Электропорация нового поколения является эффективным методом трансфекции клеток Th17 человека с малыми РНК для изменения экспрессии генов и поведения клеток.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Малые РНК Трансфекция в первичных человеческих Th17 клеток с помощью следующего поколения электропорации
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
CD4+ Т-клетки могут дифференцироваться в несколько подмножеств эффекторных Т-хелперов в зависимости от окружающей цитокиновой среды. Клетки Th17 могут быть получены из наивных CD4+ Т-клеток in vitro путем их активации в присутствии поляризационных цитокинов IL-1β, IL-6, IL-23 и TGFβ. Клетки Th17 организуют иммунитет против внеклеточных бактерий и грибков, но их аберрантная активность также связана с несколькими аутоиммунными и воспалительными заболеваниями. Клетки Th17 идентифицируются хемокиновым рецептором CCR6 и определяются их мастер-фактором транскрипции, RORγt, и характерным эффекторным цитокином, IL-17A. Оптимизированные условия культивирования для дифференцировки клеток Th17 облегчают механистические исследования биологии Т-клеток человека в контролируемой среде. Они также обеспечивают условия для изучения важности конкретных генов и программ экспрессии генов посредством РНК-интерференции или введения мимиков или ингибиторов микроРНК (микроРНК). Этот протокол обеспечивает простой в использовании, воспроизводимый и высокоэффективный метод транзиторной трансфекции первичных клеток Th17 человека с малыми РНК с использованием устройства электропорации нового поколения.
Введение
CD4 + Т - клетки являются важными оркестраторами адаптивного иммунного ответа. Наивные CD4 + Т - клетки способны превращаться в нескольких различных эффекторных Т - клеток (например , Th1, Th2, Th17 и т.д.), каждый со своим собственным набором характерных цитокинов и факторов транскрипции, в зависимости от местного микроокружения 1. Решения линии преемственности, что Т-клетки составляют критичны как для защитного иммунитета и толерантности к себе. Th17 клетки представляют собой одно подмножество Т - клеток , известных для борьбы с внеклеточных бактерий и грибков, но их неправильные ответы также участвуют в патогенезе множества аутоиммунных и воспалительных заболеваний , таких как рассеянный склероз и псориаз 2, 3. Человеческие клетки Th17 могут быть получены из нативных CD4 + Т - клеток в пробирке путем предоставления им соответствующей поляризационной среды 4. Vario нас комбинации цитокинов IL-1β, IL-23, TGF-beta, и IL-6 были использованы для развития клеток Th17 человека. Человек Th17 клетки экспрессируют CCR6, рецептор хемокинов , который обычно используется , чтобы идентифицировать эту популяцию клеток и определяется выражением их основного фактора транскрипции, RORγt (кодируемого) RORC 5, 6. Th17 клетки обладают способностью выражать несколько цитокинов, но IL-17A является родословная определяющего эффектор цитокин, продуцируемый этими клетками. Мы исследовали экспрессию всех трех Th17-ассоциированных маркеров (CCR6, RORγt, IL-17A) для оценки надежности нашего человеческого Th17 в пробирке дифференциации анализа. Кроме того, мы культивировали человеческие CD4 + Т - клеток в неполяризующих условиях, в которых не добавл ли никакого цитокины или блокирующие антитела к культуральной среде , чтобы использовать в качестве отрицательного контроля , так как экспрессия этих маркеров Th17 должно быть очень низким или отсутствует.
