Эффективный и гибкий метод Cell агрегация для 3D сфероида производства

Summary

Здесь мы описываем быстрый и гибкий протокол для формирования сфероидов 3D-клеток путем агрегации клеток. Он легко адаптируется к нескольким типам клеток и подходит для использования в различных приложениях, включая миграцию клеток, инвазию или анализ анойкиса, а также для визуализации и количественной оценки клеточных матриксных взаимодействий.

Abstract

Однослойная культура клеток не адекватно моделировать поведение в естественных условиях тканей, который включает в себя сложные межклеточные и клетка-матрица взаимодействий. Трехмерные технологии (3D) культивирования клеток являются недавнее нововведение разработано для устранения недостатков культуры прикрепленных клеток. В то время как несколько способов генерации аналогов ткани в пробирке, были разработаны, эти методы часто сложны, дороги , чтобы установить, требуют специализированного оборудования, и , как правило , ограничены совместимостью только с определенными типами клеток. Здесь мы описываем быстрый и гибкий протокол для агрегацию клеток в многоклеточных 3D сфероидов одинакового размера, который совместим с ростом различных опухолевых и нормальных клеточных линий. Мы используем различные концентрации в сыворотке крови и метилцеллюлозы (MC), чтобы способствовать анкерное-независимого сфероид поколения и предотвратить образование монослоев клеток в высоко воспроизводимым образом. Оптимальные условия для Individual клеточные линии могут быть достигнуты путем регулировки MC или сывороточные концентрации в сфероида пластового среде. 3D-сфероиды, сгенерированные могут быть собраны для использования в широком диапазоне применений, в том числе клеточных сигналов или исследований экспрессии генов кандидата скрининга лекарственных средств, или в изучении клеточных процессов, таких как инвазии опухолевых клеток и миграции. Протокол также легко адаптировать для создания клоновых сфероидов из одиночных клеток, и могут быть адаптированы для оценки анкерное-независимый рост и anoikis резистентность. В целом, наш протокол обеспечивает легко изменяемый способ генерирования и использования 3D сфероиды клеток для того , чтобы Повторим 3D микроокружение тканей и смоделировать рост в естественных условиях нормальных и опухолевых клеток.

Introduction

Биологически соответствующая оценка поведения опухолевых клеток является сложной задачей с использованием традиционных двумерных (2D) методологии клеточной культуры, отчасти потому , что они не могут адекватно отразить микросреды клеток нашли в естественных условиях. Альтернативные подходы , включающие компоненты внеклеточного матрикса в культуре (например, Бойденом камерные анализах) являются более физиологически представитель естественных условиях окружающей среды ткани в. Тем не менее, они могут быть ограничены оценкой индивидуального поведения клеток, и не резюмировать комплекса в комбинации прижизненного клеточного матрикса и межклеточных взаимодействий , которые способствуют росту ткани или опухоли ^{1, 2, 3.}

Использование многоклеточных сфероидов является недавний подход , который более точно воспроизводит компактную архитектуру роста в естественных условиях клетки ^1,4. Сфероидов может быть использован для исследования клетка-матрица взаимодействия нормальных клеток, но могут также выступать в качестве аналогов опухолевые для моделирования характеристик прогрессии опухоли, такие как рост метастазов или резистентности к лекарственным препаратам ^4.

Сфероиды могут быть образованы путем пролиферации отдельных клеток , внедренных в матрицу ^5, или более быстро, способствуя агрегации нескольких ячеек , чтобы сформировать один кластер клеток (например, висячей капли, методы центрифугирования) ^{6, 7.} Существующие методы агрегации клеток может потребовать дорогостоящих материалов или специализированного оборудования. Кроме того, эти сфероиды имеют широкий диапазон размеров и морфологией и может быть трудно производить в больших количествах, что делает сравнения между условиями роста или лечения сложных. И, наконец, сфероиды, генерируемые этими способами может быть трудно отделить от белковый extracellular матрица, в которой они включены для использования в других приложениях.

Здесь мы описываем надежную и легко изменяемый методологии агрегации клеток для быстрого формирования последовательно размерных сфероидов клеток с использованием коммерчески доступного U-дно электролизера водоотталкивающий пластины и инертную адгезионный матрицу, метилцеллюлоза. После образования эти многоклеточные сфероиды легко выделены для использования в широком диапазоне применений. Протокол также легко адаптировать для создания сфероидов посредством пролиферации клеток, которые могут быть использованы для оценки других клеточных процессов. Здесь мы покажем вторжение клеток анализы, количественно с помощью иммунофлуоресценции окрашивания, а также анализ anoikis, в качестве примера применения этих двух различных протоколов формирования сфероида.

