Методическая статья

Анатомически вдохновленные трехмерные микротамовые инженерные нейронные сети для восстановления, модуляции и моделирования нервной системы

12.9K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/55609

⸱

31 мая 2017 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Bioengineering, School of Engineering and Applied Science, University of Pennsylvania, 2Center for Brain Injury & Repair, Department of Neurosurgery, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, 3Center for Neurotrauma, Neurodegeneration & Restoration, Michael J. Crescenz Veterans Affairs Medical Center, 4School of Biomedical Engineering, Drexel University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

В этой рукописи подробно описывается изготовление микросердечных нейронных сетей: трехмерные микронные конструкции, состоящие из длинных выровненных аксональных трактов, охватывающих совокупную совокупность нейронов, заключенных в трубчатый гидрогель. Эти живые леса могут служить в качестве функциональных реле для восстановления или модуляции нейронных схем или в виде биофиделических пробирок, имитирующих нейроанатомию серо-белого вещества.

Аннотация

Функциональное восстановление редко происходит после травмы или вызванной болезнью дегенерации в центральной нервной системе (ЦНС) из-за тормозной среды и ограниченной способности к нейрогенезу. Мы разрабатываем стратегию одновременного устранения нейронных и аксональных потерь пути в поврежденной ЦНС. В этой рукописи представлен протокол изготовления микроштучных инженерных нейронных сетей (micro-TENNs), имплантируемых конструкций, состоящих из нейронов и выровненных аксональных трактов, охватывающих просвет внеклеточного матрикса (ECM) из предварительно сформированного цилиндра гидрогеля диаметром в сотни микрон, который может увеличиваться в сантиметрах в длину. Нейронные агрегаты разделены на крайности трехмерной оболочки и натянуты на аксонные проекции. Микро-TENN уникально сбалансированы как стратегия реконструкции ЦНС, имитируя аспекты цитоархитектуры мозговых соединений и потенциально обеспечивая средства для замены сети. НейРональные агрегаты могут синаптироваться с тканями хозяина, чтобы сформировать новые функциональные реле для восстановления и / или модуляции отсутствующих или поврежденных схем. Эти конструкции могут также выступать в качестве провосстановительных «живых лесов», способных использовать механизмы развития миграции клеток и аксоновского пути, обеспечивая синергические структурные и разрешимые сигналы на основе состояния регенерации. Микро-TENN изготавливают путем заливки жидкого гидрогеля в цилиндрическую форму, содержащую иглу с продольным центрированием. Как только гидрогель гелеобразно, игла удаляется, оставляя полый микроколонец. К просвету добавляют ECM-раствор для обеспечения среды, подходящей для адгезии нейронов и роста аксонов. Диссоциированные нейроны механически агрегируются для точного посева на одном или обоих концах микроколони. Эта методология надежно создает самодостаточные миниатюрные конструкции с длинно проецирующими аксональными трактами, которые могут повторять признаки нейроанатомии мозга. Synaptic immНеметаллические и генетически закодированные индикаторы кальция свидетельствуют о том, что микро-TENN обладают обширным синаптическим распределением и собственной электрической активностью. Следовательно, микро-TENN представляют собой перспективную стратегию для целенаправленной нейрохирургической реконструкции путей мозга и могут также применяться в качестве биофиделических моделей для изучения нейробиологических явлений in vitro .

Введение

Общей характеристикой расстройств и заболеваний центральной нервной системы (ЦНС), таких как травматическая травма головного мозга (TBI), травма спинного мозга (SCI), инсульт, болезнь Альцгеймера и болезнь Паркинсона, является разъединение аксональных путей и нейронных клеток Потери 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . Например, когда ишемический инсульт не лечится, считается, что аксоны теряются со скоростью 7 миль аксонов в минуту 5 . В случае TBI, который ежегодно испытывает приблизительно 1,7 миллиона человек в США, аксональная дегенерация может продолжаться и после нескольких лет после травмы, поскольку первоначальная травма ускоряет долгосрочное нейродегенеративное состояние 4 . Усугубляя эти вредные эффекты, ЦНС имеет строго ограниченный capaГород для регенерации 1 , 7 , 8 , 9 . После травмы развивается тормозная среда, которая характеризуется отсутствием направленного руководства к отдаленным мишеням, наличию ингибиторов, связанных с миелином, которые препятствуют росту нейритов и образованию глиального шрама реактивными астроцитами 8 , 10 , 11 , 12 . Глиальный шрам служит биохимическим и физическим барьером для регенерации, причем молекулы, такие как протеогликаны хондроитинсульфата, препятствуют росту аксонов 8 , 11 . Кроме того, несмотря на то, что нейронные стволовые клетки обнаружены во взрослой ЦНС, производство новых нейронов ограничено, поскольку последовательные доказательства нейрогенеза были обнаружены только в обонятельной луковице, гиппокампеСубгранулярная зона, перивентрикулярная область и центральный канал спинного мозга 13 , 14 . Эти препятствия препятствуют функциональному восстановлению потерянных нейронов и архитектуры белого вещества после травмы или заболевания, что приводит к часто меняющимся и продолжительным последствиям этих состояний.

Несмотря на отсутствие регенерационной способности у взрослых ЦНС, было продемонстрировано, что регенерация аксонов возможна, если адекватные экологические сигналы представлены в принимающих нейронах 15 , 16 , 17 , 18 . Исследователи пытались доставить и манипулировать факторами роста ( например, фактором роста нервов, эпидермальным фактором роста, глиально-зависимым фактором роста и нейротрофическим фактором-3) и другими молекулами наведения для стимулирования пластичности и регенерации аксонов 14 , </ Sup> 18 , 19 . Несмотря на то, что эти исследования подтвердили, что взрослые аксоны способны реагировать на факторы роста, эти стратегии ограничены низкой проницаемостью гематоэнцефалического барьера и специфическими пространственными и временными градиентами, необходимыми для стимулирования регенерации 14 , 18 , 19 . Другие подходы основывались на гиперактивации факторов транскрипции, связанных с регенерацией, в нейронах ЦНС. Например, сверхэкспрессия фактора транскрипции Stat3 стимулировала регенерацию аксонов в зрительном нерве 20 . Тем не менее, как доставка биомолекулы, так и избыточная экспрессия факторов транскрипции не позволяют заменить потерянные популяции нейронов. Клеточные стратегии в основном сосредоточены на трансплантации нервных стволовых клеток (НСК) в ЦНС, используя их способность заменять нейроны ЦНС, высвобождать трофические факторы,И поддерживать попытки нейрогенеза, которые возникают после травмы 17 . Несмотря на это, все еще существуют насущные проблемы, мешающие этому подходу, в том числе затрудненная способность пересаженных нейронных клеток выжить, интегрироваться с хозяином и оставаться пространственно ограничена поврежденной областью 6 , 14 , 17 , 21 . Кроме того, доставка клеток сама по себе неспособна восстановить цитоархитектуру поврежденных или потерянных аксональных путей. Альтернативный подход, который решает проблемы, стоящие перед стратегиями доставки клеток и наркотиков / химических веществ, сочетает эти подходы с использованием биоматериалов 14 , 22 , 23 . Биоматериалы, такие как гидрогели, способны эмулировать биохимические и физические свойства внеклеточного матрикса (ECM), помогая в доставке клетокD в пределах поврежденной области и доставки факторов роста и других биоактивных молекул с контролируемым высвобождением 22 . Привлекательные характеристики этих стратегий на основе биоматериалов привели к доказательству регенерации аксонов in vivo после трансплантации лесов в пораженные участки 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 . Однако стратегии бесклеточного биоматериала не заменяют потерянные нейронные популяции; При использовании в качестве средств доставки для нейронных, глиальных или нейронных клеток-предшественников, биоматериалы не способны восстанавливать сети аксонов на большие расстояния. Задача разработки подхода, который решает как дегенерацию аксонального пути, так и потерю нейронов, связанную с повреждением ЦНС и заболеванием, по-прежнему остается 31.

