Методическая статья

Рекомбинантная экспрессия белков, кристаллизация и биофизические исследования Bacillus -содержащая нуклеотидная пирофосфорилаза, BcMazG

DOI:

10.3791/55576

⸱

16 мая 2017 г.

 ,  , 
1Division of Biological Science and Technology, Yonsei University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bacillus anthracis является облигатным возбудителем фатальной ингаляционной сибирской язвы, поэтому исследования его генов и белков строго регламентированы. Альтернативный подход - изучение ортологичных генов. Мы описываем биофизико-химические исследования ортолога B. anthracis в B. cereus , bc1531, требующие минимального экспериментального оборудования и не имеющих серьезных проблем с безопасностью.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Чтобы преодолеть ограничения безопасности и правила при изучении генов и белков от истинных патогенов, их гомологи могут быть изучены. Bacillus anthracis является облигатным возбудителем, вызывающим смертельную ингаляционную сибирскую язву. Bacillus cereus считается полезной моделью для изучения B. anthracis из-за ее тесной эволюционной взаимосвязи. Ген кластера ba1554 - ba1558 B. anthracis высококонсервативен с кластером bc1531 - bc1535 у B. cereus , а также с bt1364 - bt1368 кластером в Bacillus thuringiensis, что указывает на критическую роль ассоциированных генов в роде Bacillus . В этой рукописи описаны методы получения и характеристики белкового продукта первого гена ( ba1554 ) из кластера генов B. anthracis с использованием рекомбинантного белка его ортолога в B. cereus , bc1531.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Рекомбинантная экспрессия белка широко используется для преодоления проблем, связанных с природными источниками белка, таких как ограниченное количество белка и вредное загрязнение. Более того, в исследованиях патогенных генов и белков может быть использован альтернативный лабораторный штамм, который не требует дополнительных мер предосторожности. Например, Bacillus cereus является полезной моделью для изучения Bacillus anthracis из-за их тесной эволюционной связи 1 .

B. anthracis является облигатным возбудителем , который вызывает смертельную ингаляционную сибирскую язву у людей и животных и может потенциально использоваться в качестве биологического оружия 2 . Таким образом, лабораторные исследования B. anthracis строго регулируются Центрами США по контролю за заболеваниями, требующими практики биобезопасности 3 (BSL-3), в соответствии с которой лабораторная зона должна быть изолирована с отрицательным давлением в помещении. В отличие от B. anthracis , B. cereus классифицируется как агент BSL-1 и, следовательно, имеет минимальные проблемы безопасности. B. cereus - это оппортунистический патоген, который после заражения вызывает пищевое отравление, которое можно лечить без медицинской помощи. Однако, поскольку B. cereus разделяет многие критические гены с B. anthracis , функции белков B. anthracis могут быть изучены с использованием соответствующих гомологов B. cereus 1 .

Ген кластера ba1554 - ba1558 B. anthracis высококонсервативен с использованием кластера bc1531 - bc1535 B. cereus , а также с bt1364-bt1368 кластером Bacillus thuringiensis , с точки зрения организации и последовательности гена. Кроме того, первые гены ( ba1554 , bc1531 и bt1364 ) соответствующих кластеров абсолютно сохраняются ( т.е. идентичность 100% нуклеотидной последовательности), impliНг критической роли генный продукт в Bacillus видов. Из-за его расположения в этих кластерах генов ba1554 был ошибочно идентифицирован как предполагаемый регулятор транскрипции 3 . Однако анализ аминокислотной последовательности продукта ba1554 показывает, что он относится к семейству MazG, которое обладает нуклеотидной пирофосфогидролазной активностью и не связано с активностью транскрипционных факторов 4 , 5 . Хотя белки, принадлежащие к семейству MazG, разнообразны по отношению к общей последовательности и длине, они имеют общий ~ 100 остаточный домен MazG, характеризующийся мотивом EXXE 12-28 EXXD («X» обозначает любой аминокислотный остаток, а число Указывает количество X остатков).