Protocol

Примечание: Все реагенты и расходные материалы перечислены в списке материалов.

1. Сфероид производства по Cell Aggregation

1. Метил раствор целлюлозы: Приготовьте 100 мл 100 мг / мл метилцеллюлозы.
   1. Тепло 50 мл сверхчистой Н ₂ О до 80 ° С. Добавить 10 г порошка метилцеллюлозы и перемешивать до тех пор, пока частицы равномерно распределены.
   2. Довести до конечного объема холодной сверхчистого H ₂ O и перемешивают при 4 ° С до тех пор , пока раствор станет прозрачным, палевого цвета, и не содержит видимых твердых частиц.
   3. Проход через фильтр с размером 0,45 мкм, чтобы удалить нерастворенные твердые вещества. Приготовленный раствор может быть аликвоты и хранили при 4 ° С в течение до 12 месяцев.
      Примечание: Метилцеллюлоза служит не цитотоксические, инертным, суспендирующим агентом для улучшения адгезии клетка-клетка и препятствует образованию липкого монослое клеток. Метилцеллюлоза растворим в воде и может быть смыта следующие СФЕРподъязычная поколение.
2. Сфероид формирование среднего
   Примечание: Подготовка сфероид образования среде непосредственно перед использованием. Не храните.
   1. Развести метильную раствор целлюлозы до 1-5 мг / мл в соответствующей культуральной среде.
   2. Проход через фильтр с размером пор 0,22 мкм для стерилизации и удаления нерастворенных твердых веществ.
3. Фосфатный буферный солевой раствор Дульбекко (PBS) ,
   1. Развести до 1х и проходить через фильтр 0,45 мкм перед его использованием. Приготовленный раствор можно хранить неопределенно долго при комнатной температуре.
4. Производство Cell сфероида (рисунок 1)
   Примечание: Подготовьте все реагенты заранее. Важно, чтобы избежать загрязнения растворов пыли, волокон или других нерастворимых частиц. Присутствие этих загрязнителей отрицательно скажется на сфероид образование. Питательная среда и другие решения должны быть пропущены через фильтр 0,45 мкм, чтобы удалить эти частицы, когда позскорее. Избегайте использования хлопковых фильтрованное пипеток при передаче решений, поскольку они могут вводить дополнительные волокна.
   1. Культуру клеток монослоев до 70% слияния в соответствующей культуральной среде с добавлением 10% сыворотки. Отберите культуральной среды и промыть 1x PBS для удаления мусора. Добавить 3 мл трипсин-ЭДТА (0,05% трипсина) диссоциации буфера до 10 см клеточной культуральной чашки с, и инкубировать клетки при 37 ° С и 5% CO _2.
   2. Проверьте клетки под микроскопом при 10-кратным увеличением, чтобы подтвердить отрыв. Нейтрализовать буфера диссоциации 7 мл культуральной среды сывороткой.
   3. Центрифуга клеточной суспензии при 500 мкг в течение 10 мин, чтобы мягко пеллетах клетки.
   4. Удалить супернатант. Ресуспендируют осадок клеток в 1 мл среды формирования сфероида с использованием P1000 пипетки с наконечником фильтра.
      Примечание: Клеточная суспензия должна быть свободна от комков.
      1. Для растирают осадок клеток, нажмите кончиком пипетки к нижней части трубки под небольшим углом в то время какпипеткой стричь осадок клеток. Избегайте растирания более 3 - 5 раз, так как это может привести к повреждению клеток. Пипетка медленно и не высылать все содержимое наконечника пипетки, чтобы избежать образования пузырьков.
   5. Граф клеток с использованием гемоцитометра и разбавленной суспензии клеток до 1 × 10 ⁴ клеток / мл.
      Примечание: Номер ячейки могут быть оптимизированы для создания сфероидов различных размеров. Трипанового синего окрашивания поврежденных клеток могут быть использованы для подтверждения жизнеспособности клеток ресуспендировали.
   6. Суспензию клеток Передача в стерильную незапыленную многоканальной пипеткой резервуара и использовать подсказки фильтра для Распределить 100 мкл в каждую лунку 96-луночного U-образным дном ячейки гидрофобизирующие пластины.
      1. Промойте резервуар с фильтрованной сверхчистых H ₂ O , чтобы удалить пыль и волокна.
      2. Смешайте суспензии клеток периодически в то время как высева, чтобы предотвратить клетки оседать на дно резервуара. Для того, чтобы избежать создания пузырьков, используйте обратную технику пипетирования при перемешивании и dispensinг.
   7. Передача пластин в инкубаторе тканевых культур (37 ° C и 5% CO ₂₎ и проверять ежедневно для сфероида формирования. Клетки должны оседать на дно каждой лунки в течение 6 ч и обычно слипаются в сфероид в течение 24-48 ч (рисунок 2).
   8. Для подтверждения успешного формирования сфероида, используйте кончик p10 и осторожно пипеткой среду над сфероида, наблюда под микроскопом при 10-кратным увеличением. Правильно сформированные сфероиды ослабит от пластины и валика, подтверждающие их 3D-структуру.
      Примечание: метилцеллюлоза и сывороточные концентрации должны быть определены путем титрования для каждой клеточной линии, чтобы получить образование одного сфероида на лунку. Условия Оптимизированные таким образом для выбранных клеточных линий приведены в таблице 1, а примеры сфероидов образуются на фигуре 2В. Spheroids можно выращивать дольше, чем указано, но, поскольку они становятся больше, они становятся все более труднымдля обработки без фрагментации. Если клетки образуют монослой, спутниковые сфероиды или не оседают на дно колодца, концентрация метилцеллюлозы и сыворотке крови , возможно , должны быть дополнительно скорректированы для формирования оптимального сфероида (рис 3B). Не используйте сфероиды , содержащие загрязняющие вещества , такие как волокна или пыль (рис 3А). Предварительно образованные сфероиды можно лечить с помощью соединений, представляющих интерес, таких как факторы роста, пятна живых клеток или ингибиторов для анализа.

2. Сфероид Invasion Анализ (Рисунок 4)

1. Обезврежено коллаген
   1. Охлаждают все жидкости до 4 ° С и держать на льду при работе с коллагеном для предотвращения нежелательной полимеризации.
   2. Подготовить свежие 0,1 М и 0,01 М растворы NaOH и свежим 0,1 М HCl в сверхчистых H ₂ O. переправлены все решения через 0,22 мкм фильтры.
   3. Смешайте бычьего коллагена 1-го типа (3,1 мг / мл), запаса 0,01 М NaOH и 10х PBS (8: 1: 1 соотношение по объему) и доведения рН до 7,4 с помощью холодной 0,1 М NaOH и HCl. Конечная концентрация коллагена составляет 2,5 мг / мл.
   4. Подготовьте достаточное количество нейтрализованного коллагена, чтобы заполнить емкость формирования изображения на глубину 2-3 мм. Минимум 100 мкл требуется для каждой лунки 8-луночного культуры тканей камеры слайд, перечисленных в списке материалов.
2. Вложение сфероидов в коллаген (Рисунок 4)
   1. Смазать дно каждой лунки 8-луночного тканевой культуры камеры слайде с минимумом 50 мкл нейтрализованного коллагена.
      1. чтобы избежать образования пузырьков в коллагене Используйте обратную технику пипетирования. Используйте кончик пипетки, чтобы распространить коллаген равномерно по всей поверхности скважины.
         Примечание: Этот базовый слой коллагена будет держать сфероидов в суспензии и, как правило, толщиной 1-2 мм. Базовый слой минимизирует образование мениска на верхнем слое коллагена. Если базовый слой слишком тонок, сфероиды могут вступать в контакт с дном камеры и скольженияобразуют монослой клеток.
   2. Установите камеру слайд, и 35 мм блюдо культуры ткани , заполненный ультрачистой H ₂ O, в 10 см блюдо культуры ткани в. Инкубируют при 37 ° С до тех пор, пока коллаген полимеризуется, как правило, через 1 час. Хранить оставшиеся нейтрализованы коллагена на льду.
      ПРИМЕЧАНИЕ: водоналивные 35 мм блюдо будет обеспечивать влажность и предотвратить высыхание. Камера слайд должен оставаться в этой камере влажности в течение всего анализа. Коллаген базовый слой может быть оставлен полимеризоваться на ночь. Более длинные инкубирование обычно приводит к более жестким гелем.
   3. С помощью фильтра наконечник p1,000, собирают предварительно сформированные сфероиды (этап 1.4.7) из 96-луночный U-образным дном ячейки гидрофобизирующие пластины в 1,5 мл оснастке верхние трубки. Пипетка медленно и избежать повторных или интенсивное пипеткой, чтобы минимизировать жидкость-стрижку сфероидов. Несколько сфероиды могут быть объединены в одну пробирку для передачи в одну лунку 8-луночного культурального ткани камеры слайд.
   4. Центрифуга собранные сфероидов в таблETOP микроцентрифужных при 2000 мкг в течение 2-5 сек и удалить супернатант с помощью пипетки P200. Избегайте центрифугирование дольше, чем это необходимо, так как это может привести к сфероиды распадаться или слипаются.
      Примечание: После того, как пипеткой от большей части надосадочной жидкости, трубка может быть обращена тщательно над чистым бумажным полотенцем, чтобы фитиль от избытка жидкости. Не позволяйте сфероиды высохнуть.
   5. Используя широкий кончик отверстие P200, аккуратно ресуспендируют сфероидов в 50 мкл нейтрализованного коллагена. Сделайте это для каждой трубки собранных сфероидов перед любыми сфероиды передаются в камеру слайде. Keep сфероидов, которые не были ресуспендировали в нейтрализованного коллагена на льду до готовности к передаче в камеру слайдов.
