Методическая статья

Рекомбинантная экспрессия белков, кристаллизация и биофизические исследования Bacillus -содержащая нуклеотидная пирофосфорилаза, BcMazG

DOI:

10.3791/55576

⸱

16 мая 2017 г.

 ,  , 
1Division of Biological Science and Technology, Yonsei University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bacillus anthracis является облигатным возбудителем фатальной ингаляционной сибирской язвы, поэтому исследования его генов и белков строго регламентированы. Альтернативный подход - изучение ортологичных генов. Мы описываем биофизико-химические исследования ортолога B. anthracis в B. cereus , bc1531, требующие минимального экспериментального оборудования и не имеющих серьезных проблем с безопасностью.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Чтобы преодолеть ограничения безопасности и правила при изучении генов и белков от истинных патогенов, их гомологи могут быть изучены. Bacillus anthracis является облигатным возбудителем, вызывающим смертельную ингаляционную сибирскую язву. Bacillus cereus считается полезной моделью для изучения B. anthracis из-за ее тесной эволюционной взаимосвязи. Ген кластера ba1554 - ba1558 B. anthracis высококонсервативен с кластером bc1531 - bc1535 у B. cereus , а также с bt1364 - bt1368 кластером в Bacillus thuringiensis, что указывает на критическую роль ассоциированных генов в роде Bacillus . В этой рукописи описаны методы получения и характеристики белкового продукта первого гена ( ba1554 ) из кластера генов B. anthracis с использованием рекомбинантного белка его ортолога в B. cereus , bc1531.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Рекомбинантная экспрессия белка широко используется для преодоления проблем, связанных с природными источниками белка, таких как ограниченное количество белка и вредное загрязнение. Более того, в исследованиях патогенных генов и белков может быть использован альтернативный лабораторный штамм, который не требует дополнительных мер предосторожности. Например, Bacillus cereus является полезной моделью для изучения Bacillus anthracis из-за их тесной эволюционной связи 1 .

B. anthracis является облигатным возбудителем , который вызывает смертельную ингаляционную сибирскую язву у людей и животных и может потенциально использоваться в качестве биологического оружия 2 . Таким образом, лабораторные исследования B. anthracis строго регулируются Центрами США по контролю за заболеваниями, требующими практики биобезопасности 3 (BSL-3), в соответствии с которой лабораторная зона должна быть изолирована с отрицательным давлением в помещении. В отличие от B. anthracis , B. cereus классифицируется как агент BSL-1 и, следовательно, имеет минимальные проблемы безопасности. B. cereus - это оппортунистический патоген, который после заражения вызывает пищевое отравление, которое можно лечить без медицинской помощи. Однако, поскольку B. cereus разделяет многие критические гены с B. anthracis , функции белков B. anthracis могут быть изучены с использованием соответствующих гомологов B. cereus 1 .

Ген кластера ba1554 - ba1558 B. anthracis высококонсервативен с использованием кластера bc1531 - bc1535 B. cereus , а также с bt1364-bt1368 кластером Bacillus thuringiensis , с точки зрения организации и последовательности гена. Кроме того, первые гены ( ba1554 , bc1531 и bt1364 ) соответствующих кластеров абсолютно сохраняются ( т.е. идентичность 100% нуклеотидной последовательности), impliНг критической роли генный продукт в Bacillus видов. Из-за его расположения в этих кластерах генов ba1554 был ошибочно идентифицирован как предполагаемый регулятор транскрипции 3 . Однако анализ аминокислотной последовательности продукта ba1554 показывает, что он относится к семейству MazG, которое обладает нуклеотидной пирофосфогидролазной активностью и не связано с активностью транскрипционных факторов 4 , 5 . Хотя белки, принадлежащие к семейству MazG, разнообразны по отношению к общей последовательности и длине, они имеют общий ~ 100 остаточный домен MazG, характеризующийся мотивом EXXE 12-28 EXXD («X» обозначает любой аминокислотный остаток, а число Указывает количество X остатков).