Наша исследовательская группа ранее сообщала о разработке имплантируемых микро-тканевых нейронных сетей (micro-TENNs), которые являются типом «живого леса», состоящего из тел нейронных клеток, ограниченных одним или обоими концами микроколона с агарозным гидрогелем-ECM , С выровненными аксональными трактами, проходящими по всему внутреннему пространству этого трехмерного (3D) корпуса 1 , 10 , 31 , 32 . Одним из основных различий между этим методом и предыдущими подходами является то, что цитоархитектура микро-TENN создается полностью in vitro и затем трансплантируется 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 , 39 , 40 , 41 . Изготовление in vitro предлагает обширный пространственный и временный контроль клеточного фенотипа и ориентации, механические / физические свойства, биохимические сигналы и экзогенные факторы, что выгодно для интеграции этих лесов с хозяином после имплантации 41 , 42 . Micro-TENN анатомически вдохновлены, потому что они эмулируют нейроанатомию мозга, отображая аксональные тракты, похожие на те, которые соединяют различные функциональные области мозга ( рис. 1A ) 1 . Таким образом, эта стратегия может быть в состоянии физически заменить потерянные участки белого вещества и нейроны после имплантации в поврежденную область. Этот метод также вдохновлен механизмами развития, в которых «естественные живые леса», образованные радиальными глиальными клетками и пионерскими аксонами, действуют в качестве направляющих пути для клетокМиграция из субвентрикулярной зоны и рост аксонов соответственно 43 . Эти механизмы рекапилируются в выровненных аксональных участках микро-TENN, которые могут представлять живые пути миграции нейронных клеток и регенерации аксонов с помощью аксоноподобного аксонового выроста ( рис. 1C ) 43 . Кроме того, в этой стратегии используется синаптическая интеграция между нейронами микро-TENN и собственной схемой, образуя новые реле, которые могут способствовать функциональному восстановлению ( рис. 1B ) 43 . Способность к образованию синапсов также может предоставить этому подходу способность модулировать ЦНС и реагировать на ткань хозяина в соответствии с сетевой обратной связью. Например, оптогенетически активные нейроны в живых каркасах могут стимулироваться для модуляции нейронных хозяев через синаптические взаимодействия ( рис. 1D ).

Кроме того, трубчатый контур на основе биоматериаловМикроэнтенозы обеспечивают адекватную среду для клеточной адгезии, роста, расширения нейритов и сигнализации, в то время как миниатюрные размеры конструкций потенциально допускают минимально инвазивную имплантацию и обеспечивают частично секвестрированную микроокружение для постепенной интеграции в мозг. Действительно, недавние публикации продемонстрировали потенциал микро-TENN для имитации нейронных путей после имплантации в мозг крысы. После стереотаксической микроинъекции мы ранее сообщали об обнаружении выживаемости нейронов микро-TENN, поддержании архитектуры аксонального тракта и расширении нейритов в корте головного мозга до, по меньшей мере, 1 месяца in vivo 10 , 31 . Более того, маркировка синапсином давала гистологические свидетельства синаптической интеграции с нативной тканью 10 , 31 . В целом, микро-TENN могут быть уникальными для восстановления и модуляции поврежденныхCNS путем замены потерянных нейронов, синаптической интеграции с хост-схемой, восстановления утраченной аксонной цитоархитектуры и, в некоторых случаях, обеспечения регенерации аксонов соответствующими сигналами пути.

figure-introduction-1
Рисунок 1: Принципы и вдохновение для разработки микросердечных нейронных сетей (микро-TENN). ( A ) Микро-TENN имитируют цитоархитектуру мозгового соединения (фиолетового), в котором функционально различные области связаны длинными выровненными аксональными трактами в однонаправленном (красном, зеленом) или двунаправленном (синем) порядке. Например, микро-TENN могут восстанавливать утраченные связи в кортикоталамическом и нигростриаторном путях или в перфорантном пути от энторинальной коры до гиппокампа (адаптировано из Struzyna et al. , 2015) 1 . ( B ) Диаграмма однонаправленногоL и двунаправленный микро-TENN (красный и синий соответственно), синаптически интегрируемые с главной схемой (фиолетовый), чтобы служить функциональным реле между обоими концами поражения. ( C ) Схема аксональных трактов однонаправленного микро-TENN (зеленая), служащая в качестве ориентира для облегченной аксоном регенерации аксонов хозяина (фиолетового) в направлении мишени, с которой взаимодействует микро-TENN. ( D ) Концептуальная схема использования оптико-активных микро-TENNS в качестве нейромодуляторов, с использованием синаптической интеграции с возбуждающими или тормозящими нейронами (снизу). Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

В настоящей рукописи подробно изложена методология, используемая для изготовления микро-TENN с использованием эмбрионально полученных церебральных кортикальных нейронов. Примечательно, что микро-TENN могут быть изготовлены с использованием других типов нейронных клеток. ДляДостаточно, исходные сообщения об успешной разработке микро-TENN показали нейроны дорзального корня ганглия (DRG) 32 . Микроэлементы гидрогеля могут быть сгенерированы ( рис. 2А ) путем добавления жидкой агарозы к изготовленной на заказ цилиндрической канальной решетке с лазером или к капиллярным трубкам, содержащим выровненные иглы для иглоукалывания. Игла образует просвет и определяет внутренний диаметр (ID) микроколоны, в то время как идентификатор капиллярной трубки и диаметр цилиндров в устройстве для лазерной резки определяют внешний диаметр (OD) конструкций. OD и ID могут быть выбраны в соответствии с желаемым применением путем выбора различных диаметров для устройства / капиллярных труб и игл для иглоукалывания соответственно. Также можно варьировать длину микроколонок; На сегодняшний день мы сообщили о строительстве микро-ТЭНД длиной до 20 мм в длину 10 и активно преследуем еще более длинные длины. После агарозных гелей и иглоукалывания nЭдельы удаляются, к просвету конструкций добавляется раствор ECM, обычно состоящий из коллагена I типа и ламинина ( фиг. 2C ). Ядро ECM обеспечивает эшафот для поддержки адгезии нейронных клеток и роста аксонов. Первоначально первичные крысиные нейроны крыс были высеяны в микроколонах с использованием диссоциированных клеточных суспензий 10 , 31 , 32 . Однако этот подход не вызывал целевой цитоархитектуры во всех случаях, которая определялась как тела нейронных клеток, ограниченные концами микроколонок, причем центральный просвет состоял из чистых выровненных аксональных трактов. С тех пор использование метода агрегации принудительных нейронов (на основе протоколов, адаптированных из Ungrin и др .) Позволило более надежную и последовательную разработку микро-TENN с идеальной структурой ( рис. 2B ) 44 . В дополнение к описанию текущегоМетодологии, в этой статье будут представлены типичные фазоконтрастные и конфокальные изображения микро-TENN, которые демонстрируют формирование аксональных трактов с течением времени, а также завершенную целевую цитоархитектуру. Эта рукопись также расширит заслуживающие внимания аспекты протокола и остающиеся проблемы и будущие направления технологии микро-TENN.

figure-introduction-2
Рисунок 2: Принципиальная схема трехступенчатого процесса изготовления микро-TENN. ( A ) Разработка агарозного гидрогеля: (i) первоначально небольшая иглоукалывающая игла ( например , диаметр 180-350 мкм) вставляется в цилиндрические каналы изготовленной на заказ пресс-формы для лазерной резки или капиллярной трубки ( например, , 380-700 мкм в диаметре). На следующем этапе жидкая агароза в DPBS вводится в цилиндрические каналы или капиллярные трубки. (Ii) После агарозных гелей игла удаляется иПресс-форму разобрали, чтобы получить полые агарозные микроколоны. (Iii) Эти конструкции затем стерилизуют и хранят в DPBS. ( B ) Первичная культура нейронов и агрегированный метод: (i) Агрегирование нейронов выполняется в пирамидальных массивах микроячейки, отлитых из трехмерных печатных форм, которые помещаются в лунки 12-луночного планшета. (Ii) Микро-TENN включают первичные нейроны крыс, диссоциированные от эмбриональных мозгов крыс эмбрионального дня-18. После диссоциации ткани трипсином-EDTA и ДНКазой I готовят клеточный раствор с плотностью 1,0-2,0 × 10 6 клеток / мл. (Iii) 12 мкл этого раствора переносят в каждую лунку в пирамидальной микроячейке. Пластину, содержащую эти микро-лунки, центрифугируют для получения клеточных агрегатов. (Iv) Затем их инкубируют в течение ночи перед нанесением покрытия в микроколонах. ( C ) Изготовление сердечника ECM и клеточного посева: (i) Перед посевом клеток, ECM-раствор, содержащий 1 мг / мл коллагена I типа и 1 мг / млЛаминин переносят внутрь микро-TENN и дают возможность полимеризоваться. (Ii) В зависимости от того, изготавливаются ли однонаправленные или двунаправленные микро-TENN, агрегат помещается в одну или обе крайности микроколона соответственно. (Iii) После периода инкубации для содействия адгезии микро-TENN культивируют в чашках Петри, залитых добавленной эмбриональной нейронной базальной средой. (Iv) Через 3-5 дней в культуре окончательная микро-TENN-структура должна демонстрировать клеточные агрегаты в экстремумах микроколона, с аксональными трактами, охватывающими ее длину. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными, были одобрены Комитетами по уходу за животными и их использованию в Университете штата Пенсильвания и Медицинским центром по делам ветеранов Майкла Дж. Крешенца и придерживались руководящих принципов, изложенных в Политике общественного здравоохранения NIH по гигиеническому уходу и использованию лаборатории Животные (2015).

