Методическая статья

Мульти-отверстие криопробирку Исключает Замораживание Артефакты при мышечной ткани непосредственно погружали в жидкий азот

11.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/55616

⸱

6 апреля 2017 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory for Pig Genetic Improvement and Production Technology, Jiangxi Agricultural University

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол описывает процедуру, чтобы заморозить мышечную ткань, погружая их непосредственно в жидкий азот. Этот протокол также подчеркивает новый криопробирку, которые могут избежать «эффекта» веерной газообразного азота, когда жидкость контактирует азота поверхность ткани образца.

Аннотация

Исследования по физиологии скелетной мышцы сталкиваются с технической проблемой соответствующей обработки образцов, чтобы получить участки с четко видимыми цитоплазматическими отсеками. Другим препятствием является жесткой аппозиция миофибрилл в окружающие ткани. Поскольку процесс фиксации ткани и парафин приводит к усадке мышечных волокон, замораживание является оптимальным средством упрочнения мышечной ткани для секционирования. Тем не менее, обычно встречается проблема, образование кристаллов льда, происходит во время приготовления замороженных срезов из-за высокого содержания воды в мышцах. Протокол, представленные здесь в первую очередь описывает простой и эффективный метод замораживания должным мышечной ткани путем погружения их в жидком азоте. Проблема с использованием жидкого азота в одиночку является то, что он приводит к образованию газового барьера азота рядом с тканью, которая действует как изолятор и препятствует охлаждению тканей. Чтобы избежать этого эффекта «пара одеяла», а пж криопробирка была разработана, чтобы увеличить скорость потока жидкости вокруг поверхности ткани. Это было достигнуто путем штамповки в общей сложности 14 впускных отверстий в стенке флакона. В соответствии с динамикой пузыря, более высокая скорость потока жидкости приводит в небольших пузырьков и меньше шансов образовать газовый барьер. Когда жидкий азот поступает в криопробирку через впускные отверстия, скорость потока вокруг ткани достаточно быстро, чтобы устранить газовый барьер. По сравнению с методом замораживания мышечной ткани с использованием предварительно охлажденный изопентана, этот протокол является более простым и более эффективным и может быть использован, чтобы заморозить мышцы в пропускной способности образом. Кроме того, этот метод является оптимальным для учреждений, которые не имеют доступ к изопентану, что крайне воспламеняется при комнатной температуре.

Введение

Скелетная мышца является наиболее ценным компонентом мяса по производству животного из пищевой и перерабатывающей точки зрения. В мясной промышленности, есть два особенно важный аспект: эффективность роста мышц и качество получаемого мяса. В качестве основного компонента мышцы, мышечные волокна имеют непосредственное отношение к динамике роста и свежему качеству мяса у животных 1. Например, общее количество волокон (TNF), и площадь поперечного сечения волокон (CSAF), в основном определяют мышечную массу и качество мяса; Кроме того , Тип волокна Состав (FTC) сильно влияет на качество свежего мяса 2. Таким образом, манипулирование характеристик мышечных волокон у животных является весьма эффективным методом для повышения рентабельности и основной конкурентоспособности ферм 1.

На сегодняшний день, несколько внутренних и внешних факторов, были идентифицированы, чтобы манипулировать мышечных волокон characteristектронные 1. Эта манипуляция может быть достигнуто за счет целенаправленного отбора животных с определенными генами, такими как миостатин гена у крупного рогатого скота, 3 гена Callipyge у овец, 4 и RYR1 и генов Igf2 у свиней 5. Кроме того , контроль диеты и лечение с определенными гормонами играют важную роль в мышечных волокнах характеристик 6. Таким образом, подход, который сочетает в себе генетические и пищевые факторы могут быть в состоянии улучшить постное содержание мяса и качество мяса. Однако исследования мышечных волокон ограничены в мясной промышленности, так как выяснение структуры мышечных волокон, по-прежнему является проблемой.

свойства мышечного волокна, идентифицируют с использованием гистохимических методов, таких как анализ миозина аденозинтрифосфатазы (АТФ-азы). Этот метод основан на том факте, что ферменты, расположенной в тонких (6-8 мкм) замороженных секциймышечные волокна могут быть химически реагируют с определенными продуктами. Однако, содержание воды в мышцах у свиней, кроликов, мышей и человека больше , чем 75%, независимо от положения (то есть спины, живота или задних конечностей) 7. Такое высокое содержание влаги в мышцах вызывает часто встречается вопрос - замораживание - артефакты при подготовке криосрезов, как описано ранее , 8, 9. В большинстве случаев это практически невозможно правильно заморозить мышечные ткани в производственной линии скотобойни, согласно нашему опыту.

