Оценка процедуры выполнения пробуждения цистометрии в мышиной модели

Summary

В этом исследовании описываются хирургические процедуры и экспериментальные методы для проведения активной цистометрии у свободно движущейся мыши. Кроме того, он предоставляет экспериментальные данные, подтверждающие его оптимизацию и стандартизацию.

Abstract

Цистометрия с активным заполнением была использована в течение длительного времени для оценки функции мочевого пузыря у свободно перемещающихся мышей, однако конкретные методы, используемые в разных лабораториях, различаются. Цель этого исследования состояла в том, чтобы описать микрохирургическую процедуру, используемую для имплантации внутрипузырной трубки, и экспериментальную методику для регистрации давления мочевого пузыря в бодрствующей свободно движущейся мыши. Кроме того, экспериментальные данные представлены, чтобы показать, как хирургия, а также тип и размер трубки влияют на функцию нижних мочевых путей и чувствительность к записи. Влияние диаметра трубы на запись давления оценивали как в полиэтиленовых, так и в полиуретановых трубах с различными внутренними диаметрами. Впоследствии лучшая пробирка из обоих материалов была хирургически имплантирована в купол мочевого пузыря самцов мышей C57BL / 6. Частота двенадцатичасовой ночной мочеиспускания регистрировалась у здоровых, интактных животных и животных через 2, 3, 5 и 7 дней после операции. При уборке, пузыри wОценивались по признакам набухания с использованием валового наблюдения и впоследствии обрабатывались для патологического анализа. Наибольшая набухаемость мочевого пузыря наблюдалась на 2-й и 3-й день, что коррелировало с данными по поведенческому мочеиспусканию, показывающими значительную нарушения функции мочевого пузыря. К 5 дню гистология мочевого пузыря и частота мочеиспускания нормализовались. Основываясь на литературе и доказательствах, полученных в наших исследованиях, мы предлагаем следующие шаги для регистрации in vivo внутрипузырного давления и объема мочеиспускания у бодрствующей мыши: 1) выполнить операцию с использованием операционного микроскопа и микрохирургических инструментов; 2) использовать полиэтилен-10 Чтобы уменьшить артефакты движения, и 3) выполнить цистометрию на 5-й день после операции, когда разбухание пузыря разрешится.

Introduction

Заполнение цистометрии (ФК) является диагностическим методом, который включает в себя размещение катетера в мочевом пузыре для регистрации давления во время медленной наполнения мочевого пузыря. Впервые введенный в 1927 году в качестве клинического диагностического метода для оценки функции нижних мочевых путей, он по-прежнему широко используется. ¹ В исследованиях применение ФК может быть использовано для проверки функции мочевого пузыря у здоровых и больных животных моделей и для изучения эффектов фармакологических агентов. Грызунные животные модели обычно используются для исследования функции нижних мочевых путей. ² В этой группе млекопитающих FC был впервые разработан для использования на крысах. ³ Здесь методика имплантации трубки в мочевой пузырь и выполнения ФК была хорошо описана и использована многими исследователями с приемлемым уровнем воспроизводимости. ⁴ Наличие трансгенных и выбитых штаммов делает мышей ценным видом для многочисленных исследовательских областей,Включая область дисфункции нижних мочевых путей. Методика, используемая для проведения мышиной цистометрии, значительно варьирует между лабораториями, что затрудняет сравнение результатов. ⁵

По сравнению с образцами ex vivo ФК сохраняет анатомию нижних мочевых путей, что позволяет координировать функцию между мочевым пузырем и его выходом во время фазы хранения и опорожнения цикла мочеиспускания. Предыдущие исследования показывают, что многочисленные, часто используемые анестетики подавляют сокращение мочеиспускания. Агенты, которые сохраняют сокращение гладкой мускулатуры мочевого пузыря (уретан, α-хлоралоза, кетамин и ксилазин), позволяя животному micturate, все еще значительно уменьшают функциональную емкость мочевого пузыря и подавляют нейротрансмиссию. ^{6 , 7 , 8 , 9} Хотя технически более сложная задача, ФК выполняется в awЖивотные, находящиеся в движении, сохраняют функциональную целостность рефлекса мочеиспускания.

На функции нижних мочевых путей влияют несколько факторов, включая послеоперационное опухание стенки мочевого пузыря, стресс из-за боли и дискомфорта и влияние окружающей среды. Используя хирургическую технику, которая минимизирует повреждение ткани во время имплантации трубки и методов регистрации, которые уменьшают движение трубки, одновременно позволяя животному свободно перемещаться, необходимы для получения точных и воспроизводимых записей.

