используя отрицательный и изотипический контроль ( рисунок 1C ).
   5. Приобретите 10,000 событий в R2 из образца с более высокой концентрацией эталонного продукта. FI этого образца должен быть самым ожидаемым ( рис. 1С ).
   6. Приобрести остальные образцы.
   7. Для каждого образца получить среднюю интенсивность флуоресценции (MFI) в канале PE-Cy5.
   8. Для образцов с эталонным или биоподобным mAb рассчитывают разницу между образцом MFI и контрольным образцом изотипа (ΔMFI).

2. Оценка CDC

1. Получение биологических материалов и реагентов
   1. Приготовьте среду для культивирования клеток и культур Дауди и Даудите GFP ⁺ клетки , как описано выше (этапы 1.1.1 - 1.1.2).
      Примечание: Кроме того, анализ CDC требует бессывороточной RPMI.
   2. Развести нормальный человеческий сывороточный комплемент (NHSC) 1: 2 с бессывороточной RPMI. Подготовьте 2,5 мл.
   3. Подготовить 1 мл инактивированной нагреванием (30 мин / 56 ° C) NHSC разводили 1: 2 RPMI.
   4. Подготовка наборов тестов решений для справки и биоподобного мАт в бессывороточной среде RPMI. Сделать десять разведений (200 мкл каждого) от 1 до 0,025 мкг / мл.
2. CDC анализ
   1. Сбор клеток Дауди и Даудите GFP ⁺ из культур и количественное определение жизнеспособности клеток (см шагов 1.2.1 - 1.2.3).
   2. Приготовьте суспензию клеток с 4 × 10 ⁵ клеток / мл в бессывороточной среде RPMI.
   3. Добавить50 мкл клеточной суспензии до 50 мкл каждой контрольной или биоподобной концентрации mAb-теста в 96-луночных конических (V) -базовых микропланшетах. Включите повторы для каждого экспериментального условия.
   4. Приготовьте дополнительные лунки для отрицательного контроля ( т.е. без mAb), контроля основной гибели ( т.е. инактивированного нагреванием NHSC в присутствии mAb) и окрашивания положительным контролем ( т.е. клеток , подвергнутых воздействию 50 мкл 70% EtOH).
   5. Инкубируйте клетки в течение 20-30 мин при 37 ° С в увлажненной атмосфере с 5% СО ₂ .
   6. Добавить 50 мкл NHSC (разбавленный 1: 2) в каждую лунку и инкубировать опсонизированные клетки в течение 2,5 ч при 37 ° С в 5% CO ₂ -увлажненной атмосфере. Используйте Инактивированную теплом NHSC в базальных скважинах контроля смертности.
   7. Центрифуга при 400 xg в течение 5 мин при 10 ° C. Отбросьте супернатант.
   8. Промойте клетки, добавив 150 мкл PBS и центрифугируя клеточную суспензию в течение 5 мин при 400 xg и 10 ° C. диSCard супернатант.
   9. Пятно образцы с 7-aminoactinomycin (7-AAD), как описано ранее , ^{7, 8.}
   10. Анализ клеток на цитометр потока в тот же день.
3. Получение данных
   1. Открыто два дот-участки на листе потока цитометрии операционного программного обеспечения. Установите эти участки как на этапах 1.3.1 - 1.3.3 (рис 2A-B). Создайте третий сюжет, который является точка-участок для GFP в сравнении с 7-AAD на население R2.
   2. Определить адекватные пределы FI с использованием клеток Дауди, Дауди GFP ⁺ клеток, и смерть положительный контроль (фиг.2С).
   3. Для каждого образца, измеряют процент 7-AAD ⁺ клеток - мишеней. Приобретение по меньшей мере, 5000 событий из R2.
   4. Рассчитать удельную мАт-индуцированную цитотоксичность путем вычитания процентного содержания 7-АСР ⁺ в базальном контроле смертности от процентного найденных в образцах с отличаютсяКонцентрации ЛОР мАт (фигура 2D).