1. Разработка Agarose Hydrogel (Acellular Component of micro-TENNs)

  1. Подготовка раствора агарозы
    1. В шкафу для биобезопасности подготовьте резервуары для микроколонок, переместив 20 мл забуференного фосфатом солевого раствора Дульбекко (DPBS) в каждую из двух чашек Петри 10 см. Стерилизовать тонкие щипцы и микроскальпели с помощью стерилизатора горячего шарика.
    2. Взвесьте 3 г агарозы и перенесите ее в стерильный стакан внутри шкафа для биобезопасности. Добавить 100 мл DPBS для конечной концентрации 3% вес / объем (мас. / Об.). Включите чистый магнитный стержень и накройте стакан алюминиемNum foil.
    3. С помощью горячей плиты / мешалки разогрейте стакан при 100 ° C и перемешайте при 120-200 об / мин, чтобы полностью растворить агарозу (раствор превратится из облачного в прозрачный). Поддержание нагрева и перемешивание впоследствии для предотвращения гелеобразования и изменения температуры нагрева, если необходимо, чтобы избежать сжигания агарозы.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Изготовление с помощью устройства для лазерной резки и капиллярных труб представлено ниже в подразделах 1.2 и 1.3 соответственно. Перейдите к подразделу 1.4 после завершения шагов, описанных в любом из подразделов. Для обоих методов изготовления микроколонок быстро добавляйте жидкую агарозу, так как агароза быстро затвердевает при охлаждении. При стерилизации с помощью автоклава на любой из следующих этапов используйте стандартные условия, применяемые к посуде.
  2. Подготовка микроколонок с использованием устройства для лазерной резки
    ПРИМЕЧАНИЕ. Устройство для лазерной резки вырезается из прозрачного акрила с использованием коммерческого резака с CO 2 лазером. ФабриКатион структур и устройств с помощью лазерной резки хорошо документирован для ряда инженерных и исследовательских приложений 45 , 46 , 47 . Эта форма ( рис. 3 ) состоит из массива из пяти цилиндрических каналов, каждый из которых имеет диаметр 398 мкм и длину 6,35 мм. Эти цилиндрические массивы формируются вдоль их длины двумя частями: нижняя половина (длина: 25,4 мм, ширина: 6,35 мм, высота: 6,0 мм) и верхняя половина (длина: 31,5 мм, ширина: 6,35 мм, высота: 12,7 мм ), Как показано на фиг.3А и 3В , соответственно. Две половины могут быть зажаты вместе передним и задним крышками, показанные на рисунке 3C (длина 31,5 мм, ширина: 6,35 мм, высота: 12,7 мм), которые имеют четыре отверстия для выравнивания, которые совпадают с двумя отверстиями в верхней и нижней частях Которые помогают скреплять все детали вместе при завинчивании. Эти колпачки также включеныЛюбящие пять отверстий, концентрические по отношению к цилиндрическим каналам, в которые иглы для иглоукалывания могут быть вставлены для образования просвета микроколонок.
    1. Стерилизовать устройство, показанное на рисунке 3 , покрыв его алюминиевой фольгой и автоклавированием. Соберите устройство, как показано на рисунке 3D , выровняв переднюю и заднюю крышки с помощью только нижней части и закрепив три части двумя винтами и гайками № 4-40 (диаметр резьбы 3.05 мм) в нижних центрирующих отверстиях.
    2. Полностью ввести иглу иглоукалывания (диаметр: 180 мкм, длина: 30 мм) в отверстия иглы либо на передней, либо на задней крышке устройства ( рисунок 3D ). С помощью микропипетки налейте достаточную жидкую агарозу (~ 1 мл на пять каналов) на половину куска, чтобы полностью заполнить каждую из цилиндрических половин канала.
    3. Немедленно поместите верхнюю часть устройства в нижнюю половину и надавите, пока он не будетМесто для завершения цилиндрических каналов (трение между колпачками и верхней частью будет поддерживать последнее на месте). Подождите ~ 5 мин при комнатной температуре после добавления агарозы, чтобы обеспечить его гелеобразование внутри каналов устройства.
    4. Вручную извлеките иглу из каждого из отверстий на крышках устройства. Выверните винты и вручную отделите две крышки и верхнюю половину от нижней части, где последняя будет удерживать микроколоны гидрогеля.
    5. Используйте тонкие щипцы для аккуратного удаления микроколонок из каналов на нижней части куска и поместите их в предварительно приготовленную чашку Петри, содержащую DPBS (шаг 1.1.1). Повторно использовать устройство для другого раунда изготовления микроколонок. Перейдите к подразделу 1.4.
  3. Изготовление микроколонок с использованием капиллярных трубок
    1. Перенесите стеклянные капиллярные трубки (диаметр: 398,78 мкм, длина 32 мм) внутрь шкафа биобезопасности. Вручную разбитьДлинные трубки в фрагменты размером 2,0-2,5 см и полностью вставляют в каждый фрагмент одну иглу иглоукалывания (диаметр: 180 мкм, длина 30 мм) ( рисунок 2А ).
    2. Перенесите 1 мл жидкой агарозы из стакана на поверхность пустой чашки Петри. Удерживая капиллярную трубку и введенную иглу, поместите один конец трубки в контакт с жидким агарозным пулом, чтобы заполнить его капиллярным действием. Агитируйте трубку, чтобы способствовать подъему капилляров.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Заполните капиллярные трубки жидкой агарозой так высоко, как это позволяет капиллярное действие; Впоследствии эти микроколоны могут быть разрезаны на меньшие конструкции в зависимости от желаемой длины. 1-мл агарозный пул обычно используют только для одной трубки, так как агароза быстро охлаждается и гели, предотвращая дальнейшее капиллярное действие.
    3. Когда жидкость перестает подниматься, удалите капиллярную трубку из бассейна и поместите ее горизонтально на поверхность чашки Петри. Подождите 5 минут, чтобы агарозный гель находился внутри труб.
    4. Расположите указательный и указательный палец по обе стороны трубки и нажмите на нее. Используйте другую руку, чтобы быстро вытащить иглу, используя большой палец и указательный палец, чтобы сама микроколонка не соскользнула из трубки. Вставьте иглу 30 калибра в капиллярную трубку, чтобы медленно вывести микроколонец в блюдо, содержащее DPBS (шаг 1.1.1).
  4. Обрезка и стерилизация микроколонны
    1. Деликатно перенесите один микроколонок из DPBS в пустую посуду, используя тонкие щипцы. Добавьте 10 мкл DBPS в верхнюю часть микроколонки с микропипеткой, чтобы предотвратить сушку. Поместите последнее блюдо под стереоскоп для визуального наведения.
      ПРИМЕЧАНИЕ. На протяжении всего протокола сушка или дегидратация микроколонок относится к приобретению смятой структуры, которая визуально отличается от типичного гидратированного внешнего вида этих конструкций. Обезвоженные микроколоны прочно прикрепляются к поверхности чашек Петри и cАннота легко перемещаться, тогда как гидратированные конструкции, как правило, скользят по поверхности после манипуляции с пинцетом. На рис. 8А показано фазово-контрастное изображение полностью высушенного микроколона.
    2. Обрежьте микроколонку микроскальпелем, чтобы сократить ее до желаемой длины (здесь 2-5 мм). Транспортируйте обрезанный микроколонец с помощью тонких пинцетов на другую чашку DPBS Petri, приготовленную на этапе 1.1.1.
    3. Повторите шаги 1.4.1 и 1.4.2 для каждого изготовленного микроколона.
    4. Стерилизуйте микроколоны в содержащих DPBS чашках Петри под ультрафиолетовым (УФ) светом в течение 1 часа. Храните чашки Петри при температуре 4 ° C перед добавлением ECM и клеточным покрытием.

