Лапароскопическая Техника для последовательного Сборнике печени и мезентериальных лимфоузлов макак

Краткое содержание

Здесь мы описываем минимально инвазивной лапароскопической техники для последовательного отбора проб печени и брыжеечных лимфатических узлов (MLN) в макак, что позволяет увеличить частоту дискретизации, и уменьшает потенциал для хирургических осложнений, по сравнению с выполнением лапаротомии.

Аннотация

В брыжеечных лимфатических узлов (MLN) и печень подвергаются воздействию микробов и микробных продуктов из желудочно-кишечного тракта (ЖКТ), что делает их уникальными иммунологически. Желудочно-кишечный тракт и связанные с ними МЛН сайты ранней вирусной репликации в вирусе иммунодефицита человека (ВИЧ) инфекции и МЛН вероятно важные участки пласта, которые укрывают латентно инфицированные клетки даже после длительной антиретровирусной терапии (АРТ). Печени были показаны, играют важную роль в иммунной реакции на лентивирусы и, как представляется, играют важную роль в оформлении вируса из обращения. Приматы (NHP) модель для ВИЧ и синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИД) точно имитировать эти аспекты ВИЧ-инфекцию и последовательной продольной выборку первичных участков вирусной репликации и связанные с иммунными ответами в этой модели поможет выяснить важные события в инфекции, патогенез , а также влияние различных стратегий вмешательства на эти события. Теклор опубликованных методов образец печени и МЛН вместе включают основные операции и / или аутопсию, что ограничивает возможность исследовать эти важные сайты в последовательном режиме в том же животном. Ранее мы описали лапароскопический метод для сбора МЛН. Здесь мы описываем минимально инвазивную лапароскопическую технику для последовательной продольной выборки печени и MLN через те же двух мест портов, необходимых для сбора MLN. Использование одних и тех же двух портов сводит к минимуму воздействие на животных, так как не требуется никаких дополнительных разрезов. Эта методика может быть использована с повышенной частотой дискретизации по сравнению с основной абдоминальной хирургией и уменьшает потенциал для хирургических осложнений и связанная с ними местными и системными воспалительными реакциями, которые могли бы осложнить интерпретацию результатов. Эта процедура имеет потенциал для облегчения исследований с участием моделей NHP при одновременном повышении благосостояния животных.

Введение

Желудочно - кишечный тракт (ЖКТ) является самой большой поверхностью слизистой оболочки тела и подвергается воздействию множества антигенов , полученных из пищи, патогенов и эндосимбиотических бактериальных сообществ , обычно упоминается как микробиом ^{1, 2.} Брыжеечные лимфатические узлы (MLN) выравнивают желудочно-кишечный тракт и являются основным местом иммунной функции для стимулирования или воспалительные реакций толерогенных в направлении этих разнообразных антигенов. Физическая организация МЛН создает разобщенную систему , которая может реагировать на антигены локально , не вызывая системные реакции ^3. Кроме того , кровь из водостоков GI тракта к печени путем воротной вены перед возвращением в оборот, и, таким образом , подвергается воздействию микробов и микробных продуктов , которые перемещал из желудочно - кишечного тракта в собственной пластинке слизистой оболочки и введенными в кровоток ^4. Печени также функционирует в качестве вторичного лимфоидного органа ай имеет большое количество иммунных клеток, в том числе специализированных макрофагов, чтобы удалить микробы транслоцируется ^{5, 6.} Таким образом, МЛН и печень являются основными иммунные органы подвергаются воздействию синантропных и патогенных бактерий из желудочно-кишечного тракта, а также среда антигенов из других источников, что делает их уникальными и важными с иммунологической точки зрения.

МЛН критические участки для оценки вирусологических и иммунологических эффектов вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) или патогенной обезьяний вирус иммунодефицита (SIV) инфекции, и, вероятно, участвуют в начале распространения ВИО следующего ректального вызова. Gut-ассоциированной лимфоидной ткани , как известно, является основным местом постоянной репликации ВИЧ, несмотря на эффективный контроль виремии современными антиретровирусной терапии (АРТ) ^7. В SIV моделей инфекции, МЛН были показаны, являются важными резервуарами латентного вируса и могутбыть первичным резервуаром ^{8, 9.} Печени также имеет важное значение в лентивирусов инфекции, о чем свидетельствует накопление SIV специфических CD8 ⁺ Т - клеток в печени макак во время острой инфекции SIV ^10. Кроме того, она является основным органом , ответственным за очистку вируса из обращения ^11.