   6. Удалить камеру слайд из инкубатора и осторожно пипеткой сфероида-коллагеновый смесь поверх базового слоя коллагена. Инкубировать при 37 ° С и 5% CO ₂ , пока коллаген не полимеризуется.
      1. Не обойтись все содержимое пипетки, чтобы избежать образования пузырьков. DropwISE пипетирования снижает вероятность нарушения коллагена базового слоя.
   7. Медленно добавить как минимум 100 мкл подогретого культуральной среды, содержащей желаемые хемоаттрактанты, ингибиторы или другие виды лечения в каждую лунку камеры слайде. Коллаген слой, содержащий сфероиды могут порваться, если жидкость пипеткой на него слишком энергично. Питательная среда может быть медленно распределяли вниз сторону колодца, чтобы избежать нарушения коллагена.
   8. Выдержите в камере слайд при 37 ° С и 5% CO ₂ , чтобы позволить проникновению клеток. Инвазии клеток в окружающую коллагена можно наблюдать с помощью светлопольному или флуоресцентной визуализации и количественно оценивали с помощью различных методов, использующих эпифлуоресцентной, конфокальный или световой микроскопии листа.

3. Количественное Вторжение: Светлое Микроскопия

1. Через определенные интервалы времени, установленного, образ коллагена встраиваемый сфероидов увеличением в 10 раз с помощью микроскопа (светлого шаг 2.2.8).
   ПРИМЕЧАНИЕ:долгосрочные эксперименты живых клеток, стадию нагретый микроскопом и СО ₂ регулируется камера может быть использована для поддержания сфероидов при температуре 37 ° С и 5% СО ₂ в то время как изображения.
2. Количественно инвазивность с помощью программного обеспечения, таких как ImageJ для измерения количества клеток, вторгающихся в окружающую коллагена, а среднее расстояние захвачена в каждый момент времени.

4. Количественное Invasion: флуоресцентной микроскопией с живой Stain Cell

1. После этапа 2.2.8, дополняют среду в камере слайды с флуоресцентным красителем, таких как DAPI, кальцеина AM или других клеток отслеживания соединения, соответствующей линии клеток в соответствии с инструкциями изготовителя.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для количественного определения инвазивности, однородное окрашивание по всему сфероида не является существенным. Для применений, требующих более глубокого проникновения красителя, более длинные инкубацию (> 3 ч) может быть необходимым.
2. Удалите пятна и заменить 500 мкл теплой 1x PBS. Вcubate при 37 ° С в течение 10 мин, чтобы удалить избыток пятно. Повторите минимум в два раза.
3. С помощью флуоресцентного микроскопа, приобретают оптических срезов через вторгшихся сфероидов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Длительное воздействие лазерного света должно быть сведено к минимуму во время повторяющихся изображений, чтобы ограничить фототоксичности и фотообесцвечивания.
4. С помощью программного обеспечения, таких как ImageJ, чтобы сформировать Z-проекцию, которая может быть использована для количественного определения общей площади сфероида, число вторгшихся клеток, а также расстояния захвачена в коллагеновой матрице.
5. В качестве примера, для количественного определения вторжения, регулировать порог изображения, чтобы исключить фон, выделяя только сфероида и вторжения клетки, и измеряют их площадь. Площадь оригинального сфероида можно вычесть из этой суммы для количественного определения инвазивности.

5. Количественное Вторжение: Иммунофлуоресценции

Примечание: Все растворы и буферы должны быть пропущены через фильтр с размером пор 0,45 мкм перед использованием, чтобы удаливе мусора, которые могут негативно повлиять на окрашивание.

1. Готовят PBS ⁺ промывочный буфер. Приготовьте 1х PBS и добавляют CaCl ₂ и MgCl ₂ до конечной концентрации 0,1 мМ. Не автоклава буфер после CaCl ₂ и MgCl ₂ добавляют. Решение может быть стерилизовали с помощью фильтра и хранили при комнатной температуре.
2. Подготовьте нейтральный буферный формалин (НСБ) фиксации буфера. Добавить 5 капель 1 М NaOH до 0,6 г параформальдегида. Довести до 20 мл PBS ⁺ и инкубировать при 60 ° С до тех пор , пока параформальдегид растворяется (примерно 1 час). Охлаждают до комнатной температуры и доведения рН до 7,4 с помощью 1 М HCl.
   Примечание: НСБ фиксации буфера следует готовить непосредственно перед использованием.
3. Готовят бычий сывороточный альбумин (БСА) блокирующего буфера. Растворите БСА в PBS ⁺ 3% вес / об. Решение может быть стерилизовали через фильтр и хранят при температуре 4 ° С в течение нескольких дней, но лучше всего приготовить свежую. Не нагревайте.
4. Подготовка пермеабилизирующего буфера. Развести Triton X-100до 0,2% об / об в PBS ^+.
   Примечание: пермеабилизирующего буфера следует готовить непосредственно перед использованием.
5. Необязательно, подготовить Mowiol монтажную среду. Комбинат 2,4 г Mowiol, 6 г глицерина, и 6 мл сверхчистой H ₂ O. перемешивают в течение 3 ч в ротатор при комнатной температуре. Добавить 12 мл 0,2 М Трис-Cl (рН 8,5). Инкубируют при перемешивании при 50 ° С в течение 10 мин.
   1. Центрифуга при 5000 мкг в течение 15 мин для осаждения нерастворимого материала. Добавить анти-отбеливающим агентом, таким как 2,5% DABCO. Хранить в 500 мкл аликвотах при -20 ° С.
6. Иммунофлуоресценции окрашивание сфероидов (рис 5)
   Примечание: С помощью пипетки медленно добавлять или удалять жидкости из камеры слайде. Избегайте использования аспиратора, так как это может нарушить слой коллагена.
   1. Подготовить сфероидов и встроить в коллагеновых заполненные камеры слайдов, как описано в разделах 1 до 2.
      Примечание: Коллаген аутофлуоресценция может быть сведено к минимуму с помощью тонких слоев или небольших объемов Collagen.
   2. Удалить столько культуральной среды как можно дальше от каждой камеры слайда.
   3. Сполоснуть слой коллагена с помощью 500 мкл PBS ⁺ буфера для промывки , чтобы удалить остатки среды.
   4. Добавить 500 мкл свежей PBS ⁺ промывочного буфера в каждую лунку и инкубировать при температуре 37 ° С в течение 5 мин , чтобы вымыть сфероидов. Повторите дважды.
   5. Заменить PBS ⁺ промывочного буфера с 500 мкл буфера НСБ фиксации. Выдержите при комнатной температуре в течение 20 - 25 мин.
   6. Удалить НСБ фиксации буфера и промойте 500 мкл PBS ⁺ промывочного буфера. Промыть в течение 5 мин со свежим PBS ⁺ промывочного буфера минимум 3 раза.
      Примечание: Фиксированный сфероиды можно хранить при температуре 4 ° С в свежем PBS ⁺ промывочного буфера в течение нескольких дней. 0,01% азида натрия может быть добавлен к промывочным буфером для ингибирования роста микроорганизмов во время хранения.
   7. Заменить PBS ⁺ промывочный буфер 500 мкл буфера пермеабилизации. Инкубируют при комнатной температуре в течение 10-15 мин.
   8. Заменить пермеабилизирующего буфера с 500 мкл блокирующего буфера BSA и инкубируют при комнатной температуре в течение 1 ч.