Если выполнено адекватно, in vivo FC в свободно движущихся животных может предоставить данные, которые надежно отражают физиологическую функцию мочевого пузыря. ¹⁰ FC в свободно движущихся животных могут предоставить данные по следующим параметрам; Базальное или базовое давление: Минимальное давление между двумя мочеиспусканиями. Давление перетекания: среднее давление между двумя мочеиспусканиями. Пороговое давление: внутрипузырное давление immНепосредственно перед мочеиспусканием. Максимальное давление: Максимальное давление в мочевом пузыре во время цикла мочеиспускания. Спонтанная активность (или среднее колебательное давление): давление перетирания минус базальное давление. Невобождающиеся сокращения: увеличение внутрипузырного давления во время фазы заполнения, не связанное с выделением жидкости. Соответствие мочевого пузыря: емкость мочевого пузыря делится на пороговое давление минус базальное давление. Частота мочеиспускания: количество мочеиспусканий в единицу времени. Интервал между переменами: период между двумя максимальными давлениями опорожнения. Объем мочевого пузыря: Объем инфузии делится на количество мочеиспусканий. Ранее было опубликовано подробное описание этих параметров и стандартизированная терминология. ¹¹

ФК может быть выполнена с использованием метода внутрипузырной инфузии с непрерывным или однократным циклом. Непрерывная цистометрия позволяет регистрировать несколько циклов мочеиспускания и выбирать репрезентативные данные на основеНа воспроизводимость. Его точность измерения емкости мочевого пузыря ограничена из-за неизвестного остаточного объема. Кроме того, сложно собирать маленькие свободные объемы (которые основаны на деформации и полу варьируют от 30 до 184 мкл) у свободно передвигающихся мышей. Использование этого метода для регистрации объема мочеиспускания является менее точным по сравнению с анестезированным препаратом, но оно превосходит его в том, что оно позволяет избежать подавляющих эффектов анестетиков на функцию мочевого пузыря. Для оценки емкости мочевого пузыря следует использовать одноциклическую цистометрию. В этом методе мочевой пузырь опорожняется путем аспирации до инфузии, а емкость рассчитывается как функция скорости инфузии, умноженной на время до максимального давления.

Хотя была опубликована методика проведения цистометрии у мелких грызунов, она описала операцию, выполненную на крысе, и рекомендовала провести цистометрию мыши под анестезией уретаном. ¹⁰ Цель этого сообщения - tO описать как микрохирургические методы, используемые для имплантации внутрипузырной трубки в купол мочевого пузыря, так и экспериментальную установку, используемую для регистрации функции нижних мочевых путей, in vivo , при непрерывном заполнении мочевого пузыря и мочеиспускании в бодрствующей свободно движущейся мыши. Кроме того, были проведены эксперименты по определению длины, диаметра и материала труб, а также методологии проведения in vivo FC, влияющих на запись. Этот экспериментальный протокол суммирует ранее опубликованные методы и предлагает ряд модификаций, основанных на экспериментальных результатах.

Protocol

Животные были размещены в Учреждении по уходу за животными Вермонтского университета в соответствии с установленными правилами. Все опыты на животных проводились в соответствии с руководством Национального института здравоохранения по уходу и использованию лабораторных животных.