ВИЧ и SIV - инфекции связаны с измененной GI микробиоты, нарушена целостность эпителия ЖКТ и повышение транслокации микробов и микробных продуктов из толстой кишки на периферию и обращения ^{12, 13.} Эти процессы связаны с местной и системной активацией иммунной системы , а также повышенная заболеваемость и смертность у ВИЧ - инфицированные индивидуумов ^14. В SIV - инфекции, транслоцируются бактерия была обнаружена в MLN ^15, в то время как накопление микрофонаrobial продукты в печени было показано , что приводит к воспалению и повреждению органа ^16. Таким образом, в контексте ВИЧ и SIV инфекций, то МЛН и печень могут быть весьма информативными для понимания воспалительных процессов, работающих на GI-резидентах бактерий.

Здесь мы представляем минимально инвазивной лапароскопической техники для последовательного отбора проб MLN и печени в отличных от человека приматов (NHPS). Показано, успешное выполнение этой методики на двух здоровых женщин макак (СУР), отбор проб каждого животного два раза, с 160 дней между каждой операцией. Мы продолжаем использовать эти образцы для оценки и сравнения ключевых лейкоцитов и лимфоцитов в популяции каждого органа с помощью проточной цитометрии, и демонстрируют весьма последовательные данные между двумя временными точками.

Протокол

Животных содержали и воспитывающихся в ассоциации по оценке и аккредитации лабораторных животных международных (AAALACi) аккредитованных объектов, а также все процедуры на животных были проведены в соответствии с процедурами, утвержденными по уходу и использованию комитета Институциональная животных (IACUC) из Университета штата Вашингтон и по Вашингтон, Национальный исследовательский центр Предстоятель.

1. Хирургическая подготовка, анестезии и анальгезии

1. Седативный и индукционные
   1. Седативная макака с внутримышечной инъекцией 10 мг / кг кетамина и 0,015 мг / кг дексмедетомидина (в сочетании в одном шприце). Обеспечить отсутствие вывода рефлексов перед удалением из клетки.
   2. Интубации животного, и поддерживать животное в плоскости общей анестезии с использованием изофлурана (1,0 - 2,5%) и 100% кислорода. См ссылки для получения дополнительной информации относительно интубации и общей анестезии в макак ^17,исх "> ^{18, 19.}
2. Обезболивание Поддержка и мониторинг
   1. Вставьте периферический венозный катетер и обеспечивают внутривенные изотонические жидкости (например, лактат Рингера раствор) со скоростью 5 мл / кг / ч в течение анестезии и хирургическое вмешательства. Применение стерильной глазной смазки, чтобы предотвратить сухость роговицы.
   2. Обеспечить обезболивание, например в виде композиции с замедленным высвобождением бупренорфина (0,2 мг / кг, подкожно).
      Примечание: НПВС (например, мелоксики или кетопрофен), также может быть обеспечено во время анестезиологического восстановления, при условии, что экспериментальный протокол допускает введение NSAID и что животное нормотензивное и хорошо увлажненный во время анестезии.
   3. Монитор глубины анестезии (например , челюсти тон), частоту сердечных сокращений, частоту дыхания, ЭКГ, кровяное давление, пульс оксигенации, конец приливные CO _2, и температуру тела по всей анестезии и хирургического вмешательства.
      Примечание: Когда живот интраназально, животное может hypoventilate.Обеспечение механической вентиляции , если частота дыхания уменьшается, или конец приливного СО ₂ уровня выше 45 мм ртутного столба.
   4. После операции, управлять Атипамезолом (0,15 мг / кг, внутримышечно) для разворота дексмедетомидина.
3. Хирургическое Приготовление
   1. Выполните несколько клизмы теплой водой , чтобы уменьшить объем фекалий в толстой кишке , чтобы помочь визуализации и манипуляции кишечника во время процедуры ^20.
   2. Используйте ножницы с числовым 40 лезвием для удаления волос из операционного поля. Бритье от реберного хребта до лобка и с левой стороны на правый фланг.
   3. Консервант подготовка операционного поля с использованием соответствующих антисептиков, такими как хлоргексидин-чередующихся спиртом или повидон-йод-спиртовыми скрабами.
   4. Поместите животное на операционном столе на его спинке, под углом на полпути между дорсальной и правой боковой лежачее. Свяжите руки и ноги веревкой в ​​выдвинутом положении. Обеспечить окончательный chlorhexiобедать и алкоголь приготовительного когда животное перемещается в операционном и позиционируется для хирургии.

2. хирургия

Примечание: Для получения дополнительной информации о лапароскопии в мелких животных, см ссылка ^21.

