Анатомически вдохновленные трехмерные микротамовые инженерные нейронные сети для восстановления, модуляции и моделирования нервной системы

Summary

В этой рукописи подробно описывается изготовление микросердечных нейронных сетей: трехмерные микронные конструкции, состоящие из длинных выровненных аксональных трактов, охватывающих совокупную совокупность нейронов, заключенных в трубчатый гидрогель. Эти живые леса могут служить в качестве функциональных реле для восстановления или модуляции нейронных схем или в виде биофиделических пробирок, имитирующих нейроанатомию серо-белого вещества.

Abstract

Функциональное восстановление редко происходит после травмы или вызванной болезнью дегенерации в центральной нервной системе (ЦНС) из-за тормозной среды и ограниченной способности к нейрогенезу. Мы разрабатываем стратегию одновременного устранения нейронных и аксональных потерь пути в поврежденной ЦНС. В этой рукописи представлен протокол изготовления микроштучных инженерных нейронных сетей (micro-TENNs), имплантируемых конструкций, состоящих из нейронов и выровненных аксональных трактов, охватывающих просвет внеклеточного матрикса (ECM) из предварительно сформированного цилиндра гидрогеля диаметром в сотни микрон, который может увеличиваться в сантиметрах в длину. Нейронные агрегаты разделены на крайности трехмерной оболочки и натянуты на аксонные проекции. Микро-TENN уникально сбалансированы как стратегия реконструкции ЦНС, имитируя аспекты цитоархитектуры мозговых соединений и потенциально обеспечивая средства для замены сети. НейРональные агрегаты могут синаптироваться с тканями хозяина, чтобы сформировать новые функциональные реле для восстановления и / или модуляции отсутствующих или поврежденных схем. Эти конструкции могут также выступать в качестве провосстановительных «живых лесов», способных использовать механизмы развития миграции клеток и аксоновского пути, обеспечивая синергические структурные и разрешимые сигналы на основе состояния регенерации. Микро-TENN изготавливают путем заливки жидкого гидрогеля в цилиндрическую форму, содержащую иглу с продольным центрированием. Как только гидрогель гелеобразно, игла удаляется, оставляя полый микроколонец. К просвету добавляют ECM-раствор для обеспечения среды, подходящей для адгезии нейронов и роста аксонов. Диссоциированные нейроны механически агрегируются для точного посева на одном или обоих концах микроколони. Эта методология надежно создает самодостаточные миниатюрные конструкции с длинно проецирующими аксональными трактами, которые могут повторять признаки нейроанатомии мозга. Synaptic immНеметаллические и генетически закодированные индикаторы кальция свидетельствуют о том, что микро-TENN обладают обширным синаптическим распределением и собственной электрической активностью. Следовательно, микро-TENN представляют собой перспективную стратегию для целенаправленной нейрохирургической реконструкции путей мозга и могут также применяться в качестве биофиделических моделей для изучения нейробиологических явлений in vitro .

Introduction

Общей характеристикой расстройств и заболеваний центральной нервной системы (ЦНС), таких как травматическая травма головного мозга (TBI), травма спинного мозга (SCI), инсульт, болезнь Альцгеймера и болезнь Паркинсона, является разъединение аксональных путей и нейронных клеток Потери ^{1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6} . Например, когда ишемический инсульт не лечится, считается, что аксоны теряются со скоростью 7 миль аксонов в минуту ⁵ . В случае TBI, который еж....

Protocol

Все процедуры, связанные с животными, были одобрены Комитетами по уходу за животными и их использованию в Университете штата Пенсильвания и Медицинским центром по делам ветеранов Майкла Дж. Крешенца и придерживались руководящих принципов, изложенных в Политике общественного здравоохранения NIH по гигиеническому уходу и использованию лаборатории Животные (2015).