1. Внутрипузырная имплантация трубки

1. Подготовка труб и инструментов для хирургической процедуры
   1. Отрежьте 7-сантиметровый кусок трубки РЕ10, чтобы сделать катетер для имплантации.
   2. Создайте факел на одном конце трубы PE10, медленно продвигая конец к открытому пламени.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Быстро вытащите трубку, как только вспышка развивается.
   3. Нанесите три капли универсального горячего клея, используя низкотемпературную установку на пистолет для клея, на 4,5, 5 и 5,5 см от расширяющегося конца снаружи трубки PE10. Это поможет закрепить трубу у спины животного. ( Рисунок 1 )
   4. Стерилизовать трубку, замачивая ее в 70%Этанола и затем промывают его стерильным 0,9% NaCl перед использованием. Оставьте заполненную трубу во избежание попадания пузырьков воздуха в систему.
   5. Создайте пробку 30 калибра, чтобы запечатать конец катетера PE10, отделив иглу 30 калибра от ступицы, вручную управляя проксимальным концом из стороны в сторону. Нанесите каплю горячего клея до конца. Убедитесь, что уплотнение является водонепроницаемым. ( Рисунок 2 )
   6. Используйте следующие микрохирургические инструменты: две пары изогнутых микрошагов Dumont # 7, две пары изогнутых микрошагов Dumont # 5, иглу 21 G, тончайший прямой гемостат, микроножницы, малые рассекающие ножницы и держатель микроигл.
   7. Перед началом процедуры стерилизовать все инструменты.
2. Приготовление животного
   1. После обезболивания животного сначала сбривают нижнюю половину живота, затем поворачивают животное, склонное к бритью, и очищают область на верхней части спины 70% -ным спиртом, за которым следует бетадин, Применить ветеринарную мазь для глаз, чтобы предотвратить сухость. Затем используйте пару прямых тупых ножниц и пару изогнутых микроскопов Dumont # 7, чтобы сделать разрез кожи между лопатками длиной 1,5 см и поместить животное на спину поверх грелки (37 ° C), покрытой стерильными драпировками.
   2. Наконец, очистите живот спиртом и бетадином.
3. Хирургическая процедура
   ПРИМЕЧАНИЕ. Выполняйте все хирургические процедуры под операционным микроскопом с увеличением от 3,15 до 20 раз. После помещения животного на стерильные шторы, наденьте стерильные перчатки. Продолжайте использовать стерильные процедуры на протяжении всей операции.
   1. Поместите животное в индукционную коробку и обезболивайте, используя 2% ингаляционного изофлурана с носителем кислорода (1 л / мин). Поддерживайте анестезию в течение всей процедуры, помещая головку животного в носовой конус и используя 2% ингаляционного изофлурана с носителем кислорода (1 л / мин). Начинайте операцию после получения негативаАтивный ответ от теста на носки.
   2. Используйте пару прямых, тупых ножниц и пару микрофонов прикуса Dumont # 7, чтобы сделать снизу на 1,5 см срединный разрез брюшной полости через кожу. Впоследствии, создайте соответствующий разрез через фасцию вдоль линии alba и мышцы, чтобы выставить купол и верхнюю половину мочевого пузыря. Избегайте травм мочевого пузыря, применяя направленное вверх сцепление с каждым слоем ткани, используя пару микрофонов с дугообразными микрофонами Dumont # 7. Держите брюшную внутренность от высыхания, добавляя капли теплого физиологического раствора.
   3. Поверните животное на бок, чтобы получить доступ к разрезу на затылке. Надавите узким кровоостанавливающим подкожно, хотя разрез. Подкожный канал должен начинаться на спине и продолжаться вдоль стороны.
   4. Как только наконечник инструмента достигнет дна грудной клетки, поверните наконечник к средней линии и внутри живота (при прокалывании мышц брюшной стенки будет небольшой поп), Продолжайте продвигать гемостат до тех пор, пока кончик не откроется при брюшном разрезе под мышечным слоем. ( Рисунок 3 )
   5. Возьмитесь за «нерасширенный» конец трубки с помощью гемостата и медленно втягивайте инструмент, вытягивая конец трубки через разрез на задней части шеи. Отрегулируйте расширяющийся конец трубки так, чтобы он лежал прямо над куполом мочевого пузыря.
   6. Сделайте свободную нить из мононити 6-0 (неабсорбируемую) и поместите ее поверх купола пузыря. Этот галстук будет использован позже для закрепления трубки в мочевом пузыре.
   7. Поместите небольшой рулон безворсовой ткани в живот и позади мочевого пузыря, чтобы помочь стабилизировать и поднять его.
   8. Подготовьте к вставке расширяющийся конец катетера PE10 в мочевой пузырь.
      1. В недоминирующей руке держите купол мочевого пузыря дугообразными микрошариками Dumont # 7 и держите это сцепление до тех пор, пока катетер не будет помещен в мочевой пузырь.
      2. Используйте иглу 21-го калибра tO сделать цистотомию на вершине купола. Аккуратно исследуйте цистотомию с помощью закрытой пары микровыступов # 5, чтобы убедиться, что катетер легко проходит через отверстие.
      3. Держа купол камеры в недоминирующей руке, поместите расширяющийся конец катетера PE10 в мочевой пузырь (подтолкните вспышку вниз к шейке мочевого пузыря, чтобы она не выскользнула во время фиксации).
      4. Свяжите 6-0 моноволоконный шов вокруг купола мочевого пузыря и трубки с галстуком, расположенным впереди трубки. Обязательно завяжите шов как можно выше на мочевом пузыре, чтобы избежать искусственного уменьшения емкости мочевого пузыря. ( Рисунок 4 )
      5. Альтернативно, закрепите катетер, используя шовный нить кошелька следующим образом. Сделайте свободный шов на кошельке на куполе мочевого пузыря с использованием мононити 6-0. Выполните шаги 1.3.8.1 - 1.3.8.3, чтобы выполнить цистотомию и вставить катетер. Закрепите трубку, завязав нить кошелька. ( Рисунок 5 )
   9. Протестируйте проходимость и герметичность трубки в мочевом пузыре, прикрепив к дальнему концу трубки шприц с инсулином объемом 0,5 мл с иглой 30-го калибра. Медленно заполните мочевой пузырь 0,1-0,2 мл 0,9% NaCl до тех пор, пока капля не появится в отверстии уретры, затем опорожните мочевой пузырь путем аспирации. Важно, чтобы мочевой пузырь мог быть заполнен и опорожнен.
   10. Если на куполе не образуются утечки, подтяните мочевой пузырь с помощью пары изогнутых микрошагов и осторожно потяните за шланг трубки, пока вспышка не будет опираться на внутреннюю часть купола камеры.
   11. Перед закрытием удалите небольшой рулон ткани и убедитесь, что мочевой пузырь находится в нормальном положении.
   12. Закройте брюшную стенку в два слоя (мышцы и кожа) с помощью 6-0 ходового шва. Предпочтительно аппроксимировать мышцу прямой мышцы живота путем наложения швов только на края передней брюшной фасции (передняя стенка прямой кишки).
   13. Чтобы закрепить трубу у животных назад, осторожно roЖивотное на живот. Вставьте подкожную часть металлического анкера в межкапиллярный разрез. ( Рис. 12 ) Используйте шов 6-0 для закрепления трубки и анкеровки, обведя их вертикальным швом матраца.
   14. Убедитесь, что пузырек клея остается выше и ниже кожи, чтобы предотвратить вытягивание трубки. Отрежьте трубку примерно на 2 см выше кожи.
   15. Аккуратно вставьте вилку 30-калибра (шаг 1.1.5) в конец трубки, чтобы предотвратить утечку мочи.
4. Внесите 0,5 мл 0,9% NaCl подкожно для гидратации. Дайте послеоперационную анальгезию сразу после операции и поддерживайте ее в течение 48 часов.
   1. Поместите животное обратно в клетку, расположенную под инфракрасной лампой. Поддерживайте постоянное наблюдение до тех пор, пока животное не будет свободно передвигаться по клетке.
5. Контролируйте животное ежедневно и дайте ему восстановиться в течение 5 дней перед записью.