1. Лапароскопическая Подготовка инструмента
   1. Драпируйте животное с стерильной фенестрированной драпировкой.
   2. С помощью нестерильного помощника, завернуть цифровую камеру с стерильной драпировкой камеры и подключите кабель к башне. Прикрепите жесткий объем к головке камеры.
   3. Присоедините стерильный свет кабель к жесткой рамке и подключите кабель к источнику света. Баланс белого камеры в соответствии с инструкциями изготовителя.
   4. Закрепить стерильную инсуфлятор трубку к инсуффлятору.
2. Лапароскопическая Вход
   1. Используя # 15 скальпель с, сделать ~ 5 мм ножевого разрез через кожу на глубину брюшной мускулатуры, приложениеroximately 1 - 2 см слева от пупка.
   2. Использование не доминантную руки, поднимите брюшную стенку краниальна к месту пробивающего разреза. С доминирующей рукой, поместите кончик иглы Вереша через разрез и угол кончик краниально.
      Примечание: Угол проникновения иглы Вереша будет варьироваться в зависимости от состояния тела животного. Так, например, в жировой животного, игла Вереша необходимо будет вставлен почти перпендикулярно к брюшной стенке. В тонком животном, игла Вереша должна быть наклонена краниально, чтобы уменьшить риск контакта с внутренностями.
      1. Удерживая вал (не концентратор) иглы Вереша, плотно толкать иглу, чтобы проникнуть через брюшную стенку в брюшную полость. Отчетливый «щелчок» и уменьшение сопротивления будет ощущаться как острый кончик проникает в брюшину и тупой кончик иглы пружин Вереша вперед в брюшную полость.
         Примечание: Если игла проходит надлежащим образом в гое брюшной полости, будет небольшое сопротивление, когда она выдвигается и снимается 1 - 2 см.
   3. Подключение инсуфлятор трубки СО ₂ к игле и открыть запорный кран. Давление в брюшной полости не более чем на 10-12 мм рт.ст. для создания пневмоперитонеума.
      Примечание: Живот достиг идеального вдувание, когда она расширилась симметрично и происходит потеря нормального резкого контура реберных краев. Давление должно обеспечить достаточное пространство для вставки канюли / троакара без риска контакта с внутренностями.
3. Канюля Размещение
   1. После того, как живот полностью интраназален, сделать ~ 5 - 7 мм разрез с скальпелем # 15 через кожу левого краниального живота к брюшной мускулатуре ~ 2 - 4 см хвостовых до последнего ребра.
   2. Поместите 5 мм троакар-канюли сборку через разрез кожи и угла она ~ 45 - 60 градусов caudomedially. Проникнуть брюшную полость на глубину 1-2 см. Screж резьбовой канюли в брюшную полость путем поворота канюлю (~ 0,5 - 1 см) дополнительно на глубину 1,5 - 3 см, и удалить троакар.
   3. Удалите инсуфлятор трубку от иглы Вереша, выключить кран и удалить иглу. Подключение инсуфлятор трубки в канюлю и открыть запорный кран для поддержания пневмоперитонеума на уровне не более 10 - 12 мм рт.
   4. Вставьте жесткий объем через канюлю и в брюшную полость.
   5. Под визуализацией камеры, продолжают делать небольшой надрез с # 15 скальпелем через брюшную мускулатуру и брюшины на предыдущем разрезе кожи, используемый для введения иглы Вереша. Камера используются для визуализации брюшной стороны разреза, чтобы избежать сосудов и свести к минимуму кровотечения.
      Примечание: Убедитесь, что разрез через мышцы и брюшина достаточно велик, чтобы облегчить ввод зонда и экстериоризации брыжейки (~ 0,5 см). Большее Разрез может потребоваться экстериоризоваться mesentчень у животных с повышенным содержанием жира брыжеечного.
   6. Поместите животное в положении Тренделенбурга ²¹ с ногами повышенных примерно в 15 - 30 градусов выше головы. Это необязательно, но может облегчить доступ к брыжеечным лимфатическим узлам толстой кишки, как небольшой кишечному тракт будет двигаться к более черепному положению.
4. Мезентериальная лимфатический узел Биопсия
   1. Под визуализацией камеры, вставьте твердый зонд через брюшной разрез, сделанный на этапе 2.3.5.
   2. Поместите зонд между сальником и кишечником и использовать радикальные движения, чтобы аккуратно смести сальник от кишечника, чтобы обеспечить визуализацию основной брыжейки. Продолжая использовать радикальные движения от хвостового к черепной части живота. Сальник может быть помещен в правой краниальной части живота, так что из операционного поля.
   3. Используйте зонд, чтобы переместить нисходящую ободочную кишку по направлению к левой или правой стенке брюшной полости. Это позволит лучше визуализировать тон брыжейки, чтобы помочь в поиске брыжеечных лимфатических узлов.
   4. С помощью зонда развертки через брыжейки, чтобы определить местонахождение брыжеечные лимфатические узлы вдоль толстой кишки и брыжеечных сосудов.