Протокол, представленные здесь описывает простой и эффективный метод, используемый в нашей лаборатории, чтобы заморозить мышечные ткани для cryosectioning в высокой пропускной образом. Момент этого метода является новой криопробиркой, который предназначен для флэша-замораживания мышечной ткани в жидком азоте. Тока рабочий процесс может одновременно облегчить тканизамораживания и обработки для отличной мышечной cryosection, с четко видимым цитоплазматическим отсеком и плотно аппозициями миофибрилл к окружающей ткани. Кроме того, этот протокол может быть применен к широкому спектру вариантов для анализа ткани, потому что жидкий азот не смешивается с тканями.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Текущий метод был создан и подтвержден для сбора и хранения более 1000 образцов мышц для гистологического окрашивания в нашей лаборатории. Все процедуры, связанные с уходом за животными и использование в соответствии с руководящими установленные Министерством сельского хозяйства Китая.

1. Оборудование для сбора проб

  1. Этикетка идентичности образца на каждую криогенной флаконе.
    Примечание: криогенное флакон специально разработано , чтобы заморозить образцы свежей ткани для процедуры cryosection (рис 1А). Пробирки изготовлены из полипропилена в формовочной заводе (рис 1C).
  2. Получить следующее оборудование: жидкий азот в соответствующем резервуаре с жидким азотом, защитные очки или защитную маску, Морозильник перчатки 10 см щипцов, 25 см пинцетом, а Styrofoam охладитель (внутренние размеры: 20 см в длину в ширину х 13,5 см высокий х 12 см ; внешние размеры: 24 см в длину х 16 см в ширину х 15 см в высоту), пластиковая пленка (2,5 см длиной х 0,8 см толщиной в ширину и 0,1 мм),скальпель, и А4 ПВХ привязки крышки (21 см х 29,5 см) (Фигура 1В).

2. Подготовка образцов Muscle

  1. Заполните охладитель Styrofoam с жидким азотом 5 мин перед сбора проб.
    Примечание: большая колонна жидкого азота имеет важное значение, так как часть жидкого азота выкипает и превращается в газ, когда свежие образцы прикоснуться к ней. Для того чтобы уменьшить частоту передачи жидкого азота для пополнения потерь, соответствующего размером Пенопласта охладитель должен быть приобретен заранее в соответствии с количеством образцов.
  2. После того, как образец получаются, аккуратно поместите его на листке А4 ПВХ связывающей крышки и наблюдать направление мышечных волокон.
    Примечание: Здесь мы использовали поперечное сечение длиннейшей мышцы Дорис от первого до последнего поясничного позвонка у свиней. Образцы имеют длину около 12 см, шириной 8 см и высотой 5 см.
  3. Используйте скальпель, чтобы сделать два параллельных надрезов через образец Iп направление мышечных волокон, около 3 см в длину и 0,6 см друг от друга. Обрежьте резанным мышцы в прямоугольник примерно 0,6 см в ширину и 0,6 см в длину высоких х 1,5 см.
    Примечание: Надежность измерения площади поперечного сечения мышечных волокон в основном, зависит от ориентации волокон в врезной мышце.
  4. Используйте 10 см щипцов , чтобы аккуратно поместить образец на кусок полиэтиленовой пленки, с продольной осью вырезанной мышцы параллельно длинной стороне пленки (фиг.2А).
    Примечание: Пластиковая пленка имеет две функции: функция удержания, которая помогает в установлении ориентации мышечных волокон и функции адгезии, которая предотвращает трещины в образце из-за быстрое замораживание.
  5. Использование щипцов, поместить мышечную ткань в нижнюю середину меченого криогенного флакона, только между впускными отверстиями, а затем пробирки плотно закрывают (фигура 2В).

3. Замораживание и хранение Muscle Samples

  1. С помощью пинцета 25 см, быстро погрузить весь криогенный флакон в жидком азоте в предварительно охлажденном охладителе пенополистирола, ожидая, пока жидкий азот не не кипит (примерно 10-20 лет).
    Примечание: криопробирка будет плавать, когда жидкий азот кипит, так тщательно погрузить флакон в кипящем жидком азоте в течение 10-20 с.
  2. Передача образцы мышц в резервуар для хранения жидкого азота или -80 ° C морозильник в течение длительного хранения.

