Bacillus anthracis является облигатным возбудителем фатальной ингаляционной сибирской язвы, поэтому исследования его генов и белков строго регламентированы. Альтернативный подход - изучение ортологичных генов. Мы описываем биофизико-химические исследования ортолога B. anthracis в B. cereus , bc1531, требующие минимального экспериментального оборудования и не имеющих серьезных проблем с безопасностью.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Рекомбинантная экспрессия белков, кристаллизация и биофизические исследования
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Чтобы преодолеть ограничения безопасности и правила при изучении генов и белков от истинных патогенов, их гомологи могут быть изучены. Bacillus anthracis является облигатным возбудителем, вызывающим смертельную ингаляционную сибирскую язву. Bacillus cereus считается полезной моделью для изучения B. anthracis из-за ее тесной эволюционной взаимосвязи. Ген кластера ba1554 - ba1558 B. anthracis высококонсервативен с кластером bc1531 - bc1535 у B. cereus , а также с bt1364 - bt1368 кластером в Bacillus thuringiensis, что указывает на критическую роль ассоциированных генов в роде Bacillus . В этой рукописи описаны методы получения и характеристики белкового продукта первого гена ( ba1554 ) из кластера генов B. anthracis с использованием рекомбинантного белка его ортолога в B. cereus , bc1531.
Введение
Рекомбинантная экспрессия белка широко используется для преодоления проблем, связанных с природными источниками белка, таких как ограниченное количество белка и вредное загрязнение. Более того, в исследованиях патогенных генов и белков может быть использован альтернативный лабораторный штамм, который не требует дополнительных мер предосторожности. Например, Bacillus cereus является полезной моделью для изучения Bacillus anthracis из-за их тесной эволюционной связи 1 .
B. anthracis является облигатным возбудителем , который вызывает смертельную ингаляционную сибирскую язву у людей....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
1. Получение и очистка рекомбинантного белка rBC1531
- Получение рекомбинантной белковой плазмиды BC1531 (rBC1531)
- Готовят геномную ДНК B. cereus 10 .
- Амплифицировать ген bc1531 из матрицы геномной ДНК B. cereus путем полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием прямых и обратных праймеров (см. Список материалов) для создания сайтов рестрикционных ферментов Bam HI и Sal I, соответственно 10 .
- Дайте продукт ПЦР и модифицированный вектор pET49b (pET49bm), используя Bam HI и Sal I, как описан....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Характеристика интересующего белка в этом исследовании начиналась с приготовления достаточного количества рекомбинантного белка B. cereus bc1531 (rBC1531), предпочтительно более нескольких миллиграмм. Фрагмент ДНК, кодирующий белок BC1531, был получен с помощью ПЦР с использованием геномной ДНК B. cereus в качестве матрицы, так как он содержит ортологичные гены, идентичные ba1554 . RBC1531 был сверхэкспрессирован как растворимый белок в клетках Е. .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Исследования истинных патогенов ограничены из-за ограничений безопасности и правил. В качестве альтернативы патогены могут быть изучены с использованием эволюционно родственных непатогенных или менее патогенных видов. Ген ba1554 считается критическим геном у B. anthracis. К счастью, идентичный ген присутствует и у неклинического B. cereus. Таким образом, без серьезных опасений по поводу безопасности, рекомбинантный белок BC1531 может быть использован для биофизической и ферментативной характери.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Рентгеновские дифракционные наборы были собраны на пучковой линии 7А Лаборатории ускорителей Пхохан (Корея). Это исследование было поддержано Программой фундаментальных исследований, проводимой Национальным научно-исследовательским фондом Кореи (NRF), финансируемой Министерством науки, ИКТ и перспективного планирования (2015R1A1A01057574 МЗ).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Bacillus cereus ATCC14579 | Корейская коллекция для культуры тканей | 3624 | |