      Примечание: Толстокишечные узлы проходят по брыжеечной границе толстой кишки, левые колика узлы могут быть найдены вблизи точек ветвления сосудов, а нижние узлы брыжейки могут быть найдены вдоль нижних брыжеечных сосудов. Брыжеечные лимфатические узлы хорошо видны у худых животных. Когда утопают в брыжеечном жире они часто придают слегка поднятый, блестящий внешний вид покрывающую брыжейке и могут быть более более сероватым цветом загара, то окружающим брыжеечной жир. Кроме того, брыжеечные лимфатические узлы, как правило, лежат вдоль лимфатических сосудов и брыжеечных сосудистой сети.
   5. После того, как лимфатический узел идентифицируется, удалить зонд и вставить Мэриленд храповик щипцов в брюшную полость. Используйте пинцет, чтобы понять брыжейки смежны целевой узел. Потяните брыжейки к INCISion, и удалить сферу из канюли.
   6. Выключите инсуффлятор и оставьте канюли крана открыт для сброса давления на живот, чтобы облегчить экстериоризации брыжейки. Потяните брыжейки вне тела через разрез. После того, как выводило возьмитесь брыжейками с изогнутым кровоостанавливающими комариным или анатомическим пинцетом, чтобы обеспечить доступ через разрез.
   7. Определить лимфатический узел (ы) в пределах экстериоризированной брыжейки пальпации для тверже лимфатического узла и / или прямой визуализации Grayer цвета или узелкового появления лимфатического узла.
      1. После идентификации сделать небольшое отверстие (~ 3 - 5 мм) в брыжейке вблизи узла, используя изогнутые кровоостанавливающие зажимы. Бесплатные приложения к брыжейкам с помощью тупой диссекции с изогнутым кровоостанавливающими. Перевязывать сосудистый с 4-0 нерассасывающейся мононитью шва по мере необходимости. Используйте острое рассечение скальпеля, чтобы удалить лимфатический узел. Поместите узлы в Roswell Park Memorial института (RPMI) 1640 налед.
   8. Осмотрите выводили брыжейки кровотечения. Если кровотечение отмечено, обеспечивает соответствующий гемостаз окклюзии сосудов с кровоостанавливающими или лигатурами (4-0 неабсорбируемой мононить шовными), или путем использованием прижигания. Отпустите брыжейки и вдувать живот обратно до 10 - 12 мм рт.ст., чтобы брыжейки вернуться в брюшную полость.
   9. Повторите шаги 2.4.1 через 2.4.8, чтобы получить дополнительные биопсии лимфатических узлов.
5. Биопсия печени
   1. Возвращает таблицу в горизонтальное положение.
   2. Поместите резьбовую канюлю в брюшную полость через разрез, ранее используемый для сбора биопсии лимфатического узла (разреза, сделанный на этапе 2.3.5). Убедитесь, что надрез достаточно большой (~ 5 - 7 мм), чтобы обеспечить размещение канюли без введения троакара. Вставьте жесткий объем через эту канюлю по направлению к краниальной брюшной полости и визуализировать черепной живот и печень.
   3. При визуализации камеры, вставьте биопсию пorceps через канюлю ранее размещенные в левой части живота (черепной разрез, сделанный на этапе 2.3.1).
   4. Для получения биопсии печени, место щипцов биопсии под выбранным краем лепестка печени с подвижной частью челюсти, обращенной к печени, откройте пинцет, и позволить запас, чтобы попасть в открытые челюсти. Убедитесь в том, что ни один сальник не между печенью и биопсийных щипцов. Отрегулируйте положение щипцов и закройте инструмент над требуемой областью выборки.
      1. Поддерживать давление в течение приблизительно 20 - 30 с, чтобы обеспечить гемостаз. С закрытого пинцетом, удалите образец осторожно потянув щипцы через канюлю. Это мягко разрывать биопсии из печени. Поместите биопсию печени в RPMI 1640 на льду.
         Примечание: Размер биопсии печени составляет примерно 5 мм х 2 мм х 2 мм с помощью 5 мм биопсийных щипцов.
   5. Изучите сайт биопсии для кровоизлияния с помощью визуализации камеры. Если наблюдается кровотечение, поместите солевой moistened стерильный ватный тампон через канюлю и оказать давление на место биопсии. В качестве альтернативы, упаковать участки биопсии стерильной гель пены, чтобы помочь гемостаза.
   6. Повторите шаги 2.5.3 через 2.5.5, чтобы получить дополнительные биопсии печени.
      Примечание: Здесь, 3 биопсий на одно животное в процедуре были собраны, которая является достаточной для всех последующих анализов.
6. Повязка
   1. Изучить брюшную полость кровотечения.
      Примечание: Это не произошло до сих пор. Однако, если чрезмерное кровотечение отмечено, определить место кровотечения и обеспечить соответствующий гемостаз с помощью давления с стерильным ватным тампоном или использованием гелем пены.
   2. Выключите инсуффлятор и откройте канюля краны. Слегка ручное давление на живот, чтобы полностью сбросить давление в брюшной полости. Удалите канюли.
   3. Закройте каждый из брюшных разрезов стена с 1 до 2 простых швов на сайт. Рекомендуется 4-0 рассасывающийся шовный.
   4. Выполните блок выплеска путем размещения 0,1-0,3 куб.см бупивакаина в каждом надрез для местной анестезии перед закрытием кожи.
   5. Закройте кожу 1 - 2 захороненных узловыми швами (рекомендуется 4-0 рассасывающийся шовный) для каждого сайта. Ткань клей может быть нанесен.

3. Биопсия печени Обработка и анализ лимфоцит

1. Хранить несколько кусков ткани печени (около 0,5 мм х 0,5 мм х 0,5 мм в размере) в криоконсервации труб, в предпочтительном растворе для хранения РНК и 10% формалин для будущих молекулярных и гистологических анализов.
   1. Поместите оставшиеся биопсии печени в 50 мл среды RPMI 1640 с добавлением 1x пенициллина / стрептомицина, 40 мкг / мл коммерчески доступного раствора коллагеназы и 4 мкг / мл ДНКазы в стерильном 250 мл пластиковую чашку с крышкой. Перемешивает энергично с помощью магнитной мешалки и мешалкой в ​​течение 1 ч при 37 ° С.
2. Равномерно распределяют путем выливания переваренной ткани. Grинд расщепленной ткани (со стадии 3.1.1) в течение двух 70 мкм фильтров вписываться в двух 50 мл конических пробирок в суспензию отдельной клеток с использованием конца стерильных 5 мл шприца. Довести объем обеих труб до 50 мл в среде RPMI 1640 с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки и 1x пенициллина / стрептомицина (R10).
3. Центрифуга клетки при 840 мкг в течение 6 мин при температуре 4 ° С. Слейте супернатант. Концентрат клеток в один 50 мл конической трубки путем суспендирования клеток из обоего труб в 5 мл R10 и объединения в один 50 мл конической пробирки. Доведите объем до 50 мл с помощью R10. Граф клеток с помощью гемоцитометра, чтобы определить клеточный выход.
   1. Центрифуга клетки при 840 мкг в течение 6 мин при температуре 4 ° С. Ресуспендируют клетки в 1 мл R10, равномерно распределить на две 5 мл круглодонных полистироловых пробирок и довести объем каждой пробирки до 4 мл с R10, для ориентации> 500000 клеток в каждой пробирке.
4. Центрифуга клетки при 840 мкг в течение 6 мин при температуре 4 ° С. Слейте эльupernatant и ресуспендируют осадок клеток в 4 мл физиологического раствора с фосфатным буфером (PBS). Центрифуга при 840 мкг в течение 6 мин при температуре 4 ° С.
5. Декантируйте супернатант и ресуспендирования клеток в 100 мкл PBS на вортексе мягко. Добавить 1,5 мкл фиксируемой мертвой клетки пятно. Инкубирую при комнатной температуре в течение 5 мин.
6. Добавьте следующие неразбавленным поверхностные окрашивания антител в титрах, рекомендованных производителем: CD45-PerCP (клон D058-1283), CD3-PE-CF594 (клон SP34-2), CD20-PE-Cyanin5 (клон 2Н7), CD4-BV605 ( клон ОКТ4), CD8-BV570 (клон РПА-Т8), и CD14-BV785 (клон M5E2). Инкубируют при температуре 4 ° С в течение 20 мин.
7. Добавить 4 мл PBS и центрифуге при 840 мкг в течение 6 мин при температуре 4 ° С. Декантируйте супернатант и ресуспендирования клеток в 250 мкл 1% параформальдегида в PBS.
   Внимание: параформальдегид является токсичным. Используйте соответствующие средства индивидуальной защиты.
8. Анализ клеточных популяций с использованием проточного цитометра как описано в ссылке ^22.

Результаты

Подробные методы обработки собранных лапароскопии MLN, а также клеточные выходы и частота лейкоцитов в этих органах были ранее сообщались , ^13. На рисунке 1 показаны данные сотовой урожайности и жизнеспособности , сравнивающие MLN и биопсии печени , собранных в двух временных точках 160 дней за исключением двух здоровых женщин RMs с использованием этой лапароскопической техники. Мы обнаружили , что клеточный выход из MLN была значительно выше , чем из печени (р = 0,0021), в среднем 33,5 х 10 ⁶ и 6,74 × 10 ⁶ клеток , полученных, соответственно. Мертвые клетки Окрашивание и анализ методом проточной цитометрии показали, что> 90% клеток, выделенных из обоих органов были жизнеспособными.

С помощью проточной цитометрии, мы оценили и сравнили обилие лейкоцитов и лимфоцитов в MLN и печени. Представитель схемы стробирования для печени показана на + клеток, и , наконец , CD3 ⁺ клеток. Из популяции CD3 ^+, мы оценивали распространенность CD4 ⁺ и CD8 ⁺ Т - клетки, в то время как мы оценивали содержания из CD14 ⁺ и CD20 ⁺ клеток из CD3- популяций. Представитель проточной цитометрии участков , показывающих CD45 ⁺ и CD3 ⁺ популяцию из MLN и печень обоих животных в день 0 и дня 160 показаны на рисунке 3, а на рисунке 4 показаны лейкоциты и лимфоциты содержаний для двух выборок два животных. МЛН показали значительно более высокие изобилие CD45 ⁺ клеток , чем делали печень ( в среднем 76,9% и 7,66% жизнеспособных клеток соответственно, P = 0,0002). Не удивительно, что МЛН показали значительно более высокие пропорции CD3 ⁺ Т - клеток (P0; 0,0001) и CD4 ⁺ Т - клетки (P = 0,0004). И наоборот, печень была значительно обогащенные для CD14 ⁺ лейкоцитов по сравнению с MLN (P = 0,0036). МЛН показали более высокие средний CD8 ⁺ Т - клеток, но это не было статистически значимым. Удивительно, но для этих двух животных оба органа продемонстрировал сходные содержания клеток CD20 ⁺ В. Клеточные выходы и содержания различных лейкоцитов и субпопуляции лимфоцитов из MLN в этом исследовании подтвердило ранее сообщались значение ^23.

Рисунок 1. Общая Клеточная Выход (вверху) и Жизнеспособность клеток (снизу) от Серийно Собранный MLN и печени Биопсию. МЛН показали значительно более высокие урожаи клеток, чем делали печень. Тем не менее, оба образца типа представлены широкие ячейки для последующих анализов. Жизнеспособность клеток, измеренный методом cytom потокаetrically с использованием фиксируемых мертвые клетки амина пятно, показал, что оба образца типа, как правило, получали> 90% жизнеспособность клеток после диссоциации ткани. Столбики ошибок представляют стандартное отклонение между образцами. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2. Представитель проточной цитометрии Gating стратегии. Во-первых, агрегированные клетки были исключены, с последующим отбором только жизнеспособных клеток после окрашивания с использованием фиксируемых мертвых клеток амина пятно. Далее, CD45 ⁺ лейкоциты были выбраны, с последующим отбором CD3 ⁺ Т - клеток. Из популяции CD3 ^+, анализировали CD4 ⁺ и CD8 ⁺ Т - клетки. Из CD3 ^- населения, CD14 ⁺ и CD20 ⁺ клетки анализировали. Thi s стратегия стробирования была также использована для МЛН. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3. Поток цитометрии участки из MLN и печени двух животных Продольно. МЛН и образцы печени были собраны 160 дней друг от друга для обоих животных. (А). МЛН CD45 ⁺ клетки (лейкоциты); (Б) Печень CD45 ⁺ клетки (лейкоциты); (С) МЛН ⁺ CD3 ⁺ клеток (Т - клетки); (D) Печень клеток CD3 ⁺ (Т - клетки). Для обоих животных, то МЛН показали более высокие пропорции CD45 ⁺ и CD3 ⁺ клеток по сравнению с печенью. Через время, частоты этих популяций были одинаковы для обоих животных.s / ftp_upload / 55617 / 55617fig3large.jpg»целевых =„_blank“> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4. Частоты CD45 ⁺ клетки (слева) и различные лейкоцитарные и субпопуляции (справа) Через 23 индивидуальных выборок. В MLNs отображаются значительно большие частоты CD45 ^+, CD3 ^+, и CD4 ⁺ клеток, в то время как печень показали значительно более высокие частоты CD14 ⁺ лейкоцитов, демонстрируя уникальные функции каждого органа. Столбики ошибок представляют стандартное отклонение между образцами. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Обсуждение

Здесь мы демонстрируем минимально инвазивный метод для последовательного сбора МЛН и биопсии печени, которые имели показатель успеха 100% в этих и других животных, не описанных в данном исследовании. Кроме того, использование этого метода на одних и тех же животных во времени не было связано с какими-либо побочными эффектами. В самом деле, не было никаких осложнений в результате использования этой методики в других когорт животных, которые были инфицированы ВИО, обезьяний / вируса иммунодефицита человека (SHIV) или вируса Зика (неопубликованные данные). Кроме того, эта операция оказалась успешной, даже у животных, которые ранее подверглись крупной абдоминальной хирургии, а также в животных с тромбоцитопенией (неопубликованные данные). Мы показали, что эти образцы могут быть собраны через те же два порта путем изменения местоположения камеры при переключении из MLN в печени избежать необходимости в дополнительных надрезов. Факторы , влияющие на сбор МЛН уже сообщалось ранее ^13.