2. Просыпающаяся кистаЗапись ометрия

1. Подготовка программы регистрации, датчика давления и инфузионного насоса.
   1. Перед обезболиванием животного подключите инфузионный насос, датчик давления и поводок 22 G с помощью трубки PE50. ( Рисунок 6 )
   2. Откройте программу записи (см. Таблицу материалов для примера) на компьютере для калибровки давления в системе и подготовки к записи. Обязательно используйте те же настройки во время калибровки и записи.
      1. Заполните шприц объемом 20 мл 10 - 15 мл комнатной температуры 0.9% NaCl и загрузите в инфузионный насос. Запрограммируйте насос для инфузии со скоростью 0,6 мл / ч.
      2. Закрепите преобразователь давления на той же высоте, что и мочевой пузырь животного или дно камеры для записи.
      3. Присоедините вертлюг 22 калибра к концу датчика давления (PE50 - трубка - датчик давления для поворота)
         ПРИМЕЧАНИЕ. Шарнир используется для предотвращения закручивания или изгиба трубкиЖивотное движется.
      4. Продвиньте шприцевой насос для промывки 0.9% NaCl через систему. Перед калибровкой обязательно удалите все пузырьки воздуха.
      5. Когда программа записи запущена, используйте линейку для калибровки давления (см / Н ₂ O). Медленно перемещайте конец троса PE50 с 0 до 30 см. При необходимости отрегулируйте нуль.
         ПРИМЕЧАНИЕ: метка 0 см должна быть на той же высоте, что и пол записывающего каркаса и датчика давления.
   3. Приостановите поворот на 22 калибра над центром кассеты для записи. Убедитесь, что дно клетки позволяет моче попадать на собирающее устройство весов, расположенных под клеткой. Отрегулируйте высоту троса, чтобы мышка могла свободно передвигаться по клетке, не напрягая и не растягивая трубку. ( Рисунок 7 )
   4. По завершении проверьте, чтобы система и внешняя труба PE50 были заполнены 0.9% NaCl, и все пузырьки воздуха были удалены.
2. приготовительныйЗапись животного для записи
   1. Обезболить животное 2% вдыхаемым изофлураном и поместить его на живот. Снимите пробку с 30 калибрами и вставьте трубку РЕ10 (катетер для мочевого пузыря) в конец троса PE50. Используйте горячий клей для образования водонепроницаемого уплотнения.
   2. Выключите анестезию и поместите животное в клетку для записи с параллельным проводом, что позволит мочи попасть прямо на сборное устройство, размещенное поверх аналитического баланса. ( Рисунок 7 )
   3. Запустите запись, как только животное окажется в клетке, но не начинайте настаивать. Контролируйте животное, пока оно полностью не восстановится после анестезии. Когда давление в мочевом пузыре стабилизируется, начните вводить 0,9% NaCl со скоростью 0,6 мл / ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Запишите в программу записи все изменения. Важно иметь отчет о том, когда начинается инфузия, прекращается или возникают нарушения.
   4. Проверьте систему на наличие утечек и убедитесь, что животное легкоК пище и воде.
   5. Продолжайте запись в тихом помещении до тех пор, пока не будут получены три воспроизводимых цикла мочеиспускания.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Животное должно быть полностью спокойным во время записи. Предпочтительно использовать дистанционный видеомониторинг для наблюдения за поведением.