ve_content "> Один из способов изучить нормальное развитие клеток человека T и биологии, чтобы манипулировать экспрессии генов в процессе их развития. Краткосрочные вмешательства РНК (миРНК) представляют собой синтетические небольшие молекулы РНК, которые нацелены на белок-кодирующих мРНК, и могут быть использованы для уменьшения специфической экспрессии гена . MicroRNAs (миРНК) является эндогенным некодирующим малым РНКОМ , известным для модуляции экспрессии гена посттранскрипционно. микроРНК , как было показан , играет важную роль как в мышином и биологии Т - клетки человека, в том числе в Th17 клетках 7, 8, 9. Это очень важно иметь надежные методы манипулирования небольшой РНК-активности в Т-клетках человека, чтобы изучить их влияние на экспрессию генов и в конечном счете на человеческой клеточной биологии T. Здесь мы опишем простой в использовании, последовательный и надежный протокол, который мы разработали для введения небольшой синтетический РНК и запертые нуклеиновые кислоты (МШИТ, химически модифицированные нуклеиновые кислоты с повышенной стабильностью)в клетки иммунной системы, а именно в Th17-клеток человека.Есть несколько альтернативных способов введения малого РНКА в клетки млекопитающих, которые обычно попадают в химические, биологические или физические категории 10. Обычно используемые химические методы, в том числе на основе липидов и трансфекций кальция-фосфатной трансфекции, полагаются на создание комплексов химико-ДНК, которые более эффективно поглощаются клетками. В общем, химические методы не являются столь эффективными для трансфекции первичных Т-клеток. Наиболее распространенный биологический метод является использование вирусного вектора (например , ретровирус или лентивирус), который непосредственно вставляет внешний РНК в хозяин в качестве части своего естественного цикла репликации. Вирусные трансдукции, как правило, занимает больше времени, чтобы закончить, особенно когда факторы во время для молекулярного клонирования провирусных плазмид. Кроме того, вирусные векторы трансдукции могут быть потенциально опасными для человека исследователей. Электропорация является физическим менит индуцировать мембраны пермеабилизации, подвергая клетки воздействия высоких импульсов напряжения, позволяя нуклеиновые кислоты, чтобы транзиторно войти в камеру, где они могут действовать на своей цели. Традиционные электропорации инструменты не являются эффективными для трансфекции первичных лимфоцитов. Тем не менее, оптимизированная для следующего поколения электропорации, оказалось способной трансфекция Т-клеток при очень высокой эффективности, особенно когда материал для трансфекции мал РНК. Термин следующего поколения свободно используется , чтобы различать две новые платформы (например, неоновые, Amaxa) от традиционных электропорации машин. Кроме того, этот метод легко масштабируется для умеренных экранов пропускной способности с до приблизительно 120 малых РНК в одном эксперименте, часто с использованием проверенных синтетических реагентов. Важно отметить, что успешная трансфекция может быть достигнута в качестве всего лишь 16 ч после активации Т-клеток. Недостаток этого способа, однако, является то, что она не приводит к стабильной геномной incorporatiна, и поэтому преходяще. Следовательно, стоит дополнительных усилия, чтобы создать стабильную экспрессирующую конструкцию, которая может быть упакована в вирусный вектор и успешно высказанную в Т-клетках в тех случаях, когда требуется долгосрочное выражение малой РНК.
Мы использовали следующее поколение трансфекции (например, неон) для доставки различных синтетических одно- или двухцепочечных РНК или МШАТ олигонуклеотидных инструментов для различных целей 11, 12, 13. Эффективное РНК-интерференции может быть вызван в первичной мыши и Т-клеток человека с помощью двухцепочечной короткого вмешательства РНК (миРНК). Этот протокол описывает оптимизированные условия для использования этого метода в клетках Th17 человека. В дополнении к киРНКу, коммерчески доступный синтетический микроРНК подражает и ингибиторы могут быть использованы для изучения усиления микроРНКа и потери функции. микроРНК имитирует являются двухцепочечной молекулы РНК, очень похожие на киРНК, но Дизайнд с последовательностью эндогенного зрелого микроРНКа. ингибиторы микроРНК химически модифицированной РНК и / или LNA на основе одноцепочечных олигонуклеотидов, которые связываются с носителями микроРНК и противодействуют их функции. Мы обнаружили, что все эти инструменты могут быть эффективно использованы в культивируемых первичных Т-лимфоцитов, в том числе, но не ограничиваясь клеток Th17 человека.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Этот протокол придерживается принципов UCSF для исследовательской этики человека.
1. Получение Т - клеточная культура, выделение CD4 + Т - клетки, и Th17 поляризации
- На день 0, пальто 6-луночных культуры тканей пластины с 1,5 мл на лунку анти-CD3 человека (2 мкг / мл) и анти-CD28 человека (4 мкг / мл) в PBS с кальцием и магнием в течение по крайней мере 2 ч при 37 ° С.
- В качестве альтернативы, слой пластины в течение ночи при 4 ° С. Оберните пластины в парафине.
- Подготовьте одноядерные клетки пуповинной крови (CBMCs) путем центрифугирования в градиенте плотности в соответствии с инструкциями изготовителя.
ВНИМАНИЕ: Работа тщательно и обеспечить надлежащие средства индивидуальной защиты (СИЗ) носится при обращении с человеческой крови, чтобы избежать любого риска контакта с кровью патогенами. - После того , как мононуклеарные клетки были выделены и промывают, выполняют изоляцию CD4 + Т - клеток человека с помощью отрицательного Селефикция с использованием набора для коммерческого человеческого CD4 + Т - клеток.
Примечание: Если есть красное загрязнение клеток крови после выделения мононуклеарных клеток, необязательные эритроциты лизис может быть выполнен до тех стадий выделения клеток CD4 + T. Ресуспендируют мононуклеарных клеток в 1 мл буфера изоляции (2% FBS в PBS). Добавьте 5 мл лизирующего раствора 1x. Инкубирую в течение 15 мин при комнатной температуре. Затем добавляют 5 мл буфера изоляции и центрифуге при 300 мкг в течение 5 мин при 4 ° С для осаждения клеток.- Ресуспендируют мононуклеарных клеток при плотности 50 × 10 6 в 500 мкл в буфере изоляции в новой 5 мл трубки.
- Добавьте 100 мкл ФБС и 100 мкл антител смеси в пробирке, затем инкубировать каждую пробирку при 4 ° С в течение 20 мин на орбитальном шейкере, чтобы хорошо перемешать.
- После инкубации, добавьте 3-4 мл буфера изоляции, чтобы промыть клетки. Центрифуга клетки при 300 мкг в течение 8 мин при 4 ° С для осаждения клеток. Тщательно аспирата Супаrnatant.
- Во время этого вращения, предварительно моют магнитные шарики. Передача желаемого количества магнитных шариков в новую пробирку (используется при 1: 1 с клетками) и добавляют равный объем буфера изоляции мыть шарики. Хорошо перемешать с помощью 1 мл микропипетки, а затем поместить трубку в магнит, по меньшей мере, 1 мин. Тщательно аспирата супернатант. Ресуспендируют магнитные шарики в том же объеме, первоначально переданного до стирки.
- Ресуспендируют клеток в каждую пробирку с 500 мкл буфера выделения и добавить 500 мкл предварительно промытых магнитных шариков.
- Инкубируйте клетки с магнитными шариками в течение 15 мин на орбитальном шейкере при комнатной температуре (18 ° C до 25 ° C), чтобы хорошо перемешать.
- После инкубации тщательно пипетка клеток с использованием 1 мл микропипеткой, по меньшей мере в 10 раз. Затем добавляют 3-4 мл буфера выделения и поместить каждую трубку в магните в течение 2 мин.
- Тщательно передачи отрицательно отобранных CD4 + Т - клетки , которые находятся всупернатант в новую пробирку.
- После того, как выделение CD4 + Т - клеток завершается, подсчет клеток с помощью гемоцитометра и сохранить клетки на льду.
- Промыть пластины покрытых антителами два раза PBS. Затем добавляют 1,5 мл 2 раза смесь Th17-поляризационной средств массовой информации в каждую лунку: анти-человеческий IFN & gamma; (20 мкг / мл), анти-человеческий ИЛ-4 (20 мкг / мл), TGF-beta человека (10 нг / мл), человек ИЛ-1β (40 нг / мл), человеческий IL-23 (40 нг / мл), человеческий IL-6 (50 нг / мл), все разводили в бессывороточной базовой средах (с добавлением 2 мМ L-глутамина, 100 Ед / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина, 10 мМ HEPES, 1 мМ пирувата натрия и 100 мкМ 2-меркаптоэтанола).
Примечание: Трансфекция и РНК-интерференции делает работу в содержащей сыворотку средах. Цель использования бессывороточной среды с этим протоколом для достижения лучшего производства IL-17A. - Центрифуга человека CD4 + Т - клетки при 500 мкг в течение 5 мин при 4 ° С для осаждения клеток. Тщательно аспирата supernatмуравей. Затем клетки вновь суспендируют в бессывороточной базовых сред и пластины клеток при плотности 3 × 10 6 в 1,5 мл на лунку так, чтобы конечный объем 3 мл на лунку и поляризационные цитокины теперь на 1x конечной концентрации.