1. Разработка Agarose Hydrogel (Acellular Component of micro-TENNs)

1. Подготовка раствора агарозы
   1. В шкафу для биобезопасности подготовьте резервуары для микроколонок, переместив 20 мл забуференного фосфатом солевого раствора Дульбекко (DPBS) в каж....

Results

Микро-TENN контролировали с использованием фазово-контрастной микроскопии для оценки их цитоархитектуры и аксоновского выроста ( рис. 4 ). В однонаправленных микротенках с длиной волны 2 мм нейронные агрегаты были ограничены одним концом микроколонки и проецировали пучок аксонов через внутренний сердечник. Аксоны охватывали всю длину колонки на 5 дней in vitro (DIV) ( рисунок 4A ). Наблюдалась большая начальная скорость роста аксонов в двунаправ.......

Discussion

Повреждение и заболевание ЦНС обычно приводят к потере или дисфункции дальних аксональных путей, которые включают мозговое соединение, с или без сопутствующей нейронной дегенерации. Это усугубляется ограниченной способностью ЦНС способствовать нейрогенезу и регенерации. Несмотря на то, что стратегии восстановления, такие как фактор роста, клеток и биоматериалов, как индивидуальный или комбинаторный подход, такие методы не могут одновременно учитывать как дегенерацию нейронных клеток, так и потерю аксонных соединений