До четырех сборников 3 МЛН и 3 биопсии печени каждого был проведен во время на отдельных животное без осложнений, изменения в показателях успеха, или изменения в собранных данные. Кроме того, эта лапароскопической техники коллекция / печени МЛН успешно сочетать с другими процедурами, такими, как сбор периферических лимфоузлов, эндоскопических верхних и нижних биопсий GI, аспирации костного мозга, спинномозговой сбора жидкости и венепункции в то же анестезирующего случае позволяющей обширной оценки вирусологические и иммунологические реакции в последовательной манере (неопубликованные данные).

Вся процедура обычно занимает 30 - 45 минут, чтобы закончить и осуществляется через два ~ 0,5 см надрезы. У тучных животных, это может быть необходимо, чтобы сделать больший разрез (~ 1 - 1,5 см), чтобы восстановить MLN через и может потребоваться дополнительное время для завершения. Животные с большим мезентериального жира часто требует значительного опыта в гifferentiate МЛН из окружающего жира. МЛН часто встречаются вдоль мезентериальных сосудов и, как представляется, более распространены вблизи точек ветвления в сосудах. Одним из важнейших аспектов этого метода является то, что она требует выбранный MLN, чтобы иметь достаточную подвижность в брыжейки, чтобы быть выводили через разрез брюшной стенки. В результате, этот метод не может быть использован для сбора МЛН близко к корню брыжейки. В связи с увеличением, это в разы легче идентифицировать МЛН с камерой, и захватывая в непосредственной близости от МЛН может помочь с расположением и идентификации узла после его выводили.

Использование положения Тренделенбурга не всегда может потребоваться для сбора МЛН, и если МЛН могут быть легко получены без использования позиции Тренделенбурга это может сделать биопсию печени легче, поскольку это позволит предотвратить органы от смещения краниально. Время от времени, после размещения в Тренделенбурга положение, печень смещается вверх к диафрагме и должен аккуратно манипулируют в исходное положение до сбора биопсии. По мере того как порт для размещения коллекции MLN находится слева, биопсия печени, как правило, взята из левой боковой и левой медиальной доли печени, поскольку они находятся ближе к канюле.

Собранные МЛН и биопсия печени при условии, урожаев широких клеток для различных последующих анализов и показала высокую жизнеспособность собранных клеток. Здесь клетки окрашивали для проточной цитометрии анализа лейкоцитов и лимфоцитов населения, а также основные различия между этими двумя важными иммунными органами были выяснены. Например, МЛН были высоко обогащены CD4 ⁺ Т - клетки по сравнению с печенью из - за важность MLN в качестве центральных точек для сбора и распространения адаптивных иммунных ответов, а также на важность CD4 ⁺ T для управления воспалительными и толерогенные ответы на среду антигенов, полученные из пищевого рациона и GI-резидентов микроорганизмовs = "Xref"> 24. Тем не менее, печень была значительно обогащенные для CD14 ⁺ лейкоцитов по сравнению с MLN. CD14 экспрессируется преимущественно на моноцитах и макрофагах и является ключевым компонентом рецепторного комплекса для бактериального липополисахарида (LPS) ^25. Действительно, увеличение плазменной концентрации растворимого CD14 связаны с микробной транслокации и активации иммунной системы у ВИЧ и SIV патогенных инфекций ^26. Таким образом, более высокие частоты CD14 ⁺ лейкоциты в печени , вероятно , является результатом большей бактериальной нагрузки в этом органе по сравнению с MLN.