4. Подготовка слайдов

  1. Предварительное охлаждение криостата до температуры между -20 ° C и -22 ° C.
  2. Удаляю старое микротомное лезвие, протереть держатель ножа и стабилизирующую пластину в криостате, установите новое микротомное лезвие в криостате, и установить толщину резания до 8 мкм.
  3. Передача пробы мышц в криогенном флаконе из жидкого резервуара для хранения азота или -80 ° C морозильника до криостата, транспортировки его в жидком азоте или на сухом льде.
  4. Подождите 30 мин для образца для уравновешивания с температурой криостата.
    Примечание: Любое оборудование, которое может касаться образца должен быть предварительно охлаждены, так как высокая температура может вызвать образование кристаллов льда в образце.
  5. Установить образец в держателе образца по оптимальной рецептуре температуры резки водорастворимых гликолей и смол (ОКТ). Вырезать 8 мкм секций.
    Примечание: Регулировка угла резания перпендикулярно к ориентации мышечных волокон, потому что CSAF площадь поперечного сечения мышечных волокон.
  6. Установите секции по направлению к центру при комнатной температуре предметного стекла. Сразу же место слайда в коробку слайдов в -80 ° C морозильник. Не позволяйте слайд высохнуть при комнатной температуре.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Криопробирка иллюстрация и общее лабораторное оборудование для замораживания мышц во время приготовления замороженных срезов показаны на рисунке 1. В криопробирки изготовлены из полипропилена на заводе пресс-формы. Каждый флакон имеет в общей сложности 14 впускных отверстий: один на крышке; другой находится в нижней части; а остальные 12 образуют четыре параллельные линии, каждая с четырьмя отверстиями под углом 90 ° друг к другу. Эти входные отверстия могут ускорить ско...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Здесь мы описываем новую, с несколькими отверстиями для криопробирки замораживания и хранения мышечной ткани для выполнения гистологических оценок функции мышц. Критические модифицированы шагом в этом протоколе является то, что образец в многодырчатой ​​криопробирке непосредственно погружал в жидком азоте. Насколько нам известно, это самый простой и rapidest способ получить отличные замороженные образцы для мышц cryosectioning среди существующих методов замораживания (см репрезентативных результатов).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Нет конфликта интересов, финансового или иного, объявляются авторами.

Благодарности

Этот проект был поддержан Национальным фондом естественных наук Китая (NSFC): 31301950 и 31671288.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Криостат Микротом  Цифровой микроскоп LeicaLeica CM1950
 NikonNikon DS-U3
  Криогенные флаконы    Пластиковая пленкаРазработано нами
Жидкий азотСкальпель
Коммомли
Щипцы
ПинцетМомли Безопасное
стеклоКоммомли
Перчаткидля морозильной камерыКоммили б/у
10 см 25 см

Ссылки

  1. Joo, S. T., Kim, G. D., Hwang, Y. H., Ryu, Y. C. Control of fresh meat quality through manipulation of muscle fiber characteristics. Meat Sci. 95 (4), 828-836 (2013).
  2. Lefaucheur, L. A second look into fibre typing--relation to meat quality. Meat Sci. 84 (2), 257-270 (2010).
  3. Fiems, L. O. Double Muscling in Cattle: Genes, Husbandry, Carcasses and Meat. Animals (Basel). 2 (3), 472-506 (2012).
  4. Cockett, N. E., et al. The callipyge mutation and other genes that affect muscle hypertrophy in sheep. Genet Sel Evol. 37, Suppl 1 65-81 (2005).
  5. Stinckens, A., et al. The RYR1 g.1843C>T mutation is associated with the effect of the IGF2 intron3-g.3072G>A mutation on muscle hypertrophy. Anim Genet. 38 (1), 67-71 (2007).
  6. Brameld, J. M., Buttery, P. J., Dawson, J. M., Harper, J. M. Nutritional and hormonal control of skeletal-muscle cell growth and differentiation. Proc Nutr Soc. 57 (2), 207-217 (1998).
  7. Reinoso, R. F., Telfer, B. A., Rowland, M. Tissue water content in rats measured by desiccation. J Pharmacol Toxicol Methods. 38 (2), 87-92 (1997).
  8. Meng, H., et al. Tissue triage and freezing for models of skeletal muscle disease. J Vis Exp. (89), (2014).
  9. Kumar, A., Accorsi, A., Rhee, Y., Girgenrath, M. Do's and don'ts in the preparation of muscle cryosections for histological analysis. J Vis Exp. (99), e52793(2015).
  10. Meijer, A. E., Vloedman, A. H. The histochemical characterization of the coupling state of skeletal muscle mitochondria. Histochemistry. 69 (3), 217-232 (1980).
  11. Harnkarnsujarit, N., Kawai, K., Suzuki, T. Effects of Freezing Temperature and Water Activity on Microstructure, Color, and Protein Conformation of Freeze-Dried Bluefin Tuna (Thunnus orientalis). Food Bioprocess Technol. 8 (4), 916-925 (2015).
  12. Dubowitz, V., Sewry, C. Muscle Biopsy: A Practical Approach. , Elsevier. Ch. 15 407-422 (2007).
  13. Suvarna, S. K., Layton, C., Bancroft, J. D. Bancroft's Theory and Practice of Histological Techniques: Expert Consult: Online and Print, 7e. , Elsevier. (2008).
  14. Sulaiman, S. A., Kamarudin, N. A. Z. Bubbles Size Estimation in Liquid Flow Through a Vertical Pipe. J Appl Sci. 12 (23), 2464-2468 (2012).
  15. Fukutomi, K., et al. A Study of A Flow through Small Apertures : 2nd Report, Experiments on The Velocity Field. Nihon Kikai Gakkai Ronbunshu B Hen/transactions of the Japan Society of Mechanical Engineers Part B. 53 (496), 3516-3521 (1987).
  16. Shah, M. S., Joshi, J. B., Kalsi, A. S., Prasad, C. S. R., Shukla, D. S. Analysis of flow through an orifice meter: CFD simulation. Chem Eng Sci. 71 (9), 300-309 (2012).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи