Эффективный и гибкий метод Cell агрегация для 3D сфероида производства

Summary

Здесь мы описываем быстрый и гибкий протокол для формирования сфероидов 3D-клеток путем агрегации клеток. Он легко адаптируется к нескольким типам клеток и подходит для использования в различных приложениях, включая миграцию клеток, инвазию или анализ анойкиса, а также для визуализации и количественной оценки клеточных матриксных взаимодействий.

Abstract

Однослойная культура клеток не адекватно моделировать поведение в естественных условиях тканей, который включает в себя сложные межклеточные и клетка-матрица взаимодействий. Трехмерные технологии (3D) культивирования клеток являются недавнее нововведение разработано для устранения недостатков культуры прикрепленных клеток. В то время как несколько способов генерации аналогов ткани в пробирке, были разработаны, эти методы часто сложны, дороги , чтобы установить, требуют специализированного оборудования, и , как правило , ограничены совместимостью только с определенными типами клеток. Здесь мы описываем быстрый и гибкий протокол для агрегацию клеток в многоклеточных 3D сфероидов одинакового размера, который совместим с ростом различных опухолевых и нормальных клеточных линий. Мы используем различные концентрации в сыворотке крови и метилцеллюлозы (MC), чтобы способствовать анкерное-независимого сфероид поколения и предотвратить образование монослоев клеток в высоко воспроизводимым образом. Оптимальные условия для Individual клеточные линии могут быть достигнуты путем регулировки MC или сывороточные концентрации в сфероида пластового среде. 3D-сфероиды, сгенерированные могут быть собраны для использования в широком диапазоне применений, в том числе клеточных сигналов или исследований экспрессии генов кандидата скрининга лекарственных средств, или в изучении клеточных процессов, таких как инвазии опухолевых клеток и миграции. Протокол также легко адаптировать для создания клоновых сфероидов из одиночных клеток, и могут быть адаптированы для оценки анкерное-независимый рост и anoikis резистентность. В целом, наш протокол обеспечивает легко изменяемый способ генерирования и использования 3D сфероиды клеток для того , чтобы Повторим 3D микроокружение тканей и смоделировать рост в естественных условиях нормальных и опухолевых клеток.

Introduction

Биологически соответствующая оценка поведения опухолевых клеток является сложной задачей с использованием традиционных двумерных (2D) методологии клеточной культуры, отчасти потому , что они не могут адекватно отразить микросреды клеток нашли в естественных условиях. Альтернативные подходы , включающие компоненты внеклеточного матрикса в культуре (например, Бойденом камерные анализах) являются более физиологически представитель естественных условиях окружающей среды ткани в. Тем не менее, они могут быть ограничены оценкой индивидуального поведения клеток, и не резюмировать комплекса в комбинации прижизненного клет....

Protocol

Примечание: Все реагенты и расходные материалы перечислены в списке материалов.

1. Сфероид производства по Cell Aggregation

1. Метил раствор целлюлозы: Приготовьте 100 мл 100 мг / мл метилцеллюлозы.
   1. Тепло 50 мл сверхчистой Н ₂ О до 80 ° С. Добавить 10 г порошка метилцеллюлозы и перемешивать до тех пор, пока частицы равномерно распределены.
   2. Довести до конечного объема холодной сверхчистого H ₂ O и перемешивают при 4 ° С до тех пор , пока раствор станет прозрачным, палевого цвета, и не содержит видимых твердых частиц.
   3. Проход через фильтр с размером ....

Results

Мы опишем гибкий и эффективный метод для генерации дискретных сфероиды с использованием клеток отталкивающие пластин и сфероидами средств массовой формации, дополненные MC. При соответствующих условиях МС и сывороткой, отдельные клетки оседать и сцепленных вместе, в центре скважины, чтобы сформировать сфероиды с минимальным присоединением к нижней части скважины. При использовании этого протокола, сфероиды были получены из различных клеточных линий (Фигура 2В). Титровани.......

Discussion

Мы представляем быстрый и гибкий способ получения 3D сфероиды клеток для моделирования архитектуры тканей в естественных условиях с использованием недорогих и широко доступных реагентов. Наш протокол использует не-цитотоксических и адгезионный свойства MC ^{8, 9} , чтобы опосредовать агрегацию клеток и сводят к минимуму образование монослой клеток. В отличие от матриц на основе белков, выделенных из животных источников, МС инертен, не содержит факторы рост.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
<сильно>Буферы
10x Фосфатный буферный раствор	Thermo Fisher Scientific	AM9625
раствор хлорида кальция	Sigma-Aldrich	21114	используется для PBS+ буфера для промывки; Не автоклавируйте PBS+ промывочный буфер при добавлении хлорида кальция
Magnesium Chloride Solution	Sigma-Aldrich	M1028	Используется для PBS+ промывочный буфер; Не следует автоклавировать PBS+ промывать буфер при добавлении хлорида магния
Name	Company	>Каталожный номер	Комментарии
Для образования сфероидов>
96-луночная U-образная ячейкоотталкивающая пластина	Greiner Bio-One	650970
Dulbecco's Modified Eagle's Medium	Sigma-Aldrich	D5546	Для культивирования клеточных линий SH-SY5Y, PANC-1, TPC-1
F12K Medium	Thermo Fisher Scientific	2112722	Для культивирования клеточной линии TT
Фетальная бычья сыворотка	Sigma-Aldrich	F1051	Фильтр перед использованием для удаления твердых загрязнений
Метилцеллюлоза	Sigma-Aldrich	M7027	Приготовьте в воде до 100 мг/мл
Roswell Park Memorial Institute Medium	Sigma-Aldrich	R8758	Для культивирования клеточных линий HCT-116, BxPC-3
TrypLE Express	Thermo Fisher Scientific	12605028	Dissociation buffer
Name	Company	Каталожный номер	Comments
For Invasion Anasay
Bovine Type I Collagen	Corning Incorporated	354231	Stock 3,1 мг/мл; Держите на льду при использовании
DMEM Phenol Red Free Low Glucose	Thermo Fisher Scientific	11054-20	Меньшая фоновая флуоресценция по сравнению с феноловым красным дополненным средним
вещественным нейротрофическим фактором глиальной клеточной линии	Peprotech	450-10	Хемоаттрактант
Name<	>Company	номер в каталоге	Комментарии
Для иммунофлуоресцентной микроскопии
#1.5 Coverglass	Electron Microscopy Sciences	72225-01	Для монтажа удаленных сфероидов
Alexa-Fluor 488 Phalloidin	Thermo Fisher Scientific	A12379	Используется для окрашивания актина в 1:200
Bovine Serum Albumin	Bioshop Canada Incorporated	ALB001	Используется в буфере для блокировки BSA
Dabco 33-LV	Sigma-Aldrich	290734	Antifade
Glycerin	Bioshop Canada Incorporated	GLY001	Используется в монтажном носителе MOWIOL
Программное обеспечение ImageJ	Freeware, NIH-Используется		для анализа изображений
Микрослайды	VWR International	48312-024	Для монтажа вырезанных сфероидов
MOWIOL 4-88	EMD-Millipore	475904	Используется в монтажной среде MOWIOL
Параформальдегид	EMD-Millipore	PX0055-3	Используется в фиксирующем буфере
Triton X-100	Bioshop Canada Incorporated	TRX777	Используется в буфере для пермеабилизации