Results

Не было существенной разницы между материалами труб и диаметрами в консистенции повышения давления и падения в системе при окклюзии трубки. Послеоперационная внутрипузырная имплантация стенки мочевого пузыря была существенной как для полиэтиленовых (PE), так и для полиуретановых (PU) материалов. На 2-й день развилась тяжелая подслизистая опухоль. Он занимал половину поперечного сечения мочевого пузыря, что приводило к непроходимости просвета. На 5 день отек полностью разрешился, в резуль...

Discussion

Оптимальный материал и размер внутрипузырной трубки

Для определения влияния диаметра трубки на запись давления мы тестировали различные микрожидкостные трубки; PE50 (0,58 мм ID), полиуретан PU027 (0,4 мм ID), PE25 (0,46 мм ID) и PE10 (0,28 мм ID). Для каждой трубки регистрировали давление с помощью инфузионного насоса, работающего со скоростью 1 мл / ч, при быстром перемещении трубки по вертикали от 0 до 30 см. Первоначальные эксперименты in vivo были направлены на использование труб РЕ50, но о...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Полиэтилен (ПЭ) 10 трубок	Instech	BTPE-10	Подходит для разъемов/заглушек 30G
Полиэтилен (ПЭ) 50	трубок Instech	BTPE-50	Подходит для 22G разъемов/вилок 22G
одноканальный поворотный нержавеющий сталь	Instech	375/22
Пружина для удлинения из высокоуглеродистой стали (9/64" OD)	Grainger	1NAH1	Защищает трубку PE50 - Обрезать по длине
Коннектор 22 G	Instech	SP22/12
Yutaoz Professional Термоплавкий клеевой пистолет	Yutaoz		Используйте низкую температуру (100 ° C) - Подойдет любой пистолет-расплав с регулируемым температурным диапазоном
Surebonder DT-2010 универсальный клей-карандаш	Surebonder		Подойдет любой универсальный горячий клей
Dumont #5 изогнутые микрощипцы	World Precision Instruments	500232
Dumont #7 изогнутые микрощипцы	World Precision Instruments	14188
Мини ножницы для препарирования - прямые	World Precision Instruments	503240
Микро москитные щипцы (12,5 см)	World Precision Instruments	500451
Ножницы для препарирования - прямые	World Precision Instruments	14393
Иглодержатель Castroviejo	Precision Instruments	503258
изофлуран, USP	Phoenix		2%, скорость потока 1 л/мин
Бупренорфин			0,05 мг/кг
0,9% Хлорид натрия для орошения, USP	Baxter
6-0 Этилон черный монофиламент, нерассасывающийся шов	Ethicon		Галстук для мочевого пузыря
6-0 Викрил фиолетовый плетеный, рассасывающийся шов	Ethicon		Мышечный шов, бег
6-0 Пролена синий монофиламент, нерассасывающийся шов	Ethicon		Кожный шов, вертикальный матрас, заглубленный прерванный
KD Legato 210 насос для введения/вывода	KD Scientific		1,5 мл/ч
Одноразовый преобразователь давления	Digitimer	NL108T2
Усилитель давления	Digitimer	NL108A
Power1401-3 Интерфейс сбора данных	Digitimer
Spike2	обеспечение для регистрации давления	Cambridge Electronic Design Limited
хирургический операционный микроскоп Leica MZ6 (3,2 - 20X)	Leica Microsystems		Magnification