3. Анализ Biosimilarity

1. Введите значение концентрации и реагирования в графическом программное обеспечение.
2. Генерация графики и вычислить нелинейные регрессии с учетом следующих соображений: я) использовать лог-преобразование концентрации МКА как «X»; б) использовать переменную крутизну математическую модель (Y = минимальный ответ + (максимальный ответ - минимальный ответ) / 1 + 10 ^ ((LogEc ₅₀ -X) * Хилл склон)); и III) ограничивают нижние значения к нулю, так как базальной ответ был вычитали.
   Примечание: Кривые с симметричной сигмовидной формой, как ожидается.
3. Сравните оба нелинейных припадки с глобальной посадкой с использованием F-тест (компьютерные программ многих графических включить эту функцию).
   Примечание: Такие испытания устанавливают в качестве нулевой гипотезы о том , что максимальный ответ, LogEc _50, а наклон Хилла являются одинаковыми для двух наборов данных, который соответствуетБиологический вопрос, который предполагается решить.

Results

Используя протоколы, описанные выше, сравнение с мишенью и индукцию CDC эталонного ритуксимаба сравнивали с таковыми для биоподобного ритуксимаба, полученного и коммерчески доступного в Азии.

В клетках Daudi оба mAb связывали CD20 зависимым от концентрации образом ( фиг. 1D ). Нелинейные регрессии данных связывания отображали r ² из 0,978 и 0,848 для эталонного и биоподобного ритуксимаба, соответств...

Discussion

Патентная истечение терапевтического МАБ способствует развитию биоподобий. Таким образом, существует потребность в простых методов, которые могут выявить различия в клинически значимых деятельности этих продуктов. CD20 ⁺ культивируемые клетки были использованы для оценки два ключевых функциональных характеристик ритуксимаба: мишень связывания и CDC индукции. Прежняя деятельность требует признаний CD20 по ливерпульской области МКИ, а последние зависит в основном от взаимодействия Fc области с его дополнением <...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
RPMI-1640 medium	ATCC	30-2001	Модифицируйте культуру в зависимости от клеточной линии
Trypan Blue раствор	Sigma	T8154	0,4%, жидкий, стерильно-фильтрованный, подходящий для клеточной культуры
Daudi Burkitt's Lymphoma Cells	ATCC	CCL-213	Вы можете модифицировать клеточную линию в зависимости от интересующего антитела
Фетальная бычья сыворотка (FBS)	GIBCO	16000-044	Вы можете изменять источник сыворотки в зависимости от требований клеточной линии
Нормальный человеческий сывороточный комплемент	Quidel	A113	Поэтому он подходит для использования в экспериментах по биосовместимости, включая разработку лекарств, тестирование биоматериалов и другие приложения
7AA-D	BDPharmigen	559925	Вы можете использовать широкий спектр цветовых вариантов, совместимых с большинством конфигураций инструментов для анализа жизнеспособности.
PECy5 Mouse Anti-human IgG	BDPharmigen	551497	Изменение флуорохрома в зависимости от фильтра и лазера вашего проточного цитометра
Контроль изотипа IgG человека	ThermoFisher Scientific	07-7102	Изменение в зависимости от mAb
BDCytofix	BDPharmigen	554655	Буфер фиксации проточной цитометрии (1 - 4% формальдегида или параформальдегида)
PBS pH 7,4 10x (Фосфатный буфер физиологический раствор)	GIBCO	70011-044	Фосфатбуфер без Ca2+/Mg2+ [137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 1,46 mM KH2PO4] и без эндотоксинов.
Планшеты для клеточных культур 96 лунок, V-образное дно	Corning	29442-068	12 x 75 мм с круглым дном или 96-луночные V- или U-образные микротитровые планшеты
MabThera (Rituximab)	Roche	—	Референтный продукт
Ритуксимаб	индийский	—	Биоаналог
Конические центрифужные пробирки объемом 15 или 50 мл	Corning	430290 или 430052	—
Наконечники для дозатора	Eppendorf	—	Необходимы конфигурации нескольких томов
Пипетки	Eppendorf	—	Необходимы пипетки с регулируемым объемом
Центрифуга 5430/ 5430R модель	Eppendorf	—	Охлаждаемая центрифуга с регулируемой скоростью (от 4 до 25 °°; В) со скоростями от 10 до 30,130 раз; g
Проточный цитометр	BD Dickinson	—	BD FACSAria III или другой проточный цитометр
Оптический и световой микроскоп Olympus		—	Количественная оценка и оценка роста клеток
Инкубатор	SANYO	—	Инкубатор для контроля температуры и CO2 культуральным клеткам
Шкаф биологической безопасности	CHC BIOLUS&	mdash;	Шкаф биологической безопасности, который используется для защиты исследователя, продукта и окружающей среды.