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Лазерный резак	Universal Laser Systems	PLS4.75	Используется для изготовления микроканальной формы, вырезанной лазером.
Устройство для изготовления микроколонн лазерной резкой	по индивидуальному заказу	--------------	Свяжитесь с нашей исследовательской группой, если заинтересованы. Размеры и чертежи представлены в рукописи.
Винты	--------------	--------------	#4-40 с диаметром резьбы 3,05 мм
Гайки		----------------------------	#4-40 с диаметром резьбы 3,05 мм
Игла иглоукалывания (180&микро; m diameter)	Lhasa Medical	sj.16X40	Диаметр может быть изменен в зависимости от желаемого размера просвета микроколонны.
Чашка Петри	Fisher	08772B
Фосфат Дульбекко буферизованный физиологический раствор (DPBS)	Инвитроген	14200075
Полистирол одноразовая серологическая пипетка	Fisher	13-678-11D
Agarose	Sigma	A9539-50G
Капиллярная трубка (398 &; m diameter)	Fisher	21170D	Диаметр может варьироваться в зависимости от желаемого размера оболочки микроколонны.
Нагревательная пластина	Fisher	SP88857200
Магнитный стержень	Fisher	1451352
Микропипетка	Sigma	Z683884-1EA
25 мм калибр	Fisher	14-826-49
Микроскальпель	Roboz Хирургические	ножницы RS-6270
	Fine Science Tools	14081-09
Щипцы	World Precision Instruments	501985
Стерилизатор горячих шариков	Sigma	Z378550-1EA
Стереоскоп	Nikon	SMZ800N	Используется для всех этапов вскрытия и для изготовления микро-ТЕН.
Коллаген Corning Tail I типа	Corning	354236	поддерживать на уровне 4º C и удалять только при необходимости.  Используйте лед, чтобы сохранить его температуру во время использования.
Микроцентрифуга пробирка	Fisher	02-681-256
Мышиный ламинин	Corning	354232	Поддерживать на уровне 4 º C и удалять только при необходимости.  Используйте лед, чтобы сохранить его температуру во время использования.
Нейробазальная среда	Инвитроген	21103049	Базальная среда для культивирования пренатальных и эмбриональных нейрональных клеток. Хранить по адресу 4º C и тепло при 37 º C перед использованием.
Гидроксид натрия (NaOH)	Fisher	SS2661
Соляная кислота (HCl)	Fisher	SA48-1
Лакмусовая бумага	Fisher	09-876-18
Сбалансированный раствор соли Хэнка (HBSS)	Инвитроген	14170112	хранить при 4 ºC.
0,25% Трипсин-ЭДТА	Инвитроген	25200056	хранить при -20 °Ордм; C и тепло при 37 º C перед использованием.
Дезоксирибонуклеаза поджелудочной железы крупного рогатого скота (ДНКаза) I	Sigma	10104159001	хранить при -20 °ordm; C и тепло при 37 º C перед использованием.
Добавка B-27	Invitrogen	12587010	Добавка, добавленная в нейробазальную среду для культивирования нейронов гиппокампа и коры головного мозга. Хранить при -20°; C и тепло при 37 º C перед использованием.
L-глютамин	Инвитроген	35050061	хранить при -20 °Ордм; C и тепло при 37 º C перед использованием.
Спрэг Доули эмбриональный день 18 крыс	Чарльз	Ривер Штамм 001
Пастер пипетка	Фишер	22-042816
15 мл центрифуга пробирка	EMESCO	1194-352099
Vortex	Фишер	02-215-414
Центрифуга	Фишер	05-413-115
Гемоцитометр	Фишер	02-671-6
3D-принтер Objet30	Stratasys	--------------	Используется для изготовления пирамидальных форм для микролунок.
3D-печатная форма для пирамидального колодца	на заказ	--------------	Свяжитесь с нашей исследовательской группой, если заинтересованы. Размеры и чертежи представлены в рукописи.
Полидиметилсилоксан (PDMS) и отвердитель	Fisher	NC9285739	Поставляется в комплекте с эластомером и отвердителем. Используйте внутри вытяжного шкафа для химикатов.
Воронка	Fisher	10-348C
1 мл пипетка	колба Sigma	Z509035
микрошпатель	Fisher	S50821
12-луночная культуральная пластина	EMESCO	1194-353043
Духовка	Fisher	11-475-154
Инкубатор	Fisher	13 998 076
AAV1. Syn.GCaMP6f.WPRE.SV40	UPenn Vector Core	36373	Store at -80ºC. Коммерчески доступный аденоассоциированный вирус (AAV) с индикатором кальция GCaMP6f.
Формальдегид 40%	Fisher	F77P-4	Формальдегид является токсичным соединением, известным как канцероген, и должен быть утилизирован в отдельном контейнере.
Triton X-100	Sigma	T8787	Неионогенное поверхностно-активное вещество, используемое для проникновения в клеточные мембраны.
Лошадиная сыворотка	Gibco	16050-122
Мышиный анти-Tuj-1/бета-III тубулин первичное антитело	Sigma	T8578-200UL	Хранить при -20°С.
Кролик анти-синапсин 1 первичное антитело	Synaptic Systems	106-001	хранить при -20°С.
Donkey anti-mouse 568 вторичное антитело	Invitrogen	A10037	хранить при 4ºC.
Donkey anti-rabbit 488 вторичное антитело	Invitrogen	A21206	хранить при 4ºC.
Hoechst 33342, Тригидрохлорид	Инвитроген	H3570	Хранить в 4ºC.  Hoechst — это известный мутаген, который следует рассматривать как канцероген. Поэтому его необходимо утилизировать в отдельную емкость.
A1RSI Лазерный сканирующий конфокальный микроскоп	Nikon	--------------	Используется для конфокальной реконструкции иммуномеченых конструкций.
Микроскоп Eclipse Ti-S	Nikon	--------------	Используется для получения фазово-контрастных изображений.  При получении цифровых изображений с помощью фотокамеры QiClick, подключенной к программному обеспечению Nikon Elements Basic Research (4.10.01).
Высокоскоростной флуоресцентный микроскоп	Nikon	--------------	Nikon Eclipse Ti в сочетании с фотоаппаратом ANDOR Neo/Zyla для визуализации кальция.
NIS Elements AR 4.50.00 Программное обеспечение	Nikon Instruments	--------------	Используется для идентификации переходных процессов кальция по записям, сделанным с помощью высокоскоростного флуоресцентного микроскопа.