- Поместите планшеты в 5% СО 2, 37 ° C инкубатора в течение двух дней.
2. электропорации в пробирке Поляризованные Человеческие клетки Th17
- На 2 -й день, пальто 48-луночных культуры тканей пластины с 250 мкл на лунку анти-CD3 человека (2 мкг / мл) и анти-CD28 человека (4 мкг / мл) в PBS с кальцием и магнием в течение по крайней мере 2 ч при 37 ° С.
- В качестве альтернативы, слой пластины в течение ночи при 4 ° С. Оберните пластины в парафине.
- Приготовьте небольшой РНК для трансфекции. Для каждой трансфекции, аликвота 1 мкл 5 мкМ исходного раствора киРНКа в 1,5 мл микроцентрифужных трубки. Включите соответствующую химию соответствием небольшой РНК CONTRол. Храните все трубы на льду.
- Промыть пластины покрытых антителами два раза PBS. Затем добавляют 500 мкл 1X Th17-поляризационная средств массовой информации в каждую лунку: анти-IFN & gamma; человека (10 мкг / мл), анти-человеческий ИЛ-4 (10 мкг / мл), человеческого TGF-beta (5 нг / мл), человеческого IL- 1β (20 нг / мл), человеческий IL-23 (20 нг / мл), человеческий IL-6 (25 нг / мл), все разводили в бессывороточной базовой средах (с добавлением 2 мМ L-глутамина, 100 ед / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина, 10 мМ HEPES, 1 мМ пирувата натрия и 100 мкМ 2-меркаптоэтанола).
- После того, как культуральные планшеты и трансфекция реагенты получают, ресуспендирование клеток с 1 мл микропипетки, пипеткой осторожно, но обеспечивающие, что все клетки отделяют от дна лунки. Бассейн клеток в коническую пробирку и центрифугируют при 500 х г в течение 5 мин при 4 ° С.
Примечание: Для периодов культуры дольше, чем протокол четырех дней, представленных здесь, клетки должны быть трансфицированы приблизительно каждые 3 дня, используя этот же протокол. Шаг 2.4 должны быть изменены, однако поскольку клетки, обработанные различными малыми РНК не должны быть объединены. Все условия испытывалось должны быть собраны, подсчитывают и трансфицируют отдельно. - Тщательно аспирата супернатант, а затем ресуспендирования клеток, по крайней мере, 1 мл PBS для мытья. Количество живых клеток Th17 (например , с помощью гемоцитометра с использованием трипанового синего для оценки жизнеспособности) , а затем перенести клетки в микроцентрифужной трубку.
- Центрифуга при 500 мкг в течение 5 мин при комнатной температуре для осаждения клеток.
- Тщательно аспирата супернатанта, а затем ресуспендирование клеток с помощью прилагаемого ресуспендирования буфера из мкла набора для трансфекции системы 10 с плотностью 2,5-4 × 10 7 клеток на мл. Держите клетки при комнатной температуре.
Примечание: В качестве ориентира, старайтесь готовить только столько ячеек, сколько может быть трансфицированы в течение 30 мин. Несколько партий можно сравнить. - Добавить 9 мкл клеток в 1 мкл малых РНК в каждом MicroCentrifuge трубки. Пипетка один раз, чтобы смешать клетки и малый РНК для трансфекции затем загрузить в предусмотренном для наконечника пипетки электрода.
Примечание: Как правило, добавляют 9,5 мкл клеточной суспензии, чтобы обеспечить в достаточном количестве смеси для предотвращения образования пузырьков в наконечник пипетки электрода до трансфекции. - Заполните представленную кювету 3 мл при комнатной температуре Электролитических буферов E. Место кюветы внутри пипетки станции, а затем поместить пипетку в положение внутри кюветы.
- Немедленно электропорации 10 мкл каждой смеси клеток и малых РНК с использованием следующих параметров: импульсного напряжения 1,500-1,550 В, длительность импульса 10 мс и 3 импульсов в общей сложности на устройстве трансфекции.