Домен MazG не всегда непосредственно учитывает определенную каталитическую активность. Член MazG от Escherichia coli (EcMazG) обладает двумя доменами MazG, но наС-концевой домен MazG является ферментативно активным 6 . Более того, субстратная специфичность ферментов MazG варьирует от неспецифических нуклеозидтрифосфатов (для EcMazG) до специфических dCTP / dATP (для интегрина-ассоциированного MazG) и dUTP (для dUTPases) 6 , 7 , 8 , 9 . Таким образом, биофизикохимические анализы белка BA1554 необходимы для подтверждения его активности NTP-азы и для расшифровки его субстратной специфичности.

Здесь мы приводим поэтапный протокол, согласно которому большинство лабораторий без BSL-3 могут следовать, чтобы охарактеризовать белковый продукт гена B.cereus bc1531 , который является ортологом B. anthracis ba1554 на молекулярном уровне. Вкратце, рекомбинантный BC1531 (rBC1531) экспрессировали в E.coli и очищали с использованием метки аффинности. Для рентгеновских кристаллографических экспериментов кристаллыУсловия белка rBC1531 были скринированы и оптимизированы. Для оценки ферментативной активности rBC1531 активность NTPазы контролировали колориметрически, чтобы избежать радиоактивно меченых нуклеотидов, которые традиционно использовались. Наконец, анализ полученных биофизикохимических данных позволил нам определить состояние олигомеризации и каталитические параметры rBC1531, а также получить данные рентгеноструктурного анализа кристалла rBC1531.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Получение и очистка рекомбинантного белка rBC1531