      1. Необязательно, удалить BSA блокирующий буфер. Используя скальпель или ножницы, акцизные сфероидов и окружающую 3 мм площадь х 3 мм от коллагеновой слоя. Используя широкий кончик отверстие P1000, выбивать вырезанную блок коллагена путем промывки осторожно свежего блокирующего буфера БСА. Перенести коллагеновый блок в 1,5 мл трубки.
      2. Центрифуга при 2000 х г в течение 2 мин и удалить супернатант. Трубка может быть тщательно перевернутой над чистым бумажным полотенцем, чтобы фитиль от избытка жидкости.
   9. Добавьте первичные антитела к сфероидов и инкубировать при комнатной температуре в течение 1 ч. Добавьте достаточный объем первичного антитела таким образом, что весь коллаген слой равномерно погружен в воду. Необязательные действия, описанные выше (5.6.8.1-5.6.8.2), как правило, позволяют использовать меньшие объемы антител.
   10. Погрузитесь камеры слайд в контейнере, по меньшей мере , 10 мл PBS ⁺ промывной BUFфер в течение 10 мин, чтобы вымыть. Повторите минимум в два раза.
       1. Необязательно, если сфероиды вырезали из коллагена слоя ранее (этап 5.6.8.1), добавить минимум 1 мл PBS ⁺ промывочного буфера в 1,5 мл трубки и осторожно перемешивать. Дайте впитаться в течение как минимум 10 мин.
       2. Удалить столько PBS ⁺ промывочный буфер , как можно и повторить промывку PBS ⁺ промывочный буфер как минимум в два раза. Центрифуга при 2000 мкг в течение нескольких минут, чтобы осадить коллагена блок.
          Примечание: Чистые наружные поверхности камеры слайде, протерев 70% -ным этанолом, прежде чем погружаясь в промывочный буфер.
   11. Повторите шаги 5.6.9-5.6.10 с использованием соответствующих вторичных антител.
       Примечание: Если сфероиды окрашивали непосредственно в сосуде формирования изображения, переходите к шагу 5.6.13.
   12. Необязательно, если сфероиды вырезали из коллагена слоя ранее (этап 5.6.8.1), чистые стеклянные слайды и конфокальной микроскопии совместимых с покровные с 70% этанола.
       1. Удалить столько промывочный буфер как можно дальше от блока коллагена и ресуспендируют в сверхчистых H ₂ O. Выполните этот шаг непосредственно перед монтажом. Не оставляйте запятнанные блоки вымачивания в воде.
       2. Использование тонких щипцов с наконечниками, возьмитесь край коллагена блока и передачи на стекло.
       3. С помощью щипцов для удержания коллагена в месте, используйте чистую ватный тампон, чтобы впитывать лишнюю жидкость из коллагена блока, убедившись в том, чтобы не коснуться коллагена напрямую.
          Примечание: Если коллаген застревает к ватным тампоном она может быть аккуратно удалена или с помощью щипцов или окунанием в воде.
   13. Используя обратную технику пипетирования, Распределить 100 мкл Mowiol монтажной среды на блок коллагена и место покровное над образцом.
       1. Используйте ватный тампон или бумажное полотенце, чтобы впитывать лишнюю Mowiol монтажную среду и воду из-под покровное.
       2. Разрешить Mowiol гистологическая среда затвердевать в течение ночи при 4 °C. Уплотнение края покровного с лаком для ногтей.
   14. Изображение окрашивали сфероиды с помощью конфокальной или флуоресцентной микроскопии для наблюдения локализации белков , представляющих интерес, формирование инвазивных структур и т.д. (рис 5B, 5C).
       Примечание: Бейцованное сфероиды должны быть защищены от света, чтобы предотвратить фотообесцвечивания.