Домен MazG не всегда непосредственно учитывает определенную каталитическую активность. Член MazG от Escherichia coli (EcMazG) обладает двумя доменами MazG, но наС-концевой домен MazG является ферментативно активным 6 . Более того, субстратная специфичность ферментов MazG варьирует от неспецифических нуклеозидтрифосфатов (для EcMazG) до специфических dCTP / dATP (для интегрина-ассоциированного MazG) и dUTP (для dUTPases) 6 , 7 , 8 , 9 . Таким образом, биофизикохимические анализы белка BA1554 необходимы для подтверждения его активности NTP-азы и для расшифровки его субстратной специфичности.

Здесь мы приводим поэтапный протокол, согласно которому большинство лабораторий без BSL-3 могут следовать, чтобы охарактеризовать белковый продукт гена B.cereus bc1531 , который является ортологом B. anthracis ba1554 на молекулярном уровне. Вкратце, рекомбинантный BC1531 (rBC1531) экспрессировали в E.coli и очищали с использованием метки аффинности. Для рентгеновских кристаллографических экспериментов кристаллыУсловия белка rBC1531 были скринированы и оптимизированы. Для оценки ферментативной активности rBC1531 активность NTPазы контролировали колориметрически, чтобы избежать радиоактивно меченых нуклеотидов, которые традиционно использовались. Наконец, анализ полученных биофизикохимических данных позволил нам определить состояние олигомеризации и каталитические параметры rBC1531, а также получить данные рентгеноструктурного анализа кристалла rBC1531.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Получение и очистка рекомбинантного белка rBC1531