- После того, как электропорация завершена, непосредственно добавьте смесь клеток в 500 мкл 1X Th17-поляризационные среды в подготовленных скважинах культуральной пластины. Место пластины в 5% СО 2, 37 ° C инкубаторе в течение еще двух дней.
Примечание: Промыть кончик пипетки электрода с помощью пипеткивверх и вниз в PBS между каждой трансфекции.
3. Заготовка Человеческие клетки Th17
- Ресуспендируют клетки в культуральной среде с помощью микропипетки, пипетка осторожно, но обеспечение того, чтобы все клетки отделяют от дна лунки. Подготовка клеток для функциональных и / или экспрессии генов анализов.
Примечание: Регулярно, достаточное количество клеток получали из одной скважины трансфицированных клеток Th17, которые будут использоваться для проточной цитометрии анализа поверхностных маркеров и внутриклеточных цитокинов и фактора транскрипции окрашивания или для получения РНК для анализа экспрессии генов.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Первый шаг к разработке надежной системы успешно электропорации клеток Th17 человека было создание надежной в пробирке дифференцированы культур человека Th17 клеток. Т - клетки , культивированные в Th17-поляризационных условиях выразили хемокинов рецептор CCR6 и фактор транскрипции RORγt (Фигура 1А, слева). Эти маркеры не были выражены , когда Т - клетки культивировали в неполяризующих (THN) условиях (Фигура 1А, справа). Т - клетки , культивиров...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Этот протокол обеспечивает улучшенный способ доставки малых РНК в клетки Th17 человека. Хотя клетки Th17 человека здесь были использованы, этот метод электропорации с малым РНКОМ может быть использован с другими хелперами подмножествами первичного человеческим Т, такими как Th1, Th2, и Tregs. Он не работал хорошо для наивных CD4 + Т - клеток , так что клетки должны быть активированы в культуре до трансфекции. Для этого протокола, мы сначала оптимизировали систему экстракорпоральной культуры в
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Эта работа была поддержана грантами Национальных институтов здравоохранения США (R01HL109102, P01HL107202, U19CA179512, F31HL131361), стипендиальной премией Общества лейкемии и лимфомы (K.M.A.) и Программой подготовки медицинских ученых Национального института общих медицинских наук (NIGMS) (грант #T32GM007618) (M.M.).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| античеловеческий IL-17A ПЭ | ebioscience | 12-7179-42 | Клон: eBio64DEC17 |
| античеловеческий IFNg FITC | ebioscience | 11-7319-82 | Клон: 4S. B3 |
| античеловеческий CD4 eVolve605 | ebioscience | 83-0047-42 | Клон: |
| мышиный против человека SK3 CD196 (CCR6) BV421 | BD biosciences | 562515 | Клон: 11A9 |
| античеловеческий RORgt AF647 | BD biosciences | 563620 | Клон: Q21-559 |
| античеловеческий CD45 eFluor450 | ebioscience | 48-9459-42 | Клон: 2D1 |
| Foxp3/окрашивание транскрипционного фактора Буферный набор | ebioscience | 00-5523-00 | Для внутриклеточного фактора транскрипции проточной цитометрии окрашивание |
| Hu FcR Ингибитор связывания Очищенный | ebioscience | 14-9161-71 | |
| ImmunoCult-XF T Cell Expansion Medium | Stemcell Technologies | 10981 | "Бессывороточная базовая среда" |
| MACS CD28 чистый функциональный сорт, человеческий | Miltenyi Biotec | 130-093-375 | Клон: 15E8 |
| античеловеческий CD3 очищенный | ядро моноклонального антитела UCSF | N/A | Клон: OKT-3 |
| LEAF очищенный античеловеческий IL-4 | Biolegend | 500815 | Клон: MP4-25D2 |
| античеловеческий IFNg, функциональный класс очищенный | ebioscience | 16-7318-85 | Клон: NIB42 |
| Рекомбинантный человеческий IL-23 | Peprotech | 200-23 | |