Здесь мы демонстрируем быстрое и минимально инвазивной хирургической техники для последовательного сбора МЛН и биопсии печени, используя только две небольшие надрезы для лапароскопической записи, не привело к каким-либо неблагоприятных последствий. Эти образцы обеспечивают полезный путь для оценки ключевых процессов иммунологических, вирусологических и микробиологических, которые берут пнулисе в MLN и печени, которые являются отдельными и уникальными от системного иммунитета. Точно так же, биопсия печени имеет решающее значение для долгосрочной оценки последствий ВИЧ / SIV, лекарственной терапии, и транслокаций микробов, которые часто объединяются , чтобы вызвать существенное повреждение печени ^16. Кроме того, поскольку МЛН печень и иммунные органы подвержены желудочно-кишечный микробиоценоз, способность оценивать иммунитет в этих органах через время обеспечивает отличную платформу для понимания той роли, которую играет микробиом в поддержании иммунного гомеостаза хозяина. Взятые вместе, оценка печени и МЛН имеет важное значение в контексте вакцин и терапевтических эффективностей, SIV вирусного клиренса резервуара и общего иммунитета слизистых оболочек. Возможность сбора этих образцов с помощью минимально инвазивного подхода означает, что существует меньший риск воспаления, связанные с процедурой, чем существует в настоящее время опубликованных методик и меньшим воздействием на физиологии животных. В фуры, мы будем оценивать потенциал, чтобы объединить коллекцию МЛН и печени с коллекцией селезенки через те же два места порта, чтобы обеспечить выборки другой важной и отдельной части иммунной системы, которая, как было показано, чтобы играть важную роль в ряд моделей заболеваний.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Artficial Tears Lubricant Ophthalmic Ophthalm Мазь	Patterson Veterinary	97-890-8152
Priority Care Chlorhexidine 2% Scrub	Patterson Veterinary	07-842-6153
Vedco Alcohol, изопропил 70%	Patterson Veterinary	07-869-6434
Vedco Vetadine Scrub	Patterson Veterinary	07-869-6772
Hospira Lactated Ringer's 250 мл	Patterson Veterinary	07-800-9325
Подростковая лапаротомия Хирургическая простыня	Medline	DYNJP3004
доступ 40 л Insufflator	Dyonics	7205832
300XL ксеноновый источник света	Dyonics	7206084
460P 3 – ПЗС-цифровая камера с диаоникой головки		72200086
универсальной драпировкой камеры, 7" x 96"	Услуги эндоскопической поддержки	ESS-6920
Универсальный световод, 7,5 футов	Услуги эндоскопической поддержки	США. OU225
Инсуффляторная трубка	Эндоскопические вспомогательные услуги	TM-102
	Многоцелевой жесткий	эндоскопический эндоскопический
		B10-0025-00
Жесткий эндоскопический	эндоскопический эндоскопический аппарат	B30-0071-00
Игла Вересса, 2 мм x 80 мм;	Услуги эндоскопической поддержки	8302.08
Твердый зонд с маркировкой, 5 мм x 320 мм	Услуги эндоскопической поддержки	8383.661
Мэриленд Захватывающие и рассекающие щипцы с храповой ручкой двойного действия, 3,5 мм x 240 мм	Эндоскопические вспомогательные услуги	8390.2054
Биопсийные щипцы, 3,5 мм x 310 мм	R. Wolf	8391.4063
Пластиковая резьбовая канюля с инсуффляторным портом, 3,5 мм x 60 мм	Эндоскопические вспомогательные услуги	8903.072
Пластиковая резьбовая канюля с инсуффляторным портом, 5,5 мм x 60 мм	Эндоскопические вспомогательные услуги	8919.333
Троакерская эндоскопия с тупым наконечником	Вспомогательные услуги	8903.101
Пирамидальный троакар	Эндоскопия Вспомогательные услуги	8903.121
CO2	Airgas	CD USPE
RPMI 1640	Fisher Scientific	SH30027FS	с L-глутаминовой
РНКболее поздний стабилизирующий раствор	ThermoFisher Scientific	AM7021
Пенициллин-стрептомицин	Sigma Aldrich	P4333
Liberase TM Research Grade	Sigma Aldrich	5401119001	Коммерчески доступный коллеганзовый раствор
Dnase I из бычьей поджелудочной железы	Sigma Aldrich	D5025
70 &микро; m клеточные фильтры	Morganville Scientific	CSS0200
5 мл Шприц	BD	309646
50 мл Конические центрифужные пробирки	ThermoFisher Scientific	339652
Фетальная бычья сыворотка	Fisher Scientific	SH3007003
5 мл Круглодонные полистирольные пробирки	Fisher Scientific	14-959A
PBS	Fisher Scientific	SH3025601
LIVE/DEAD Aqua Исправляемый набор для окрашивания мертвых клеток	ThermoFisher Scientific	L34957	Аминный окрашиватель для мертвых клеток
CD45-PerCP (клон D058-1283)	BD Biosciences	558411
PE-CF594 Мышь anti-Hu CD3 (клон SP34-2)	BD Biosciences	562406
BV605 Мышь Anti-Hu CD4 (клон OKT4)	Biolegend	317438
APC-H7 Мышь Anti-Hu CD8 (клон SK1)	BD Biosciences	560179
PE-Cy5 Мышь Anti-Hu CD20 (клон 2H7)	BD Biosciences	555624
BV786 Мышь Anti-Hu CD14 (клон M5E2)	BD Biosciences	563698
16% ПАРАФОРМАЛЬДЕГИД AQ SOLUTN	Fisher Scientific	50-980-487
LSR II Проточный цитометр	BD	NA