  1. Получение рекомбинантной белковой плазмиды BC1531 (rBC1531)
    1. Готовят геномную ДНК B. cereus 10 .
    2. Амплифицировать ген bc1531 из матрицы геномной ДНК B. cereus путем полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием прямых и обратных праймеров (см. Список материалов) для создания сайтов рестрикционных ферментов Bam HI и Sal I, соответственно 10 .
    3. Дайте продукт ПЦР и модифицированный вектор pET49b (pET49bm), используя Bam HI и Sal I, как описано 11 .
    4. Смешайте переваренный продукт ПЦР и вектор (соотношение 3: 1) с этапа 1.1.3 с использованием ДНК-лигазы Т4 в 10 мкл реакции, как описано 11 . Инкубируйте при температуре 18 ° С в течение 30 мин.
    5. Внесите 3 мкл реакции лигирования в 50 мкл chemicaLly компетентных клеток E.coli DH5α в пробирке. Аккуратно перемешайте пипеткой вверх и вниз и поставьте на лед в течение 30 мин. Тепловой удар в течение 45 с при 42 ° С. Добавить 1 мл среды Luria-Bertani (LB) и выращивать клетки при энергичном встряхивании (250 об / мин, 37 ° С, 45 мин).
    6. Возьмите 100 мкл трансформированных клеток из стадии 1.1.6 и распределите их на чашки с LB-агаром со 100 мкг / мл канамицина (Kan). Инкубируйте в течение ~ 18 ч при 37 ° C.
    7. Выбирают колонии, используя стерильный наконечник, и выращивают клетки в 3 мл среды LB со 100 мкг / мл Kan; Энергично встряхивают (250 об / мин, 37 ° C, 18 часов).
    8. Подготовьте плазмидную ДНК, используя метод лизис-щелочной SDS, как описано 10 .
    9. Подтвердите нуклеотидную последовательность экспрессии rBC1531 с использованием секвенирования ДНК 12 .
  2. Сверхэкспрессия белка rBC1531
    1. Повторно трансформируйте штамм Е. coli BL21 (DE3) с помощью rBC1531-expКак описано в шагах 1.1.5-1.1.6, для сверхэкспрессии.
    2. Выберите колонию и произведите ее в 10 мл среды LB, содержащей 50 мкг / мл Kan (LB + Kan); Энергично встряхивают в течение 18 ч при 37 ° C.
    3. Инокулируют 10 мл культуры в течение ночи в 1 л среды LB + Kan и растут при 37 ° С до тех пор, пока оптическая плотность при 600 нм не достигнет ~ 0,7.
    4. Погрузите культуру в ледяную воду на ~ 15 минут, чтобы охладить температуру до 18 ° C и добавьте к культуральной среде изопропил -D-1-тиогалактопиранозид (IPTG) в конечной концентрации 1 мМ для экспрессии рекомбинантного белка. Выращивайте культуру при температуре 18 ° C в течение дополнительных ~ 16-18 часов.
  3. Очистка rBC1531
    1. Собирают клетки центрифугированием (5000 xg, 4 ° C, 30 минут). Тщательно удаляйте надосадочную жидкость, чтобы не мешать клеткам. Повторно суспендируют клетки в 50 мл раствора фосфатно-буферного солевого раствора (PBS), содержащего 10 мМ имидазола.
    2. Люси клетки дважды обработкой ультразвуком на льду, чтобы предотвратить перегрев клеточных лизатов (время: 2 мин 30 с, цикл на: 5 с, цикл выключен: 10 с, амплитуда: 38%).
    3. Очистите клеточный лизат центрифугированием (~ 25000 × g, 4 ° C, 30 мин).
    4. Смешайте 3 мл никелевых шариков и 60 мл PBS, содержащего 10 мМ имидазола, и процедите через гравитацию дополнительного буфера для осаждения уравновешенных никелевых гранул в колонке для хроматографии на 2,5 х 10 см.
    5. Пипетку переносят супернатант с этапа 1.3.3 на колонку с предварительно уравновешенными никелевыми шариками и инкубируют при 4 ° С в течение 2 ч на прядильном колесе с низкой скоростью (~ 20 об / мин).
    6. Позвольте супернатанту стекать под действием силы тяжести и промывайте никелевые шарики в колонке три раза 100 мл PBS, содержащего 10 мМ имидазола.
    7. Элюируют белок rBC1531, применяя 4 × 5 мл PBS, содержащего 250 мМ имидазола.
    8. Берут 15 мкл элюирования с этапа 1.3.7 и запускают его на 15% SDS-PAGE. Визуализируйте полосы белка наГель с использованием окраски Кумасси синим 10 .
  4. Удаление аффинных меток белка rBC1531 протеолизом тромбина
    1. Пипетируют фракции в диализную пробирку (молекулярная масса отсекают: 3 кДа) и помещают пробирку в стакан, содержащий 4 л совместимого с расщеплением тромбина буфера (20 мМ HEPES, рН 7,4, 150 мМ NaCl и 1,5 мМ β-меркаптоэтанола) При 4 ° С в течение ночи.
    2. Внесите фракции и перенесите их в коническую трубку.
    3. Измерьте поглощение при 280 нм и оцените концентрацию белка rBC1531, как описано 13 .
    4. Принять 50 мкг rBC1531 в 0,5 мл пробирке и добавить различные количества тромбина ( т.е. 2, 1, 0,6 и 0,3 единиц). Инкубируйте rBC1531 и тромбиновые реакции при 20 ° C в течение ~ 3 часов, чтобы определить наименьшее количество тромбина, необходимое для расщепления N-концевой аффинной метки.
    5. Запустите реакции rBC1531 и тромбина на 15%SDS-PAGE и определяют наименьшее количество тромбина ( например, 0,3 единицы тромбина на 50 мкг rBC1531), которое полностью переваривает N-концевую аффинную метку и вырабатывает rBC1531 без метки.
    6. Добавить 10 мг белка rBC1531 и 60 единиц тромбина в 15 мл пробирку и инкубировать при 20 ° С в течение ~ 3 часов для протеолитической реакции тромбина.
    7. Примените стандарты гель-фильтрации к колонке с эксклюзионной хроматографией (SEC), чтобы подготовить стандартную кривую молекулярных масс и объемов элюирования, как описано 13 .
    8. Положите переваренный тромбином белок rBC1531 с этапа 1.4.6 в центрифужную пробирку с фильтром (молекулярная масса отключен: 3 кДа) и центрифугируйте при 3000 g при 4 ° C, чтобы уменьшить до объема менее 5 мл.
    9. Наносят концентрированный белок rBC1531 на колонку SEC и собирают 60 элюированных фракций в 0,5 мл на пробирку 13 .
    10. Взять по 15 мкл каждой фракции, запустить их на 15% SDS-PAGE и стабильноВ геле, использующем окрашивающий раствор Кумасси (0,15% (мас. / Об.), Кумасси блестящий синий, 40% (об. / Об.) Метанол и 10% (об. / Об.) Ледяной уксусной кислоты), как описано 10 .
    11. Пипетируйте фракции, содержащие rBC1531, и соберите их в одну пробирку.

2. Кристаллизация и оптимизация rBC1531

  1. Условия скрининга для кристаллизации белка rBC1531
    1. Сконцентрируйте rBC1531 с этапа 1.4.11 до ~ 18,5 мг / мл с использованием центробежной пробирки фильтра, как описано на этапе 1.4.8.
    2. Добавить 50 мкл каждого раствора для кристаллизационного скрининга (см. Раздел 2.2) 14 в лунки 96-луночных планшетов для кристаллизации в сидячем положении. Поместите 0,5 мкл 18,5 мг / мл раствора белка rBC1531 на сидячую кровать. Смешайте раствор белка с 0,5 мкл раствора в лунках, повторив процесс для всей пластины.
    3. Накройте пластину прозрачной клейкой пленкой.Поместите 96-луночные планшеты при 18 ° C и позвольте диффузии паров.
    4. Сканирование капель при увеличении 20-40 раз с использованием светового микроскопа для ежедневного наблюдения за образованием кристаллов в течение 2-3 недель.
    5. Собрать данные 12 рентгеноструктурного анализа с использованием полученных кристаллов белка rBC1531.
  2. Оптимизация условий кристаллизации rBC1531
    1. Приготовьте 500 мкл выбранного начального раствора для кристаллизации ( например, 0,1 М натрийкакодилата, рН 6,5 и 1,0 М цитрата натрия) и заполните 24-луночную кристаллизационную пластину для сидения.
    2. Добавьте 0,5 мкл 18,5 мг / мл раствора белка rBC1531 в сидячий слой, смешайте с 0,5 мкл раствора в лунке и сразу же покрывайте прозрачную клейкую пленку. Поместите пластину при 18 ° C.
    3. Наблюдайте рост кристаллов под световым микроскопом в течение недели.
    4. Оптимизация различных условий кристаллизации путем изменения рН ( т.е.., PH 5,5-6,8) 0,1 М какодилата и путем изменения концентрации соли ( т.е. 0,9-1,2 М) цитрата натрия для получения особых кристаллов. Наблюдать рост кристаллов в течение ~ 1 недели и собирать данные рентгеноструктурного анализа 12 .

3. Характеристика нуклеозидтрифосфатазы (NTPase) Активность rBC1531

  1. Валидация неорганического фосфат-зависимого колориметрического исследования
    1. Готовят запас пирофосфата (100 мМ) и разбавляют его до конечных концентраций 0,1, 0,25, 0,5, 1,0, 5,0, 10, 50, 100 и 250 мкМ в 200 мкл реакционного буфера (20 мМ HEPES, рН 7,4, 150 ММ NaCl и 2 мМ MgCl 2 ) в дублированных 96-луночных планшетах. Используйте первую пластину в качестве контроля (это не содержит пирофосфатазы). Убедитесь, что вторая пластина содержит пирофосфатазу в качестве рабочей пластины, как указано на этапе 3.1.2.
    2. Добавить 0,01 единицы Saccharomyces cerevisiae неорганической рЙофосфатазы (1 мкл) в лунки рабочей пластины и инкубируют при 20 ° С в течение 30-60 мин.
    3. Приготовление раствора молибдата кислоты путем смешивания растворов молибдата аммония (0,86% об. / Об.) И аскорбиновой кислоты (14 об.%) В соотношении 7: 3. Добавьте 16 мкл раствора кислоты молибдата в рабочую и контрольную лунки и подождите 15 мин.
    4. Считайте оптическую плотность при 690 нм (OD 690 нм).
  2. Колориметрический анализ NTPase
    1. Готовят запас 100 мМ нуклеозидтрифосфатного (NTP) субстрата и разбавляют до желаемой концентрации ( например, 0, 0,2, 4,4, 11, 22, 44, 88 или 132 мкМ) в 180 мкл буфера для анализа (20 мМ HEPES, РН 7,4, 150 мМ NaCl и 2 мМ MgCl 2 ).
    2. Добавьте 20 мкг rBC1531 (1,5 мМ) и субстраты NTP с этапа 3.2.1 до 200 мкл на реакцию в 96-луночном планшете и пипеткой вверх и вниз, чтобы хорошо перемешать. Накройте пластину ее крышкой и поместите ее в инкубатор с температурой 37 ° C в течение 30 минутДля осуществления реакции гидролиза субстрата.
    3. Перенесите планшет на водяную баню с температурой 70 ° C и дайте ему постоять в течение 15 минут, чтобы остановить каталитические реакции, опосредованные rBC1531.
    4. Добавить 0,01 единицы неорганической пирофосфатазы S. cerevisiae (1 мкл) в каждую лунку реакционной планшеты (из стадии 3.2.3) и инкубировать при 20 ° С в течение 30 мин. Добавьте 16 мкл раствора кислоты молибдата в реакционную планшету, чтобы получить цвет (~ 15 мин). Читайте на OD 690 нм .
    5. Проанализируйте, используя уравнение Михаэлиса-Ментен, как описано 12 .