2. Первичная культура нейронов и метод агрегирования вынужденных клеток

  1. Подготовка пирамидальной микроячейки
    ПРИМЕЧАНИЕ. В этом разделе используется трехмерная печатная форма, состоящая из цилиндрического основания (диаметр: 2,2 см, высота: 7,0 мм) aИ девять квадратных пирамид сверху (длина стороны: 4,0 мм, угол наклона: 60 ​​°), организованный в массив 3 х 3, как показано на рисунке 3Е . Процесс изготовления добавок с использованием имеющихся в продаже трехмерных принтеров хорошо документирован. Программное обеспечение для автоматизированного проектирования может использоваться для проектирования пресс-формы. Затем полученный файл проекта можно преобразовать в цифровой форме в путь инструмента для 3D-принтера. Каждый принтер имеет разные спецификации, и инструкции по настройке и эксплуатации 3D-принтера изменяются соответственно.
    1. Используйте сверло 3/32 "для прокола 16 отверстий в 4 х 4-х массивах (длина стороны: 4 см, разделение отверстий: 1 см), центрированная в крышке чашки Петри 10 см. Внутри вытяжного колпачка с химическим составом используйте Нижний кусок чашки Петри для взвешивания 27 г полидиметилсилоксана (PDMS) и 3 г отвердителя (для соотношения 1:10). Размешайте с помощью микро-шпателя для равномерного распределения агента.
    2. Накройте PDMS / отвердитель проколотой крышкой. Подсоедините один конец шланга к вакууM порт вытяжного шкафа и вставьте другой конец в стержень воронки (диаметр рта: 10 см, длина штока: 3 см, диаметр штока: 1,5 см).
    3. Сделайте отверстие с помощью сверла 3/32 дюйма в верхней части луковицы пипетки объемом 1 мл и вставьте и закрепите наконечник микропипетки емкостью 1000 мкл в отверстие (с заостренным концом вверх). Поместите лампу и наконечник в шланг и вытяните Шланг вверх, пока лампочка не закрепит шланг в штоке воронки.
    4. Поместите воронку на проколотую крышку и закрепите шланг с помощью прочной опоры. Откройте вакуумный клапан в течение 5 мин для всасывания и доведите пузырьки воздуха до поверхности.
    5. Закройте клапан, удалите воронку и нажмите на чашку Петри на поверхность вытяжного колпака ~ 3 раза, чтобы вырвать все оставшиеся пузырьки воздуха.
    6. Поместите пирамидально-хорошо трехмерную печатную форму в каждую лунку на 12-луночном планшете с пирамидами, направленными вверх. Налейте PDMS / отвердитель поверх форм до тех пор, пока каждая лунка tОн заполнен. Закройте 12-луночный планшет крышкой и перенесите его в духовку на 1 час при 60 ° C для сушки.
    7. Осторожно удалите из массива микрошариков PDMS ( рис. 3F ) микропланшет. Закройте массивы PDMS алюминиевой фольгой и стерилизовать автоклавированием. Внутри шкафа для биобезопасности вставьте одну микрояручную решетку в каждую лунку 12-луночного планшета ( рис. 2В ).
  2. Изоляция корковых нейронов крыс
    1. Добавьте ~ 20 мл сбалансированного солевого раствора Хэнкса (HBSS) к каждой из четырех-шести чашек Петри 10 см (по одной для каждой расчлененной ткани) внутри шкафа для биобезопасности. Перенесите эти блюда в раскрывающийся капюшон и поместите их на лед. Стерилизуйте инструменты для рассечения, такие как микроскальпели, ножницы и щипцы, с помощью стерилизатора горячего шарика.
    2. Предварительно нагретая базальная среда эмбрионального нейрона + 2% без сыворотки + 0,4 мМ L-глутамина (называемая «культуральной средой»)Г) и 0,25% трипсина + 1 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) при 37 ° С. Дезоксирибонуклеазу оттаивания (ДНКазу) I, помещая ее при комнатной температуре. Подготовьте 1,5 мл 0,17 мг / мл раствора ДНК-I в HBSS и поддерживайте раствор на льду.
    3. Усыплять беременную эмбриональную день-18 крыс с помощью ингаляции углекислого газа и подтвердить смерть путем обезглавливания. Перенесите тушку в стерильный вскрывающий колпак и положите ее в брюшную сторону вверх. Тщательно промойте живот 70% этанолом.
    4. Откройте матку и удалите плоды (обычно ~ 11) из амниотических мешков с помощью ножниц и перенесите их щипцами в чашку Петри, содержащую холодный HBSS, как описано 48 . Поместите охлажденный (-20 ° C) гранитный блок под стереоскоп. Поместите чашку Петри на поверхность этого холодного блока, чтобы сохранить низкую температуру HBSS во время процедуры вскрытия.
    5. Промойте щенков, размахивая HBSS, а затем перенесите их на следующее чистое блюдоСодержащий HBSS. С помощью стереоскопа и инструментов для рассечения последовательно удаляйте головки, полушария головного мозга и коры плодов и переносите каждую ткань с помощью щипцов на новую заполненную HBSS тарелку после каждого вскрытия 48 .
    6. Аспирируйте только коры с пипеткой Пастера и поместите ткань в стерильную пробирку для центрифуги 15 мл. Отбросьте другие расчлененные ткани. Промойте коры три раза, последовательно добавляя и удаляя ~ 5 мл HBSS с серологической пипеткой. Поместите трубку на лед, когда она не используется.
    7. Перенесите коры с помощью пипетки Пастера в пробирку объемом 15 мл, содержащую предварительно нагретый трипсин-ЭДТА (4-6 кортик на 5 мл трипсина-ЭДТА). Вручную встряхните трубку один раз и поместите ее при 37 ° C. Инвертируйте трубку каждые 3 мин, чтобы предотвратить сгущение ткани.
    8. Остановите воздействие трипсином через ~ 10 минут, удалив ткань пипеткой Пастера и перенесите ее в чистую центрифугу на 15 млтруба. Добавьте 0,15 мг / мл раствора ДНКазы I (1,5 мл) в пробирку с помощью пипетки.
    9. Используйте пипетку Пастера для ручного разрушения тканевых скоплений, а затем вихря (~ 30 с) до тех пор, пока раствор не станет однородным и в жидкости не останется оставшихся фрагментов ткани. Если невозможно полностью гомогенизировать раствор, извлеките нерастворимые фрагменты, потянув их в кончик пипетки Пастера.
    10. Центрифугируют раствор гомогенных клеток, полученный на стадии 2.2.9, при 200 мкг в течение 3 мин. Удалите супернатант с помощью пипетки Пастера, следя за тем, чтобы не повредить гранулированные клетки. Добавьте 2 мл культуральной среды с серологической пипеткой и вихрем для ресуспендирования клеток.
    11. Подсчитайте количество клеток в растворе, приготовленном на этапе 2.2.10, с использованием гемоцитометра; Ожидаемый выход составляет 3,0-5,0 × 10 6 клеток / корковое полушарие. Подготовьте 1 мл или более клеточной суспензии в культуральной среде с плотностью 1,0-2,0 × 10 6 клеток / мл.
  3. Образование агрегатов нейронных клеток
    1. С помощью микропипетки добавьте 12 мкл суспензии клеток 1,0-2,0 × 10 6 / мл в каждую микроячейку матрицы PDMS (которую помещают в планшет на этапе 2.1.7).
      ПРИМЕЧАНИЕ. Концентрацию клеток можно регулировать в зависимости от идентификатора микростолбца и желаемого размера заполнителя ячейки, так как более высокие концентрации дают большие агрегаты.
    2. Центрифугируйте пластину при 200 xg в течение 5 мин, чтобы заставить агрегацию клеток на дне микроячейки ( рис. 2B ). Тщательно добавьте ~ 2 мл культуральной среды в верхнюю часть каждой группы PDMS, чтобы покрыть все посевные микроузлы, стараясь не нарушать агрегированные клетки.
    3. Если клетки не будут трансдуцированы вирусным вектором, инкубируйте планшет в течение 12-24 часов при 37 ° C и 5% CO 2, а затем перейдите к разделу 3. Если агрегаты будут трансдуцированы, пропустите инкубацию и перейдите к разделу 2.4 ,
  4. TranИндукция с вирусным вектором для наблюдения передачи сигналов кальция
    Примечание. Эти шаги выполняются для трансдукции нейронов с вирусным вектором, содержащим генно-кодированный индикатор кальция (GECI). Результаты, показанные в этой статье, были получены с использованием коммерчески доступного аденоассоциированного вируса (AAV) (серотип 1) с GCaMP6f, GECI с быстрой кинетикой, состоящей из зеленого флуоресцентного белка (GFP), кальмодулина (CaM) и пептида M13, Управляемый промотором синапсина I человека. Раствор вирусного вектора может потребовать разбавления в стерильных DPBS перед трансдукцией в зависимости от концентрации исходного раствора. Здоровье клеток / морфология и сила сигнала GCaMP6f должны наблюдаться с течением времени для диапазона векторных концентраций. Эта процедура оптимизации должна выполняться каждым исследователем для определения соответствующего титра для их собственных культур клеток. Типичное время экспрессии GCaMP6f составляет 7-8 дней после трансдукции, которая возникает во время инкубации, проведенной в stEp 2.4.2.
    1. С помощью микропипетки добавьте требуемый объем раствора вирусного вектора (для конечной концентрации ~ 3,0 × 10 9 геномных копий на агрегат) в культуральную среду, покрывая агрегаты. Медленно пипетируйте вверх и вниз, чтобы гарантировать, что векторное решение равномерно распределено по всей культуральной среде.
    2. Инкубируйте планшет с посеянными пирамидальными микрозондами в течение 24 часов при 37 ° C и 5% CO 2, чтобы обеспечить трансдукцию вируса GCaMP6f.

3. Разработка сотового компонента микро-TENN

  1. Изготовление сердечника ECM
    1. После инкубации агрегата добавьте коллаген I и ламинин I в культуральную среду (для концентрации 1 мг / мл каждый) в микроцентрифужную пробирку для приготовления раствора ECM. Выполните шаги 3.1.2-3.1.4 при комнатной температуре, но поддерживайте трубку с ECM на льду, когда она не используется, чтобы предотвратить преждевременное гелеобразование.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Типичные затраты составляют 4 мкл раствора ECM для каждого микроколона (длина: 5 мм, ID: 180 мкм).
    2. Отрегулируйте pH раствора ECM, переведя 1-2 мкл на лакмусовую бумагу, чтобы проверить начальный рН, добавив 1 мкл 1 н. Гидроксида натрия (NaOH) и / или 1 н. Соляной кислоты (HCl) в ECM, при необходимости, И повторяется до тех пор, пока рН не станет 7,2-7,4. Обеспечьте гомогенизацию раствора ECM путем пипетирования вверх и вниз, избегая образования пузырьков воздуха.
    3. Перенесите микроколоны с помощью стерилизованных щипцов из блюд на этапе 1.4.3, чтобы выпустить 35- или 60-миллиметровые чашки Петри. Работайте на 4-5 микроколонах за раз, чтобы предотвратить обезвоживание. Прикрепите наконечник на 10 мкл, прикрепленный к наконечнику 1000 мкл к микропипетке. Используя стереоскоп для визуального наведения, поместите наконечник на один конец микроколонок и всасывайте для извлечения остаточных DPBS и пузырьков воздуха из просвета.
    4. Быстро выработать 4-5 мкл ECM в микропипетке. Наблюдение подРеоскопа, поместите наконечник микропипетки на один из концов микроколонок и выпустите достаточное количество ECM для заполнения просвета. Подтвердите отсутствие воздушных пузырьков в просвете, так как они могут препятствовать нарастанию аксонов через ECM. Если существуют пузырьки воздуха, удалите ECM, как описано в пункте 3.1.3, и снова добавьте ECM.
    5. Чтобы предотвратить обезвоживание, добавьте ~ 2 мкл ECM вокруг каждой микроколоны. Инкубируйте микроколоны гидрогеля / ECM в чашках Петри при 37 ° C и 5% CO 2 в течение 25 мин. Перейдите к посеву клеток сразу после инкубации.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Инкубационный период на этапе 3.1.5 предназначен для обеспечения времени полимеризации коллагена и ламинина внутри микроколонок.
  2. Поселение нейрональных клеток в микроколонах
    ПРИМЕЧАНИЕ. Чтобы изменить культуральную среду трансдуцированных агрегатов, наклоните пластину, используйте микропипетку для удаления среды, которая собирается на стенке лунки, а затем медленно добавьте ~ 1 мл против(Чтобы избежать нарушения агрегатов в пирамидальных микрозондах). Повторите эту замену второй раз.
    1. После инкубационного периода на этапе 3.1.5 переносите приблизительно 10-20 мкл культуральной среды на две свободные области в чашках Петри, содержащих микроколоны. Используйте микропипетку для индивидуальной передачи агрегатов в чашку Петри, содержащую конструкции, и перемещайте их с помощью щипцов в один из небольших пулов культуральной среды для сохранения здоровья клеток.
    2. Наблюдая за стереоскопом, вставьте агрегат на каждом конце микроколонок для двунаправленных микро-TENN или на одном конце для однонаправленной архитектуры (по желанию) с использованием щипцов. Подтвердите размещение агрегатов внутри микроколонок с помощью стереоскопа. Используйте щипцы для перемещения посевных микроколонок в другой небольшой пул культуральной среды, чтобы избежать обезвоживания и сохранения совокупного здоровья.
    3. Инкубируйте при 37 ° C и 5% CO 2 в течение 45 минут доОхладите агрегаты, чтобы они соответствовали ECM. Убедитесь, что агрегаты остаются на концах микроколонок, используя стереоскоп; Повторно ввести клеточные агрегаты и повторить шаг инкубации по мере необходимости.
    4. Тщательно наполните чашки Петри, содержащие микро-TENN, культуральной средой (3 или 6 мл для чашки Петри 35 или 60 мм, соответственно), используя серологическую пипетку. Поместите посуду в инкубатор при температуре 37 ° C и 5% CO 2 для долгосрочной культуры.
    5. Выполняйте полусредние изменения каждые 2 дня с культуральной средой. Осторожно удалите половину старой среды с помощью пипетки и используйте стереоскоп для визуального наведения, чтобы избежать отсасывания микро-TENN. Замените, медленно добавляя свежую, предварительно нагретую среду с пипеткой.
    6. Для повторного использования массивов микроуровней PDMS удалите культуральную среду, кипятите массивы в деионизированной воде в течение 30 мин и стерилизуйте в автоклаве для еще одного раунда образования и культуры заполнителя.
      ПРИМЕЧАНИЕ. В желаемые моменты времениЦитоархитектура микро-TENN может быть проверена с использованием фазово-контрастной микроскопии. Здесь для захвата фазово-контрастных изображений использовалось время экспозиции 5-8 мс и 10X (0,64 мкм / пиксель) и 20X (0,32 мкм / пиксель) цели. Флуоресценцию, связанную с изменениями концентрации кальция в вирально-трансдуцированных микро-TENN, фиксировали с использованием высокоскоростного флуоресцентного микроскопа с временем экспозиции 50 мс, объективом 10X (0,64 мкм / пиксель) и твердотельным светом с полосовыми фильтрами ~ 480 Нм и ~ 510 нм для возбуждения и излучения, соответственно, для визуализации сигнала флуоресценции GCaMP6f.

4. Иммуноцитохимия для исследований in vitro

Примечание: для изображений, показанных здесь, использовались следующие первичные антитела: мышь-туй-1 / бета-III тубулин (1: 500) и антисинапсин-1 кролика (1: 500) для маркировки аксонов и префикса -синаптические бутоны, соответственно. Вторичными антителами были осел анти- мышь 568 (1: 500) и осел-анти-кролик 488 (1: 500). Необходимые объемы готовых растворов первичных и вторичных антител, а также объемы растворов формальдегида, лошадиной сыворотки и моющих средств зависят от объема, необходимого для полного покрытия конструкций. Эти объемы можно свести к минимуму с помощью гидрофобной барьерной ручки, чтобы ограничить площадь, окружающую каждую микроколону.

ВНИМАНИЕ: В этом разделе используются формальдегид и Hoechst. Формальдегид является токсичным соединением, которое, как известно, является канцерогенным, и Hoechst является известным мутагеном. Поэтому эти соединения должны быть утилизированы в соответствующем контейнере для отходов. Всегда обрабатывайте их в химическом вытяжном шкафу при использовании соответствующего средства индивидуальной защиты, такого как лабораторное покрытие, защитные очки и перчатки.