| Рекомбинантный человеческий IL-1&бета; | Пепротех | 200-01B | |
| Рекомбинантный человеческий TGF-β 1 | Пепротех | 100-21C | |
| Рекомбинантный человеческий IL-6 | Peprotech | 200-06 | |
| siGENOME Control Pool, нецелевой #2 | Dharmacon | D-001206-14-05 | |
| siGENOME SMARTpool Human RORC | Dharmacon | M-003442-00 | |
| siGENOME SMARTpool Human PTPRC | Dharmacon | M-008067-01 | |
| Dynabeads Нетронутые Т-клетки человека | Набор ThermoFisher Scientific | 11346D | CD4+ Т-клетки Изоляционный комплект |
| Neon Tranfection System | ThermoFisher Scientific | MPK5000 | Прибор для электропорации нового поколения |
| Neon Tranfection System 10 μ L Kit | ThermoFisher Scientific | MPK1096 | |
| Буфер для ресуспендирования T | ThermoFisher | Scientific Поставляется в наборе (MPK1096) | "Буфер для ресуспендирования трансфекции" |
| Lymphoprep | Stemcell Technologies | #07801 | Градиент плотности Medium |
| costar 6-луночные обработанные планшеты для культуры тканей | Corning | 3516 | пластины с плоским дном |
| costar 48-луночные планшеты с тканевыми культурами | Corning | 3548 | пластины с плоским дном |
| BD Pharm Lyse лизирующий буфер, 10x | BD biosciences | 555899 | Перед использованием необходимо приготовить 1x раствор с дистиллированной водой |
Ссылки
- Zhu, J., Yamane, H., Paul, W. E. Differentiation of Effector CD4 T Cell Populations*. Ann Rev Immunol. 28 (1), 445-489 (2010).
- Korn, T., Bettelli, E., Oukka, M., Kuchroo, V. K. IL-17 and Th17 Cells. Ann Rev Immunol. 27 (1), 485-517 (2009).
- Gaffen, S. L., Jain, R., Garg, A. V., Cua, D. J. The IL-23-IL-17 immune axis: from mechanisms to therapeutic testing. Nature. 14 (9), 585-600 (2014).
- Romagnani, S., Maggi, E., Liotta, F., Cosmi, L., Annunziato, F. Properties and origin of human Th17 cells. Mol Immunol. 47 (1), 3-7 (2009).
- Acosta-Rodriguez, E. V., et al. Surface phenotype and antigenic specificity of human interleukin 17-producing T helper memory cells. Nature Immunol. 8 (6), 639-646 (2007).
- Annunziato, F., et al. Phenotypic and functional features of human Th17 cells. J Exp Med. 204 (8), 1849-1861 (2007).
- Du, C., et al. MicroRNA miR-326 regulates TH-17 differentiation and is associated with the pathogenesis of multiple sclerosis. Nature Immunol. 10 (12), 1252-1259 (2009).
- Escobar, T. M., et al. miR-155 Activates Cytokine Gene Expression in Th17 Cells by Regulating the DNA-Binding Protein Jarid2 to Relieve Polycomb-Mediated Repression. Immunity. 40 (6), 865-879 (2014).
- Wang, H., et al. Negative regulation of Hif1a expression and TH17 differentiation by the hypoxia-regulated microRNA miR-210. Nature Immunol. 15 (4), 393-401 (2014).
- Kim, T. K., Eberwine, J. H. Mammalian cell transfection: the present and the future. Anal bioanal chem. 397 (8), 3173-3178 (2010).
- Steiner, D. F., et al. MicroRNA-29 Regulates T-Box Transcription Factors and Interferon-γ Production in Helper T Cells. Immunity. 35 (2), 169-181 (2011).
- Simpson, L. J., et al. A microRNA upregulated in asthma airway T cells promotes TH2 cytokine production. Nature Immunol. 15 (12), 1162-1170 (2014).
- Pua, H. H., et al. MicroRNAs 24 and 27 Suppress Allergic Inflammation and Target a Network of Regulators of T Helper 2 Cell-Associated Cytokine Production. Immunity. 44 (4), 821-832 (2016).
- Flaherty, S., Reynolds, J. M. Mouse Naïve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets. J Vis Exp. (98), (2015).
- Schumann, K., et al. Generation of knock-in primary human T cells using Cas9 ribonucleoproteins. Proc Natl Acad Sci USA. 112 (33), 10437-10442 (2015).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