6. Анализ Anoikis

Примечание: сфероида протокол формирования легко адаптирован для количественного анкерное-независимый рост и устойчивость к anoikis в различных типах клеток.

1. Посев клеток для anoikis анализа (рисунок 6)
   1. Следуйте инструкциям по сфероида производства в разделе 1.4, но использовать как минимум 30 мг / мл метилцеллюлозы для подготовки сфероид формирования среды.
      Примечание: при нагревании, 30 мг / мл метилцеллюлоза должна производить густой гель, который содержит клетки в суспензии.
   2. Инкубируйте клетки в течение нескольких дней до нескольких недель и вРегулярно ОФЭКТ при 10-кратным увеличением с помощью микроскопа. Клетки, которые сопротивляются anoikis должны размножаться и образовывать колонии.
   3. Количественно anoikis путем измерения количества и размера колоний, образованных в каждую лунку.
      Примечание: После того, как образуются колонии, они могут быть промыты для удаления метилцеллюлоза и использовали для анализов сфероида на основе, как это описано.

Results

Мы опишем гибкий и эффективный метод для генерации дискретных сфероиды с использованием клеток отталкивающие пластин и сфероидами средств массовой формации, дополненные MC. При соответствующих условиях МС и сывороткой, отдельные клетки оседать и сцепленных вместе, в центре скважины, чтобы сформировать сфероиды с минимальным присоединением к нижней части скважины. При использовании этого протокола, сфероиды были получены из различных клеточных линий (Фигура 2В). Титровани...

Discussion

Мы представляем быстрый и гибкий способ получения 3D сфероиды клеток для моделирования архитектуры тканей в естественных условиях с использованием недорогих и широко доступных реагентов. Наш протокол использует не-цитотоксических и адгезионный свойства MC ^{8, 9} , чтобы опосредовать агрегацию клеток и сводят к минимуму образование монослой клеток. В отличие от матриц на основе белков, выделенных из животных источников, МС инертен, не содержит факторы рост...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
<сильно>Буферы
10x Фосфатный буферный раствор	Thermo Fisher Scientific	AM9625
раствор хлорида кальция	Sigma-Aldrich	21114	используется для PBS+ буфера для промывки; Не автоклавируйте PBS+ промывочный буфер при добавлении хлорида кальция
Magnesium Chloride Solution	Sigma-Aldrich	M1028	Используется для PBS+ промывочный буфер; Не следует автоклавировать PBS+ промывать буфер при добавлении хлорида магния
Name	Company	>Каталожный номер	Комментарии
Для образования сфероидов>
96-луночная U-образная ячейкоотталкивающая пластина	Greiner Bio-One	650970
Dulbecco's Modified Eagle's Medium	Sigma-Aldrich	D5546	Для культивирования клеточных линий SH-SY5Y, PANC-1, TPC-1
F12K Medium	Thermo Fisher Scientific	2112722	Для культивирования клеточной линии TT
Фетальная бычья сыворотка	Sigma-Aldrich	F1051	Фильтр перед использованием для удаления твердых загрязнений
Метилцеллюлоза	Sigma-Aldrich	M7027	Приготовьте в воде до 100 мг/мл
Roswell Park Memorial Institute Medium	Sigma-Aldrich	R8758	Для культивирования клеточных линий HCT-116, BxPC-3
TrypLE Express	Thermo Fisher Scientific	12605028	Dissociation buffer
Name	Company	Каталожный номер	Comments
For Invasion Anasay
Bovine Type I Collagen	Corning Incorporated	354231	Stock 3,1 мг/мл; Держите на льду при использовании
DMEM Phenol Red Free Low Glucose	Thermo Fisher Scientific	11054-20	Меньшая фоновая флуоресценция по сравнению с феноловым красным дополненным средним
вещественным нейротрофическим фактором глиальной клеточной линии	Peprotech	450-10	Хемоаттрактант
Name<	>Company	номер в каталоге	Комментарии
Для иммунофлуоресцентной микроскопии
#1.5 Coverglass	Electron Microscopy Sciences	72225-01	Для монтажа удаленных сфероидов
Alexa-Fluor 488 Phalloidin	Thermo Fisher Scientific	A12379	Используется для окрашивания актина в 1:200
Bovine Serum Albumin	Bioshop Canada Incorporated	ALB001	Используется в буфере для блокировки BSA
Dabco 33-LV	Sigma-Aldrich	290734	Antifade
Glycerin	Bioshop Canada Incorporated	GLY001	Используется в монтажном носителе MOWIOL
Программное обеспечение ImageJ	Freeware, NIH-Используется		для анализа изображений
Микрослайды	VWR International	48312-024	Для монтажа вырезанных сфероидов
MOWIOL 4-88	EMD-Millipore	475904	Используется в монтажной среде MOWIOL
Параформальдегид	EMD-Millipore	PX0055-3	Используется в фиксирующем буфере
Triton X-100	Bioshop Canada Incorporated	TRX777	Используется в буфере для пермеабилизации