  1. Получение рекомбинантной белковой плазмиды BC1531 (rBC1531)
    1. Готовят геномную ДНК B. cereus 10 .
    2. Амплифицировать ген bc1531 из матрицы геномной ДНК B. cereus путем полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием прямых и обратных праймеров (см. Список материалов) для создания сайтов рестрикционных ферментов Bam HI и Sal I, соответственно 10 .
    3. Дайте продукт ПЦР и модифицированный вектор pET49b (pET49bm), используя Bam HI и Sal I, как описано 11 .
    4. Смешайте переваренный продукт ПЦР и вектор (соотношение 3: 1) с этапа 1.1.3 с использованием ДНК-лигазы Т4 в 10 мкл реакции, как описано 11 . Инкубируйте при температуре 18 ° С в течение 30 мин.
    5. Внесите 3 мкл реакции лигирования в 50 мкл chemicaLly компетентных клеток E.coli DH5α в пробирке. Аккуратно перемешайте пипеткой вверх и вниз и поставьте на лед в течение 30 мин. Тепловой удар в течение 45 с при 42 ° С. Добавить 1 мл среды Luria-Bertani (LB) и выращивать клетки при энергичном встряхивании (250 об / мин, 37 ° С, 45 мин).
    6. Возьмите 100 мкл трансформированных клеток из стадии 1.1.6 и распределите их на чашки с LB-агаром со 100 мкг / мл канамицина (Kan). Инкубируйте в течение ~ 18 ч при 37 ° C.
    7. Выбирают колонии, используя стерильный наконечник, и выращивают клетки в 3 мл среды LB со 100 мкг / мл Kan; Энергично встряхивают (250 об / мин, 37 ° C, 18 часов).
    8. Подготовьте плазмидную ДНК, используя метод лизис-щелочной SDS, как описано 10 .
    9. Подтвердите нуклеотидную последовательность экспрессии rBC1531 с использованием секвенирования ДНК 12 .
  2. Сверхэкспрессия белка rBC1531
    1. Повторно трансформируйте штамм Е. coli BL21 (DE3) с помощью rBC1531-expКак описано в шагах 1.1.5-1.1.6, для сверхэкспрессии.
    2. Выберите колонию и произведите ее в 10 мл среды LB, содержащей 50 мкг / мл Kan (LB + Kan); Энергично встряхивают в течение 18 ч при 37 ° C.
    3. Инокулируют 10 мл культуры в течение ночи в 1 л среды LB + Kan и растут при 37 ° С до тех пор, пока оптическая плотность при 600 нм не достигнет ~ 0,7.
    4. Погрузите культуру в ледяную воду на ~ 15 минут, чтобы охладить температуру до 18 ° C и добавьте к культуральной среде изопропил -D-1-тиогалактопиранозид (IPTG) в конечной концентрации 1 мМ для экспрессии рекомбинантного белка. Выращивайте культуру при температуре 18 ° C в течение дополнительных ~ 16-18 часов.
  3. Очистка rBC1531
    1. Собирают клетки центрифугированием (5000 xg, 4 ° C, 30 минут). Тщательно удаляйте надосадочную жидкость, чтобы не мешать клеткам. Повторно суспендируют клетки в 50 мл раствора фосфатно-буферного солевого раствора (PBS), содержащего 10 мМ имидазола.
    2. Люси клетки дважды обработкой ультразвуком на льду, чтобы предотвратить перегрев клеточных лизатов (время: 2 мин 30 с, цикл на: 5 с, цикл выключен: 10 с, амплитуда: 38%).
    3. Очистите клеточный лизат центрифугированием (~ 25000 × g, 4 ° C, 30 мин).
    4. Смешайте 3 мл никелевых шариков и 60 мл PBS, содержащего 10 мМ имидазола, и процедите через гравитацию дополнительного буфера для осаждения уравновешенных никелевых гранул в колонке для хроматографии на 2,5 х 10 см.
    5. Пипетку переносят супернатант с этапа 1.3.3 на колонку с предварительно уравновешенными никелевыми шариками и инкубируют при 4 ° С в течение 2 ч на прядильном колесе с низкой скоростью (~ 20 об / мин).
    6. Позвольте супернатанту стекать под действием силы тяжести и промывайте никелевые шарики в колонке три раза 100 мл PBS, содержащего 10 мМ имидазола.
    7. Элюируют белок rBC1531, применяя 4 × 5 мл PBS, содержащего 250 мМ имидазола.
    8. Берут 15 мкл элюирования с этапа 1.3.7 и запускают его на 15% SDS-PAGE. Визуализируйте полосы белка наГель с использованием окраски Кумасси синим 10 .
  4. Удаление аффинных меток белка rBC1531 протеолизом тромбина
    1. Пипетируют фракции в диализную пробирку (молекулярная масса отсекают: 3 кДа) и помещают пробирку в стакан, содержащий 4 л совместимого с расщеплением тромбина буфера (20 мМ HEPES, рН 7,4, 150 мМ NaCl и 1,5 мМ β-меркаптоэтанола) При 4 ° С в течение ночи.
    2. Внесите фракции и перенесите их в коническую трубку.
    3. Измерьте поглощение при 280 нм и оцените концентрацию белка rBC1531, как описано 13 .
    4. Принять 50 мкг rBC1531 в 0,5 мл пробирке и добавить различные количества тромбина ( т.е. 2, 1, 0,6 и 0,3 единиц). Инкубируйте rBC1531 и тромбиновые реакции при 20 ° C в течение ~ 3 часов, чтобы определить наименьшее количество тромбина, необходимое для расщепления N-концевой аффинной метки.
    5. Запустите реакции rBC1531 и тромбина на 15%SDS-PAGE и определяют наименьшее количество тромбина ( например, 0,3 единицы тромбина на 50 мкг rBC1531), которое полностью переваривает N-концевую аффинную метку и вырабатывает rBC1531 без метки.
    6. Добавить 10 мг белка rBC1531 и 60 единиц тромбина в 15 мл пробирку и инкубировать при 20 ° С в течение ~ 3 часов для протеолитической реакции тромбина.
    7. Примените стандарты гель-фильтрации к колонке с эксклюзионной хроматографией (SEC), чтобы подготовить стандартную кривую молекулярных масс и объемов элюирования, как описано 13 .
    8. Положите переваренный тромбином белок rBC1531 с этапа 1.4.6 в центрифужную пробирку с фильтром (молекулярная масса отключен: 3 кДа) и центрифугируйте при 3000 g при 4 ° C, чтобы уменьшить до объема менее 5 мл.
    9. Наносят концентрированный белок rBC1531 на колонку SEC и собирают 60 элюированных фракций в 0,5 мл на пробирку 13 .
    10. Взять по 15 мкл каждой фракции, запустить их на 15% SDS-PAGE и стабильноВ геле, использующем окрашивающий раствор Кумасси (0,15% (мас. / Об.), Кумасси блестящий синий, 40% (об. / Об.) Метанол и 10% (об. / Об.) Ледяной уксусной кислоты), как описано 10 .
    11. Пипетируйте фракции, содержащие rBC1531, и соберите их в одну пробирку.

2. Кристаллизация и оптимизация rBC1531

  1. Условия скрининга для кристаллизации белка rBC1531
    1. Сконцентрируйте rBC1531 с этапа 1.4.11 до ~ 18,5 мг / мл с использованием центробежной пробирки фильтра, как описано на этапе 1.4.8.
    2. Добавить 50 мкл каждого раствора для кристаллизационного скрининга (см. Раздел 2.2) 14 в лунки 96-луночных планшетов для кристаллизации в сидячем положении. Поместите 0,5 мкл 18,5 мг / мл раствора белка rBC1531 на сидячую кровать. Смешайте раствор белка с 0,5 мкл раствора в лунках, повторив процесс для всей пластины.
    3. Накройте пластину прозрачной клейкой пленкой.Поместите 96-луночные планшеты при 18 ° C и позвольте диффузии паров.
    4. Сканирование капель при увеличении 20-40 раз с использованием светового микроскопа для ежедневного наблюдения за образованием кристаллов в течение 2-3 недель.
    5. Собрать данные 12 рентгеноструктурного анализа с использованием полученных кристаллов белка rBC1531.
  2. Оптимизация условий кристаллизации rBC1531
    1. Приготовьте 500 мкл выбранного начального раствора для кристаллизации ( например, 0,1 М натрийкакодилата, рН 6,5 и 1,0 М цитрата натрия) и заполните 24-луночную кристаллизационную пластину для сидения.
    2. Добавьте 0,5 мкл 18,5 мг / мл раствора белка rBC1531 в сидячий слой, смешайте с 0,5 мкл раствора в лунке и сразу же покрывайте прозрачную клейкую пленку. Поместите пластину при 18 ° C.
    3. Наблюдайте рост кристаллов под световым микроскопом в течение недели.
    4. Оптимизация различных условий кристаллизации путем изменения рН ( т.е.., PH 5,5-6,8) 0,1 М какодилата и путем изменения концентрации соли ( т.е. 0,9-1,2 М) цитрата натрия для получения особых кристаллов. Наблюдать рост кристаллов в течение ~ 1 недели и собирать данные рентгеноструктурного анализа 12 .

3. Характеристика нуклеозидтрифосфатазы (NTPase) Активность rBC1531

  1. Валидация неорганического фосфат-зависимого колориметрического исследования
    1. Готовят запас пирофосфата (100 мМ) и разбавляют его до конечных концентраций 0,1, 0,25, 0,5, 1,0, 5,0, 10, 50, 100 и 250 мкМ в 200 мкл реакционного буфера (20 мМ HEPES, рН 7,4, 150 ММ NaCl и 2 мМ MgCl 2 ) в дублированных 96-луночных планшетах. Используйте первую пластину в качестве контроля (это не содержит пирофосфатазы). Убедитесь, что вторая пластина содержит пирофосфатазу в качестве рабочей пластины, как указано на этапе 3.1.2.
    2. Добавить 0,01 единицы Saccharomyces cerevisiae неорганической рЙофосфатазы (1 мкл) в лунки рабочей пластины и инкубируют при 20 ° С в течение 30-60 мин.
    3. Приготовление раствора молибдата кислоты путем смешивания растворов молибдата аммония (0,86% об. / Об.) И аскорбиновой кислоты (14 об.%) В соотношении 7: 3. Добавьте 16 мкл раствора кислоты молибдата в рабочую и контрольную лунки и подождите 15 мин.
    4. Считайте оптическую плотность при 690 нм (OD 690 нм).
  2. Колориметрический анализ NTPase
    1. Готовят запас 100 мМ нуклеозидтрифосфатного (NTP) субстрата и разбавляют до желаемой концентрации ( например, 0, 0,2, 4,4, 11, 22, 44, 88 или 132 мкМ) в 180 мкл буфера для анализа (20 мМ HEPES, РН 7,4, 150 мМ NaCl и 2 мМ MgCl 2 ).
    2. Добавьте 20 мкг rBC1531 (1,5 мМ) и субстраты NTP с этапа 3.2.1 до 200 мкл на реакцию в 96-луночном планшете и пипеткой вверх и вниз, чтобы хорошо перемешать. Накройте пластину ее крышкой и поместите ее в инкубатор с температурой 37 ° C в течение 30 минутДля осуществления реакции гидролиза субстрата.
    3. Перенесите планшет на водяную баню с температурой 70 ° C и дайте ему постоять в течение 15 минут, чтобы остановить каталитические реакции, опосредованные rBC1531.
    4. Добавить 0,01 единицы неорганической пирофосфатазы S. cerevisiae (1 мкл) в каждую лунку реакционной планшеты (из стадии 3.2.3) и инкубировать при 20 ° С в течение 30 мин. Добавьте 16 мкл раствора кислоты молибдата в реакционную планшету, чтобы получить цвет (~ 15 мин). Читайте на OD 690 нм .
    5. Проанализируйте, используя уравнение Михаэлиса-Ментен, как описано 12 .

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Характеристика интересующего белка в этом исследовании начиналась с приготовления достаточного количества рекомбинантного белка B. cereus bc1531 (rBC1531), предпочтительно более нескольких миллиграмм. Фрагмент ДНК, кодирующий белок BC1531, был получен с помощью ПЦР с использованием геномной ДНК B. cereus в качестве матрицы, так как он содержит ортологичные гены, идентичные ba1554 . RBC1531 был сверхэкспрессирован как растворимый белок в клетках Е. ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Исследования истинных патогенов ограничены из-за ограничений безопасности и правил. В качестве альтернативы патогены могут быть изучены с использованием эволюционно родственных непатогенных или менее патогенных видов. Ген ba1554 считается критическим геном у B. anthracis. К счастью, идентичный ген присутствует и у неклинического B. cereus. Таким образом, без серьезных опасений по поводу безопасности, рекомбинантный белок BC1531 может быть использован для биофизической и ферментативной характери...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Рентгеновские дифракционные наборы были собраны на пучковой линии 7А Лаборатории ускорителей Пхохан (Корея). Это исследование было поддержано Программой фундаментальных исследований, проводимой Национальным научно-исследовательским фондом Кореи (NRF), финансируемой Министерством науки, ИКТ и перспективного планирования (2015R1A1A01057574 МЗ).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Bacillus cereus ATCC14579Корейская коллекция для культуры тканей3624
Набор для подготовки геномной ДНКGeneAll106-101Препарат геномной ДНК
Форвард праймерМакрогенGAAGGATCCGGAAGCAAAA
CGATGAAAGATATGCA		em>BamHI сайт подчеркнут
Обратный праймерМакрогенCTTGTCGACTTATTCTTTCT
CCCTCATCAATACGTG		em>SalI сайт
подчеркнут nPfu-ForteEnzynomicsP410PCR polymerase
BamHIEnzynomicsR003S
SalIEnzynomicsR009S
pET49b вектор экспрессииNovagen71463Вектор экспрессии был модифицирован для добавления аффинных меток и сайтов BamHI/SalI10
T4 DNA ligazaEnzynomicsM001S
Dialysis memebraneThermofisher18265017
Dry block heaterJSRJSBL-02T
LB бульон (Luria-Bertani)LPS растворLB-05
LB Agar, Miller (Luria-Bertani)Becton, Dickinson and Company
KanamycinLPS solutionKAN025
Mini-prep kitFavorgenFAPDE300Препарат плазмидной ДНК
BL21(DE3) Компетентная клеткаNovagen69450-3CN
Изопропил &бета;-D-1-тиогалактопиранизид (IPTG)Fisher BioReagents50-213-378
Sodium chlorideDaejung7548-4100PBS материал
Хлорид калияDaejung6566-4405PBS материал
PotassiumphosphateBio Basic IncPB0445PBS материал
Sodium phosphateBio Basic IncS0404PBS материал
ImidazoleBio Basic IncIB0277
SonicatorSonics VCX 130
Ni-NTA agarosQiagen30210Никелевый шарик
RotatorFinepcrAG
Precision Plus Protein Dual Color StandardsBio-rad1610374SDS-PAGE стандарт белка
Coonmassie Brilliant Blue R-250Fisher BioReagentsBP101-25Coomassie окрашивающий раствор
Метиловый спиртSamchun chemicalM0585Кумасси раствор для окрашивания
Уксусная кислотаDaejung1002-4105Кумасси раствор для окрашивания
Dialysis memebraneThermofisher68035
2-меркаптоэтанолSigma-aldrichM6250
ТромбинMerckmillipore605157-1KUCNПриготовьте аликвоты по 20 мкм; L (1 Unit per μ L) и хранить при температуре 70 °deg; C и разморозить перед использованием
Superdex 200 16/600General Electric28989335Эксклюзионная хроматография
Гель фильтрация стандартBio-rad151-1901
Центробежный фильтрAmiconUFC800396
Кристаллизационные пластиныHampton researchHR3-08396-луночный сидячий откидной пластина
JCSG core suite I-IVQiagen130924-130927Кристаллизационный секретный раствор
МикроскопNikonSMZ745T
пластины Cryschem PlatesHampton researchHR3-15824-луночная сидячая пластина
Неорганическая пирофосфатазаSigma10108987001
раствор молибдата аммонияSigma13106-76-8
L-аскорбиновая кислотаSigma50-81-7
NTP подложкаStartagene200415-51
СпектрофотометрBiotekSynergyH1микропланшетный ридер
GraphPad Prism 5 GraphPadPrism 5 для окна
<<

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ivanova, N., et al. Genome sequence of Bacillus cereus and comparative analysis with Bacillus anthracis. Nature. 423, 87-91 (2003).
  2. Spencer, R. C. Bacillus anthracis. J Clin Pathol. 56, 182-187 (2003).
  3. Deli, A., et al. LmbE proteins from Bacillus cereus are de-N-acetylases with broad substrate specificity and are highly similar to proteins in Bacillus anthracis. FEBS J. 277, 2740-2753 (2010).
  4. Gross, M., Marianovsky, I., Glaser, G. MazG -- a regulator of programmed cell death in Escherichia coli. Mol Microbiol. 59, 590-601 (2006).
  5. Galperin, M. Y., Moroz, O. V., Wilson, K. S., Murzin, A. G. House cleaning, a part of good housekeeping. Mol Microbiol. 59, 5-19 (2006).
  6. Lee, S., et al. Crystal structure of Escherichia coli MazG, the regulator of nutritional stress response. J Biol Chem. 283, 15232-15240 (2008).
  7. Moroz, O. V., et al. Dimeric dUTPases, HisE, and MazG belong to a new superfamily of all-alpha NTP pyrophosphohydrolases with potential "house-cleaning" functions. J Mol Biol. 347, 243-255 (2005).
  8. Robinson, A., et al. A putative house-cleaning enzyme encoded within an integron array: 1.8 A crystal structure defines a new MazG subtype. Mol Microbiol. 66, 610-621 (2007).
  9. Moroz, O. V., et al. The crystal structure of a complex of Campylobacter jejuni dUTPase with substrate analogue sheds light on the mechanism and suggests the "basic module" for dimeric d(C/U)TPases. J Mol Biol. 342, 1583-1597 (2004).
  10. Green, M., Sambrook, J. Molecular cloning: A laboratory Manual. 1, John Inglis. (2012).
  11. Brown, T. A. Gene cloning an introduction. , Chapman & Hall. (1986).
  12. Kim, M. I., Hong, M. Crystal structure of the Bacillus-conserved MazG protein, a nucleotide pyrophosphohydrolase. Biochem Biophys Res Commun. 472, 237-242 (2016).
  13. Sheehan, D. Physical biochemistry: Principles and applications. , A John Wiley & Sons. (2009).
  14. Lesley, S. A., Wilson, I. A. Protein production and crystallization at the joint center for structural genomics. J Struct Funct Genomics. 6, 71-79 (2005).
  15. Jeon, Y. J., et al. Structural and biochemical characterization of bacterial YpgQ protein reveals a metal-dependent nucleotide pyrophosphohydrolase. J Struct Biol. 195, 113-122 (2016).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Bacillus cereus

Похожие статьи