  1. Подготовьте раствор объемного / объемного (объемного) формальдегида 4,0% в 1х фосфатном буферном растворе (PBS) внутри химического вытяжного шкафа.
  2. Удалите культуральную среду из чашек Петри.Микро-TENN с микропипеткой. Добавьте достаточное количество раствора формальдегида в посуду, чтобы полностью покрыть микро-TENN. Замачивайте микро-TENN в растворе формальдегида в течение 35 минут при 18-24 ° C для фиксации клеток внутри микроколонок.
  3. Удалите 4,0% раствор формальдегида из чашек Петри с помощью пипетки и утилизируйте соответствующие рекомендации по утилизации опасных материалов.
  4. Выполните два быстрых полоскания, добавив достаточно PBS, чтобы полностью покрыть фиксированные микро-TENN, а затем удалить PBS с помощью пипетки. Выполните третье долгое полоскание, промояв конструкции в PBS в течение 10 мин.
    ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: Отбросьте PBS, используемый для промывки, возможно, содержащий следы формальдегида.
  5. Подготовьте 0,3% об. / Об. Раствор неионного моющего средства в 4% об. / Об. Лошадиной сыворотке в PBS. Удалите PBS из чашек Петри, содержащих фиксированные микро-TENN, и добавьте достаточный объем раствора моющего средства 0,3% для покрытия конструкций. Замачивание в течение 60 мин при 18-24 & #176; C для проницаемости клеток.
  6. Удалите раствор моющего средства с помощью пипетки. Выполните два быстрых полоскания путем добавления и последующего удаления PBS. Затем выполните три более длительных полоскания, промояв конструкции в PBS в течение 5 минут во время каждого полоскания.
  7. Разбавляют первичные антитела в 4% лошадиной сыворотке. Удалите PBS из чашек Петри, содержащих фиксированные и проницаемые микро-TENN. Добавьте достаточное количество раствора первичных антител к микроколонам, чтобы полностью покрыть их. Уплотнить чашки Петри парафильмом для предотвращения испарения и инкубации в течение ночи (12-16 часов) при 4 ° C.
  8. Удалите раствор первичного антитела из посуды и промойте, как описано в шаге 4.6. В темноте, подготовить вторичный раствор антитела в 4,0% лошадиной сыворотке. Добавьте достаточное количество раствора вторичных антител, чтобы полностью покрыть конструкции, накрыть посуду алюминиевой фольгой и инкубировать в течение 2 часов при температуре 18-24 ° C.
  9. Подготовьте раствор Hoechst (1: 10000) в PBS для окрашивания ядер.
  10. Удалите раствор вторичных антител и инкубируйте микро-TENNS в растворе Hoechst в течение 10 мин при 18-24 ° C. Выполните пять полосканий с помощью PBS, каждый по 5-10 мин. Налейте чашку Петри с помощью PBS, чтобы покрыть окрашенные микро-TENN, заверните блюдо в алюминиевую фольгу и храните при 4 ° C до тех пор, пока не будет выполнена визуализация.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Изображения для иммуноблочных микро-TENN были взяты с помощью лазерного конфокального микроскопа с разрешением 2048 (~ 8 с / кадр), объективом 10X (0,64 мкм / пиксель), возбуждением 487 нм и длиной волны излучения 525 нм для Зеленая флуоресценция, 561 нм возбуждение и длина волн излучения 595 нм для красной флуоресценции и ~ 3.22 мкм / срез с ~ 60 срезами в среднем для z-стеков.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Микро-TENN контролировали с использованием фазово-контрастной микроскопии для оценки их цитоархитектуры и аксоновского выроста ( рис. 4 ). В однонаправленных микротенках с длиной волны 2 мм нейронные агрегаты были ограничены одним концом микроколонки и проецировали пучок аксонов через внутренний сердечник. Аксоны охватывали всю длину колонки на 5 дней in vitro (DIV) ( рисунок 4A ). Наблюдалась большая начальная скорость роста аксонов в двунаправ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Повреждение и заболевание ЦНС обычно приводят к потере или дисфункции дальних аксональных путей, которые включают мозговое соединение, с или без сопутствующей нейронной дегенерации. Это усугубляется ограниченной способностью ЦНС способствовать нейрогенезу и регенерации. Несмотря на то, что стратегии восстановления, такие как фактор роста, клеток и биоматериалов, как индивидуальный или комбинаторный подход, такие методы не могут одновременно учитывать как дегенерацию нейронных клеток, так и потерю аксонных соединений

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Финансовую поддержку оказали Национальные институты здравоохранения U01-NS094340 (Cullen), T32-NS043126 (Harris) и F31-NS090746 (Katiyar)), Фонд Майкла Дж. Фока (Программа терапевтического трубопровода № 9998 (Каллен)), Пилотная награда Центра медицины в Пенне (Каллен), Национальный научный фонд (Высшие научные стипендии DGE-1321851 (Стружина и Адевола)), Департамент по делам ветеранов (RR & D Merit Review № B1097-I (Каллен)), Американская ассоциация Неврологических хирургов и Конгресса неврологических хирургов (2015-2016 гг. Codman Fellowship of Neurotrauma and Critical Care (Петров)), а также Медицинское исследование и материальное обеспечение армии США (# W81XWH-13-207004 (Cullen) и W81XWH-15-1- 0466 (Каллен)).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Лазерный резакUniversal Laser SystemsPLS4.75Используется для изготовления микроканальной формы, вырезанной лазером.
Устройство для изготовления микроколонн лазерной резкойпо индивидуальному заказу--------------Свяжитесь с нашей исследовательской группой, если заинтересованы. Размеры и чертежи представлены в рукописи.
Винты----------------------------#4-40 с диаметром резьбы 3,05 мм
Гайки----------------------------#4-40 с диаметром резьбы 3,05 мм
Игла иглоукалывания (180&микро; m diameter)Lhasa Medicalsj.16X40Диаметр может быть изменен в зависимости от желаемого размера просвета микроколонны.
Чашка ПетриFisher08772B
Фосфат Дульбекко буферизованный физиологический раствор (DPBS)Инвитроген14200075
Полистирол одноразовая серологическая пипеткаFisher13-678-11D
AgaroseSigmaA9539-50G
Капиллярная трубка (398 &; m diameter)Fisher21170DДиаметр может варьироваться в зависимости от желаемого размера оболочки микроколонны.
Нагревательная пластинаFisherSP88857200
Магнитный стерженьFisher1451352
МикропипеткаSigmaZ683884-1EA
25 мм калибрFisher14-826-49
МикроскальпельRoboz Хирургическиеножницы RS-6270
Fine Science Tools14081-09
ЩипцыWorld Precision Instruments501985
Стерилизатор горячих шариковSigmaZ378550-1EA
СтереоскопNikonSMZ800NИспользуется для всех этапов вскрытия и для изготовления микро-ТЕН.
Коллаген Corning Tail I типаCorning354236поддерживать на уровне 4º C и удалять только при необходимости.  Используйте лед, чтобы сохранить его температуру во время использования.
Микроцентрифуга пробиркаFisher02-681-256
Мышиный ламининCorning354232Поддерживать на уровне 4 º C и удалять только при необходимости.  Используйте лед, чтобы сохранить его температуру во время использования.
Нейробазальная средаИнвитроген21103049Базальная среда для культивирования пренатальных и эмбриональных нейрональных клеток. Хранить по адресу 4º C и тепло при 37 º C перед использованием.
Гидроксид натрия (NaOH)FisherSS2661
Соляная кислота (HCl)FisherSA48-1
Лакмусовая бумагаFisher09-876-18
Сбалансированный раствор соли Хэнка (HBSS)Инвитроген14170112хранить при 4 ºC.
0,25% Трипсин-ЭДТАИнвитроген25200056хранить при -20 °Ордм; C и тепло при 37 º C перед использованием.
Дезоксирибонуклеаза поджелудочной железы крупного рогатого скота (ДНКаза) ISigma10104159001хранить при -20 °ordm; C и тепло при 37 º C перед использованием.
Добавка B-27Invitrogen12587010Добавка, добавленная в нейробазальную среду для культивирования нейронов гиппокампа и коры головного мозга. Хранить при -20°; C и тепло при 37 º C перед использованием.
L-глютамин Инвитроген35050061хранить при -20 °Ордм; C и тепло при 37 º C перед использованием.
Спрэг Доули эмбриональный день 18 крысЧарльзРивер Штамм 001
Пастер пипеткаФишер22-042816
15 мл центрифуга пробиркаEMESCO1194-352099
VortexФишер02-215-414
ЦентрифугаФишер05-413-115
ГемоцитометрФишер02-671-6
3D-принтер Objet30Stratasys --------------Используется для изготовления пирамидальных форм для микролунок.
3D-печатная форма для пирамидального колодцана заказ--------------Свяжитесь с нашей исследовательской группой, если заинтересованы. Размеры и чертежи представлены в рукописи.
Полидиметилсилоксан (PDMS) и отвердительFisherNC9285739Поставляется в комплекте с эластомером и отвердителем. Используйте внутри вытяжного шкафа для химикатов.
ВоронкаFisher10-348C
1 мл пипеткаколба SigmaZ509035
микрошпательFisherS50821
12-луночная культуральная пластинаEMESCO1194-353043
ДуховкаFisher11-475-154
ИнкубаторFisher13 998 076
AAV1. Syn.GCaMP6f.WPRE.SV40UPenn Vector Core36373Store at -80ºC. Коммерчески доступный аденоассоциированный вирус (AAV) с индикатором кальция GCaMP6f.
Формальдегид 40%FisherF77P-4Формальдегид является токсичным соединением, известным как канцероген, и должен быть утилизирован в отдельном контейнере.
Triton X-100SigmaT8787Неионогенное поверхностно-активное вещество, используемое для проникновения в клеточные мембраны.
Лошадиная сывороткаGibco16050-122
Мышиный анти-Tuj-1/бета-III тубулин первичное антителоSigmaT8578-200ULХранить при -20°С.
Кролик анти-синапсин 1 первичное антителоSynaptic Systems106-001хранить при -20°С.
Donkey anti-mouse 568 вторичное антителоInvitrogenA10037хранить при 4ºC.
Donkey anti-rabbit 488 вторичное антителоInvitrogenA21206хранить при 4ºC.
Hoechst 33342, ТригидрохлоридИнвитрогенH3570Хранить в 4ºC.  Hoechst — это известный мутаген, который следует рассматривать как канцероген. Поэтому его необходимо утилизировать в отдельную емкость.
A1RSI Лазерный сканирующий конфокальный микроскоп Nikon--------------Используется для конфокальной реконструкции иммуномеченых конструкций.
Микроскоп Eclipse Ti-S Nikon--------------Используется для получения фазово-контрастных изображений.  При получении цифровых изображений с помощью фотокамеры QiClick, подключенной к программному обеспечению Nikon Elements Basic Research (4.10.01).
Высокоскоростной флуоресцентный микроскопNikon--------------Nikon Eclipse Ti в сочетании с фотоаппаратом ANDOR Neo/Zyla для визуализации кальция.
NIS Elements AR 4.50.00 Программное обеспечениеNikon Instruments--------------Используется для идентификации переходных процессов кальция по записям, сделанным с помощью высокоскоростного флуоресцентного микроскопа.
игла