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Характеристика интересующего белка в этом исследовании начиналась с приготовления достаточного количества рекомбинантного белка B. cereus bc1531 (rBC1531), предпочтительно более нескольких миллиграмм. Фрагмент ДНК, кодирующий белок BC1531, был получен с помощью ПЦР с использованием геномной ДНК B. cereus в качестве матрицы, так как он содержит ортологичные гены, идентичные ba1554 . RBC1531 был сверхэкспрессирован как растворимый белок в клетках Е. ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Исследования истинных патогенов ограничены из-за ограничений безопасности и правил. В качестве альтернативы патогены могут быть изучены с использованием эволюционно родственных непатогенных или менее патогенных видов. Ген ba1554 считается критическим геном у B. anthracis. К счастью, идентичный ген присутствует и у неклинического B. cereus. Таким образом, без серьезных опасений по поводу безопасности, рекомбинантный белок BC1531 может быть использован для биофизической и ферментативной характери...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Рентгеновские дифракционные наборы были собраны на пучковой линии 7А Лаборатории ускорителей Пхохан (Корея). Это исследование было поддержано Программой фундаментальных исследований, проводимой Национальным научно-исследовательским фондом Кореи (NRF), финансируемой Министерством науки, ИКТ и перспективного планирования (2015R1A1A01057574 МЗ).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Bacillus cereus ATCC14579Корейская коллекция для культуры тканей3624
Набор для подготовки геномной ДНКGeneAll106-101Препарат геномной ДНК
Форвард праймерМакрогенGAAGGATCCGGAAGCAAAA
CGATGAAAGATATGCA		em>BamHI сайт подчеркнут
Обратный праймерМакрогенCTTGTCGACTTATTCTTTCT
CCCTCATCAATACGTG		em>SalI сайт
подчеркнут nPfu-ForteEnzynomicsP410PCR polymerase
BamHIEnzynomicsR003S
SalIEnzynomicsR009S
pET49b вектор экспрессииNovagen71463Вектор экспрессии был модифицирован для добавления аффинных меток и сайтов BamHI/SalI10
T4 DNA ligazaEnzynomicsM001S
Dialysis memebraneThermofisher18265017
Dry block heaterJSRJSBL-02T
LB бульон (Luria-Bertani)LPS растворLB-05
LB Agar, Miller (Luria-Bertani)Becton, Dickinson and Company
KanamycinLPS solutionKAN025
Mini-prep kitFavorgenFAPDE300Препарат плазмидной ДНК
BL21(DE3) Компетентная клеткаNovagen69450-3CN
Изопропил &бета;-D-1-тиогалактопиранизид (IPTG)Fisher BioReagents50-213-378
Sodium chlorideDaejung7548-4100PBS материал
Хлорид калияDaejung6566-4405PBS материал
PotassiumphosphateBio Basic IncPB0445PBS материал
Sodium phosphateBio Basic IncS0404PBS материал
ImidazoleBio Basic IncIB0277
SonicatorSonics VCX 130
Ni-NTA agarosQiagen30210Никелевый шарик
RotatorFinepcrAG
Precision Plus Protein Dual Color StandardsBio-rad1610374SDS-PAGE стандарт белка
Coonmassie Brilliant Blue R-250Fisher BioReagentsBP101-25Coomassie окрашивающий раствор
Метиловый спиртSamchun chemicalM0585Кумасси раствор для окрашивания
Уксусная кислотаDaejung1002-4105Кумасси раствор для окрашивания
Dialysis memebraneThermofisher68035
2-меркаптоэтанолSigma-aldrichM6250
ТромбинMerckmillipore605157-1KUCNПриготовьте аликвоты по 20 мкм; L (1 Unit per μ L) и хранить при температуре 70 °deg; C и разморозить перед использованием
Superdex 200 16/600General Electric28989335Эксклюзионная хроматография
Гель фильтрация стандартBio-rad151-1901
Центробежный фильтрAmiconUFC800396
Кристаллизационные пластиныHampton researchHR3-08396-луночный сидячий откидной пластина
JCSG core suite I-IVQiagen130924-130927Кристаллизационный секретный раствор
МикроскопNikonSMZ745T
пластины Cryschem PlatesHampton researchHR3-15824-луночная сидячая пластина
Неорганическая пирофосфатазаSigma10108987001
раствор молибдата аммонияSigma13106-76-8
L-аскорбиновая кислотаSigma50-81-7
NTP подложкаStartagene200415-51
СпектрофотометрBiotekSynergyH1микропланшетный ридер
GraphPad Prism 5 GraphPadPrism 5 для окна
<<