| Набор для подготовки геномной ДНК | GeneAll | 106-101 | Препарат геномной ДНК |
| Форвард праймер | Макроген | GAAGGATCCGGAAGCAAAA CGATGAAAGATATGCA | em>BamHI сайт подчеркнут |
| Обратный праймер | Макроген | CTTGTCGACTTATTCTTTCT CCCTCATCAATACGTG | em>SalI сайт |
| подчеркнут nPfu-Forte | Enzynomics | P410 | PCR polymerase |
| BamHI | Enzynomics | R003S | |
| SalI | Enzynomics | R009S | |
| pET49b вектор экспрессии | Novagen | 71463 | Вектор экспрессии был модифицирован для добавления аффинных меток и сайтов BamHI/SalI10 |
| T4 DNA ligaza | Enzynomics | M001S | |
| Dialysis memebrane | Thermofisher | 18265017 | |
| Dry block heater | JSR | JSBL-02T | |
| LB бульон (Luria-Bertani) | LPS раствор | LB-05 | |
| LB Agar, Miller (Luria-Bertani) | Becton, Dickinson and Company | ||
| Kanamycin | LPS solution | KAN025 | |
| Mini-prep kit | Favorgen | FAPDE300 | Препарат плазмидной ДНК |
| BL21(DE3) Компетентная клетка | Novagen | 69450-3CN | |
| Изопропил &бета;-D-1-тиогалактопиранизид (IPTG) | Fisher BioReagents | 50-213-378 | |
| Sodium chloride | Daejung | 7548-4100 | PBS материал |
| Хлорид калия | Daejung | 6566-4405 | PBS материал |
| Potassiumphosphate | Bio Basic Inc | PB0445 | PBS материал |
| Sodium phosphate | Bio Basic Inc | S0404 | PBS материал |
| Imidazole | Bio Basic Inc | IB0277 | |
| Sonicator | Sonics VCX 130 | ||
| Ni-NTA agaros | Qiagen | 30210 | Никелевый шарик |
| Rotator | Finepcr | AG | |
| Precision Plus Protein Dual Color Standards | Bio-rad | 1610374 | SDS-PAGE стандарт белка |
| Coonmassie Brilliant Blue R-250 | Fisher BioReagents | BP101-25 | Coomassie окрашивающий раствор |
| Метиловый спирт | Samchun chemical | M0585 | Кумасси раствор для окрашивания |
| Уксусная кислота | Daejung | 1002-4105 | Кумасси раствор для окрашивания |
| Dialysis memebrane | Thermofisher | 68035 | |
| 2-меркаптоэтанол | Sigma-aldrich | M6250 | |
| Тромбин | Merckmillipore | 605157-1KUCN | Приготовьте аликвоты по 20 мкм; L (1 Unit per μ L) и хранить при температуре 70 °deg; C и разморозить перед использованием |
| Superdex 200 16/600 | General Electric | 28989335 | Эксклюзионная хроматография |
| Гель фильтрация стандарт | Bio-rad | 151-1901 | |
| Центробежный фильтр | Amicon | UFC800396 | |
| Кристаллизационные пластины | Hampton research | HR3-083 | 96-луночный сидячий откидной пластина |
| JCSG core suite I-IV | Qiagen | 130924-130927 | Кристаллизационный секретный раствор |
| Микроскоп | Nikon | SMZ745T | |
| пластины Cryschem Plates | Hampton research | HR3-158 | 24-луночная сидячая пластина |
| Неорганическая пирофосфатаза | Sigma | 10108987001 | |
| раствор молибдата аммония | Sigma | 13106-76-8 | |
| L-аскорбиновая кислота | Sigma | 50-81-7 | |
| NTP подложка | Startagene | 200415-51 | |
| Спектрофотометр | Biotek | SynergyH1 | микропланшетный ридер |
| GraphPad Prism 5 GraphPad | Prism 5 для окна |
Ссылки
- Ivanova, N., et al. Genome sequence of Bacillus cereus and comparative analysis with Bacillus anthracis. Nature. 423, 87-91 (2003).
- Spencer, R. C. Bacillus anthracis. J Clin Pathol. 56, 182-187 (2003).
- Deli, A., et al.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