Ссылки

  1. Struzyna, L. A., Harris, J. P., Katiyar, K. S., Chen, H. I., Cullen, D. K. Restoring nervous system structure and function using tissue engineered living scaffolds. Neural Regen. Res. 10 (5), 679-685 (2015).
  2. Tallantyre, E. C., Bø, L., et al. Clinico-pathological evidence that axonal loss underlies disability in progressive multiple sclerosis. Mult. Scler. 16 (4), 406-411 (2010).
  3. Cheng, H. C., Ulane, C. M., Burke, R. E. Clinical Progression in Parkinson Disease and the Neurobiology of Axons. Ann. Neurol. 67 (6), 715-725 (2010).
  4. Johnson, V. E., Stewart, W., Smith, D. H. Axonal pathology in traumatic brain injury. Exp. Neurol. 246, 35-43 (2013).
  5. Hinman, J. D. The back and forth of axonal injury and repair after stroke. Curr. Opin. Neurol. 27 (6), 615-623 (2014).
  6. Li, X., Katsanevakis, E., Liu, X., Zhang, N., Wen, X. Engineering neural stem cell fates with hydrogel design for central nervous system regeneration. Prog. Polym. Sci. 37 (8), 1105-1129 (2012).
  7. Horner, P. J., Gage, F. H. Regenerating the damaged central nervous system. Nature. 407 (6807), 963-970 (2000).
  8. Yiu, G., He, Z. Glial inhibition of CNS axon regeneration. Nat. Rev. Neurosci. 7 (8), 617-627 (2006).
  9. Montani, L., Petrinovic, M. M. Targeting Axonal Regeneration: The Growth Cone Takes the Lead. J. Neurosci. 34 (13), 4443-4444 (2014).
  10. Struzyna, L. A., Wolf, J. A., et al. Rebuilding Brain Circuitry with Living Micro-Tissue Engineered Neural Networks. Tissue Eng. Part A. 21 (21-22), 2744-2756 (2015).
  11. Huebner, E. a, Strittmatter, S. M. Axon Regeneration in the Peripheral and Central Nervous Systems. Results Probl. Cell Differ. 48, 339-351 (2009).
  12. Benowitz, L. I., Yin, Y. Combinatorial Treatments for Promoting Axon Regeneration in the CNS: Strategies for Overcoming Inhibitory Signals and Activating Neurons' Intrinsic Growth State. Dev. Neurobiol. 67 (9), 1148-1165 (2007).
  13. Lie, D. C., Song, H., Colamarino, S. A., Ming, G., Gage, F. H. Neurogenesis in the Adult Brain: New Strategies for Central Nervous System Diseases. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 44, 399-421 (2004).
  14. Gao, Y., Yang, Z., Li, X. Regeneration strategies after the adult mammalian central nervous system injury-biomaterials. Regen. Biomater. 3 (2), 115-122 (2016).
  15. Benfey, M., Aguayo, A. J. Extensive elongation of axons from rat brain into peripheral nerve grafts. Nature. 296 (11), 150-152 (1982).
  16. David, S., Aguayo, A. J. Axonal Elongation into Peripheral Nervous System "Bridges" after Central Nervous System Injury in Adult Rats. Science. 214 (4523), 931-933 (1981).
  17. Shoichet, M. S., Tate, C. C., Baumann, M. D., LaPlaca, M. C. Strategies for Regeneration and Repair in the Injured Central Nervous System. Indwelling Neural Implant. Strateg. Contend. with Vivo Environ. , at http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK3941/ (2008).
  18. Lu, P., Tuszynski, M. H. Growth factors and combinatorial therapies for CNS regeneration. Exp. Neurol. 209 (2), 313-320 (2008).
  19. Curinga, G., Smith, G. M. Molecular/genetic manipulation of extrinsic axon guidance factors for CNS repair and regeneration. Exp. Neurol. 209 (2), 333-342 (2008).
  20. Mehta, S. T., Luo, X., Park, K. K., Bixby, J. L., Lemmon, V. P. Hyperactivated Stat3 boosts axon regeneration in the CNS. Exp. Neurol. 280, 115-120 (2016).
  21. Elliott Donaghue, I., Tam, R., Sefton, M. V., Shoichet, M. S. Cell and biomolecule delivery for tissue repair and regeneration in the central nervous system. J. Control. Release. 190, 219-227 (2014).
  22. Tam, R. Y., Fuehrmann, T., Mitrousis, N., Shoichet, M. S. Regenerative therapies for central nervous system diseases: a biomaterials approach. Neuropsychopharmacology. 39 (1), 169-188 (2014).
  23. Cullen, D. K., Wolf, J. A., Smith, D. H., Pfister, B. J. Neural Tissue Engineering for Neuroregeneration and Biohybridized Interface Microsystems In vivo (Part 2). Crit. Rev. Biomed. Eng. 39 (3), 243-262 (2011).
  24. Han, Q., Jin, W., et al. The promotion of neural regeneration in an extreme rat spinal cord injury model using a collagen scaffold containing a collagen binding neuroprotective protein and an EGFR neutralizing antibody. Biomaterials. 31 (35), 9212-9220 (2010).
  25. Suzuki, H., Kanchiku, T., et al. Artificial collagen-filament scaffold promotes axon regeneration and long tract reconstruction in a rat model of spinal cord transection. Med. Mol. Morphol. 48 (4), 214-224 (2015).
  26. Silva, N. A., Salgado, A. J., et al. Development and Characterization of a Novel Hybrid Tissue Engineering-Based Scaffold for Spinal Cord Injury Repair. Tissue Eng. Part A. 16 (1), 45-54 (2009).
  27. Moore, M. J., Friedman, J. A., et al. Multiple-channel scaffolds to promote spinal cord axon regeneration. Biomaterials. 27 (3), 419-429 (2006).
  28. Tsai, E. C., Dalton, P. D., Shoichet, M. S., Tator, C. H. Synthetic hydrogel guidance channels facilitate regeneration of adult rat brainstem motor axons after complete spinal cord transection. J. Neurotrauma. 21 (6), 789-804 (2004).
  29. Chen, B. K., Knight, A. M., et al. Axon regeneration through scaffold into distal spinal cord after transection. J. Neurotrauma. 26 (10), 1759-1771 (2009).
  30. Jain, A., Kim, Y. -T., McKeon, R. J., Bellamkonda, R. V. In situ gelling hydrogels for conformal repair of spinal cord defects, and local delivery of BDNF after spinal cord injury. Biomaterials. 27 (3), 497-504 (2006).
  31. Harris, J. P., Struzyna, L. A., Murphy, P. L., Adewole, D. O., Kuo, E., Cullen, D. K. Advanced biomaterial strategies to transplant preformed micro-tissue engineered neural networks into the brain. J. Neural Eng. 13 (1), 16019-16037 (2016).
  32. Cullen, D. K., Tang-Schomer, M. D., et al. Microtissue engineered constructs with living axons for targeted nervous system reconstruction. Tissue Eng. Part A. 18 (21-22), 2280-2289 (2012).
  33. Tate, M. C., Shear, D. A., Hoffman, S. W., Stein, D. G., Archer, D. R., LaPlaca, M. C. Fibronectin promotes survival and migration of primary neural stem cells transplanted into the traumatically injured mouse brain. Cell Transplant. 11 (3), 283-295 (2002).