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ivanova, N., et al. Genome sequence of Bacillus cereus and comparative analysis with Bacillus anthracis. Nature. 423, 87-91 (2003).
  2. Spencer, R. C. Bacillus anthracis. J Clin Pathol. 56, 182-187 (2003).
  3. Deli, A., et al. LmbE proteins from Bacillus cereus are de-N-acetylases with broad substrate specificity and are highly similar to proteins in Bacillus anthracis. FEBS J. 277, 2740-2753 (2010).
  4. Gross, M., Marianovsky, I., Glaser, G. MazG -- a regulator of programmed cell death in Escherichia coli. Mol Microbiol. 59, 590-601 (2006).
  5. Galperin, M. Y., Moroz, O. V., Wilson, K. S., Murzin, A. G. House cleaning, a part of good housekeeping. Mol Microbiol. 59, 5-19 (2006).
  6. Lee, S., et al. Crystal structure of Escherichia coli MazG, the regulator of nutritional stress response. J Biol Chem. 283, 15232-15240 (2008).
  7. Moroz, O. V., et al. Dimeric dUTPases, HisE, and MazG belong to a new superfamily of all-alpha NTP pyrophosphohydrolases with potential "house-cleaning" functions. J Mol Biol. 347, 243-255 (2005).
  8. Robinson, A., et al. A putative house-cleaning enzyme encoded within an integron array: 1.8 A crystal structure defines a new MazG subtype. Mol Microbiol. 66, 610-621 (2007).
  9. Moroz, O. V., et al. The crystal structure of a complex of Campylobacter jejuni dUTPase with substrate analogue sheds light on the mechanism and suggests the "basic module" for dimeric d(C/U)TPases. J Mol Biol. 342, 1583-1597 (2004).
  10. Green, M., Sambrook, J. Molecular cloning: A laboratory Manual. 1, John Inglis. (2012).
  11. Brown, T. A. Gene cloning an introduction. , Chapman & Hall. (1986).
  12. Kim, M. I., Hong, M. Crystal structure of the Bacillus-conserved MazG protein, a nucleotide pyrophosphohydrolase. Biochem Biophys Res Commun. 472, 237-242 (2016).
  13. Sheehan, D. Physical biochemistry: Principles and applications. , A John Wiley & Sons. (2009).
  14. Lesley, S. A., Wilson, I. A. Protein production and crystallization at the joint center for structural genomics. J Struct Funct Genomics. 6, 71-79 (2005).
  15. Jeon, Y. J., et al. Structural and biochemical characterization of bacterial YpgQ protein reveals a metal-dependent nucleotide pyrophosphohydrolase. J Struct Biol. 195, 113-122 (2016).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Protein CrystallizationEnzymatic KineticsNickel Affinity ChromatographySize Exclusion ChromatographyThrombin DigestionSitting Drop Vapor DiffusionX ray CrystallographySpectrophotometric AnalysisBacillus Cereus

Похожие статьи