  34. Denham, M., Parish, C. L., et al. Neurons derived from human embryonic stem cells extend long-distance axonal projections through growth along host white matter tracts after intra-cerebral transplantation. Front. Cell. Neurosci. 6 (11), (2012).
  35. Fawcett, J. W., Barker, R. A., Dunnet, S. B. Dopaminergic neuronal survival and the effects of bFGF in explant, three dimensional and monolayer cultures of embryonic rat ventral mesencephalon. Exp. Brain Res. 106 (2), 275-282 (1995).
  36. Mine, Y., Tatarishvili, J., Oki, K., Monni, E., Kokaia, Z., Lindvall, O. Grafted human neural stem cells enhance several steps of endogenous neurogenesis and improve behavioral recovery after middle cerebral artery occlusion in rats. Neurobiol. Dis. 52, 191-203 (2013).
  37. Ren, H., Chen, J., Wang, Y., Zhang, S., Zhang, B. Intracerebral neural stem cell transplantation improved the auditory of mice with presbycusis. Int. J. Clin. Exp. Pathol. 6 (2), 230-241 (2013).
  38. Sinclair, S. R., Fawcett, J. W., Dunnett, S. B. Dopamine cells in nigral grafts differentiate prior to implantation. Eur. J. Neurosci. 11 (12), 4341-4348 (1999).
  39. Tate, C. C., Shear, D. A., Stein, D. G., Tate, M., LaPlaca, M. C., Archer, D. R. Laminin and fibronectin scaffolds enhance neural stem cell transplantation into the injured brain. J. Tissue Eng. Regen. Med. 3 (3), 208-217 (2009).
  40. Yoo, S. J., Kim, J., Lee, C. -S., Nam, Y. Simple and novel three dimensional neuronal cell culture using a micro mesh scaffold. Exp. Neurobiol. 20 (2), 110-115 (2011).
  41. Chen, H. I., Jgamadze, D., Serruya, M. D., Cullen, D. K., Wolf, J. A., Smith, D. H. Neural Substrate Expansion for the Restoration of Brain Function. Front. Syst. Neurosci. 10, (2016).
  42. Cullen, D. K., Wolf, J. A., Vernekar, V. N., Vukasinovic, J., LaPlaca, M. C. Neural tissue engineering and biohybridized microsystems for neurobiological investigation in vitro (Part 1). Crit. Rev. Biomed. Eng. 39 (3), 201-240 (2011).
  43. Struzyna, L. A., Katiyar, K., Cullen, D. K. Living scaffolds for neuroregeneration. Curr. Opin. Solid State Mater. Sci. 18 (6), 308-318 (2014).
  44. Ungrin, M. D., Joshi, C., Nica, A., Bauwens, C., Zandstra, P. W. Reproducible, ultra high-throughput formation of multicellular organization from single cell suspension-derived human embryonic stem cell aggregates. PLoS One. 3 (2), (2008).
  45. Dahotre, N. B., Harimkar, S. Laser fabrication and machining of materials. , Springer Science & Business Media. (2008).
  46. Kutter, J. P., Klank, H., Snakenborg, D. Microstructure fabrication with a CO2 laser system. J. Micromechanics Microengineering. 14 (2), (2004).
  47. Spicar-Mihalic, P., Houghtaling, J., Fu, E., Yager, P., Liang, T., Toley, B. CO2 laser cutting and ablative etching for the fabrication of paper-based devices. J. Micromechanics Microengineering. 23 (6), (2013).
  48. Pacifici, M., Peruzzi, F. Isolation and culture of rat embryonic neural cells: a quick protocol. J. Vis. Exp. (63), (2012).
  49. Cullen, D. K., Gilroy, M. E., Irons, H. R., Laplaca, M. C. Synapse-to-neuron ratio is inversely related to neuronal density in mature neuronal cultures. Brain Res. 1359, 44-55 (2010).
  50. Huang, J. H., Cullen, D. K., et al. Long-Term Survival and Integration of Transplanted Engineered Nervous Tissue Constructs Promotes Peripheral Nerve Regeneration. Tissue Eng. Part A. 15 (7), 1677-1685 (2009).
  51. Katiyar, K. S., Winter, C. C., Struzyna, L., Harris, J. P., Cullen, D. K. Mechanical elongation of astrocyte processes to create living scaffolds for nervous system regeneration. J. Tissue Eng. Regan. Med. , (2016).
  52. Howard, M. A., Baraban, S. C. Synaptic integration of transplanted interneuron progenitor cells into native cortical networks. J. Neurophysiol. 116 (2), 472-478 (2016).
  53. Wernig, M., Benninger, F., et al. Functional Integration of Embryonic Stem Cell-Derived Neurons In Vivo. J. Neurosci. 24 (22), 5258-5268 (2004).
  54. Ganguly, K., Poo, M. Activity-dependent neural plasticity from bench to bedside. Neuron. 80 (3), 729-741 (2013).
  55. Dancause, N. Extensive Cortical Rewiring after Brain Injury. J. Neurosci. 25 (44), 10167-10179 (2005).
  56. Winter, C. C., Katiyar, K. S., et al. Transplantable living scaffolds comprised of micro-tissue engineered aligned astrocyte networks to facilitate central nervous system regeneration. Acta Biomater. 38, 44-58 (2016).
  57. Adewole, D. O., Serruya, M. D., et al. The Evolution of Neuroprosthetic Interfaces. Crit. Rev. Biomed. Eng. 44 (1-2), 123-152 (2016).
  58. Cullen, D. K., Patel, A., Doorish, J. F., Smith, D. H., Pfister, B. J. Developing a tissue-engineered neural-electrical relay using encapsulated neuronal constructs on conducting polymer fibers. J. Neural Eng. 5 (4), 374-384 (2008).
  59. Cullen, D. K., Stabenfeldt, S. E., Simon, C. M., Tate, C. C., LaPlaca, M. C. In Vitro Neural Injury Model for Optimization of Tissue-Engineered Constructs. J. Neurosci. Res. 85, 3642-3651 (2007).
  60. Irons, H. R., Cullen, D. K., Shapiro, N. P., Lambert, N. A., Lee, R. H., Laplaca, M. C. Three-dimensional neural constructs: a novel platform for neurophysiological investigation. J. Neural Eng. 5 (3), 333-341 (2008).
  61. Morrison, B. I., Cullen, D. K., LaPlaca, M. In Vitro Models for Biomechanical Studies of Neural Tissues. Stud. Mechanobiol. Tissue Eng. Biomater. 3, 247-285 (2011).
  62. Vukasinovic, J., Cullen, D. K., Laplaca, M. C., Glezer, A. A microperfused incubator for tissue mimetic 3D cultures. Biomed. Microdevices. 11 (6), 1155-1165 (2009).
  63. Cullen, D. K., Lessing, M. C., Laplaca, M. C. Collagen-dependent neurite outgrowth and response to dynamic deformation in three-dimensional neuronal cultures. Ann. Biomed. Eng. 35 (5), 835-846 (2007).
  64. LaPlaca, M. C., Vernekar, V. N., Shoemaker, J. T., Cullen, D. K. Three-dimensional neuronal cultures. Methods Bioeng. 3D Tissue Eng. , (2010).
  65. Chwalek, K., Tang-Schomer, M. D., Omenetto, F. G., Kaplan, D. L. In vitro bioengineered model of cortical brain. Nat. Protoc. 10 (9), 1362-1373 (2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

TENN

Похожие статьи