Method Article

Оценка первичного взрыва эффекты в пробирке

DOI:

10.3791/55618

⸱

September 18th, 2017

 ,  , 
1Department of Bioengineering, Imperial College London

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Понимание, как клетки модулируются под воздействием ударных волн может помочь определить механизмы за травмы, вызвали взрыв событий. Этот протокол использует заказные шок труба оборудование обращаться клеток монослои ударных волн в диапазоне давлений и определить последующее воздействие на жизнеспособность клеток.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Воздействие взрыва события может привести к тяжелой травмы для жизненно важных органов, таких как легкие, уши и мозг. Понимание механизмов такой взрыв индуцированной повлекших за имеет большое значение, учитывая недавние тенденции к использованию взрывчатых веществ в современной войны и инцидентов, связанных с терроризмом. Чтобы полностью понять взрыв индуцированного повреждения, мы сначала должны быть способны воспроизвести события такого взрыва в управляемой среде с использованием воспроизводимость метода. В этот метод, с помощью трубки оборудование ударных, ударных волн в диапазоне давлений могут распространяться на живых клеток, выращиваемых в 2D, и маркеры жизнеспособность клеток могут быть проанализированы сразу, используя assay индикатора окислительно-восстановительные и флуоресцентных изображений живых и мертвых клеток. Этот метод показал, что увеличение избыточного давления взрыва пик до 127 кПа может стимулировать значительное падение в жизнеспособность клеток по сравнению с необработанными элементов управления. Испытательные образцы, не ограничиваются адэрентных клеток, но может включать клеточных суспензий, образцы всего тела и тканей, путем незначительных изменений в установки трубки шок. Тиражирование точные условия, которые тканей и клеток опыт при воздействии на событие подлинного взрыва трудно. Такие методы, как один, представленные в этой статье может помочь определить пороговые значения ущерба и определить транскрипционный анализ и эпигеномные изменения внутри клеток, возникающих от воздействия ударной волны.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

С последние тенденции к использованию самодельных взрывных устройств в современной войны и террористических действий на гражданских лиц понимание воздействия взрывоопасных событий на человеческое тело имеет большое значение. Травмы, полученные в результате воздействия взрыва события может быть смертельной и смертоносных, с физических процессов травмы, будучи разделены на четыре категории. Результат первичного повреждения от прямого воздействия ударной волны, который локально взаимодействует с телом на основе сжимающих и впоследствии экспансивного, вызывая нарушение оболочек и мягких тканей1. Вторичные травмы включают тупой травмы или проникающие раны, вызванные воздействие с низкой массы объектов, propelled ударной волны на высокой скорости. Третичный травмы происходят, когда взрывная волна имеет достаточно энергии, чтобы бросить объектов высокой массы или лиц против объектов. И наконец четвертичные взрыва травмы определяются другие различные травмы, которые не подходят другие категории, например flash ожоги2. После воздействия на такие события взрыва первичный травм включают черепно-мозговой травмы3,4,5, heterotopic окостенение6,7, взрыв легких травм8, потеря слуха 9и другие10.

Часто наблюдается сигнала от взрыва событий является волна Фридлендер, представляющих на свободном поле, в отличие от закрытых пространство, взрыв. Осциллограммы состоит из взрыв фронт, который может быть определен как резкий и быстрый рост под положительным давлением. Это сразу же после взрыва Ветер воздуха, движущихся на высокой скорости и волна выпуска, что уменьшает давление ниже атмосферного уровней. Частичный вакуум остается в регионе первоначального взрыва, что приводит к медленной обратного потока воздуха. В Тяни Толкай движения взрыв волна1результате положительной и отрицательной фазы волны (рис. 1A). Чтобы помочь прояснить механизмы за первичного взрыва травмы, экспериментальные модели были созданы для получения сигналов, например Фридлендер волна, которая клеток и тканей столкнется при воздействии на событие подлинного взрыва. Нынешние системы, перечисленные в литературе включают ударной трубы11,12,13,14,,1516,17, barochambers18,19, Кольский бар20, передовые взрыва тренажеры21, бар давления Сплит Хопкинсон22и отдыха альтернативных взрыва события в управляемой среде с использованием тетранитрата пентаэритрита23. Несмотря на широкий спектр моделей доступны многие переменные влияют на травмы, полученные от взрыва волн, включая предварительного напряжения, применяется к и механических свойств, типов индивидуальных клеток или тканей под оценки24. В то время как изучение тканей или органов может пролить свет на ткани деформации и грубые морфологические изменения, понесенные в результате взрыва событий, анализ на клеточном уровне может раскрыть транскрипционный анализ и эпигеномные изменения под влиянием ударной волны.

Эта статья методы описывает способ распространения ударной волны в диапазоне давлений над живой клетки в монослое. Это позволяет для непосредственной характеристике жизнеспособности клеток, в которых разъясняются потенциальные пороговые значения ущерба от ударной волны. Кроме того жизнеспособных клеток могут быть возвращены к условиям стандартной культуры, и долгосрочные биологические эффекты от взрыва события могут быть оценены. Протокол ниже описываются два методы жизнеспособность клеток, которые могут быть использованы на клетки в культуре.

figure-introduction-1
Рисунок 1: Приближение волны Friedlander. (A) приближение Фридлендер волны наблюдается на датчик 3 на трубе шок. (B) репрезентативных данных показаны профили различных давление наблюдается на датчики 1, 2 и 3 на трубе шок. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Культура клеток и пробоподготовки

  1. получить соответствующую ячейку строки (например, клеток дермального сосочка).
    Примечание: Текущий протокол был разработан для адэрентных клеток, с крыса дермального сосочка фибробластов изолированы от используется в качестве модели вибриссов.
  2. Культура клетки в T-75 колбу, содержащий минимум основных средних α (MEM) дополнена плода бычьим сывороточным 10% и 1% пенициллин стрептомицина. Держите клетки на условиях стандартной культуры 37 ° C и 5% CO 2 в увлажненной среде до тех пор, пока они достигают 80% впадения.
  3. Аспирационная среднего и вымыть клетки дважды в Дульбекко ' s фосфат амортизированное saline (PBS). Отделить клетки из колбы, инкубации их в 2 мл трипсина/ЭДТА в стандартных условий для 5 минут кратко убедитесь, что клетки успешно отделить от колбу с помощью микроскопа контраст света/фаза (с 10 X объектив культуры ).
  4. Добавить 4 мл питательной среды для нейтрализации реакции trypsinization. Суспензию клеток передавать пластиковых пробирок 15мл.
    5. G
  5. центрифуг на 200 x 4 мин для пеллет клетки. Медленно аспирационная супернатанта, стараясь не выбить гранулы. Вновь приостановить гранулы в 5 мл среды.
  6. Передавать чистый Горяева Алиготе 20 мкл суспензии клеток и подсчитать количество ячеек с помощью микроскопа с 10 X объектив.
  7. Подготовить клетки для взрыва, поставив три блюда 35 мм внутри блюдо 90 мм. Маркировать их надлежащим образом. Добавить 2 мл среды к каждому блюду 35 мм и семян в общей сложности 5 х 10 4 клетки на блюдо, распространение ячейки равномерно вокруг блюдо. Инкубировать экспериментальных образцов на ночь в стандартной культуры условий для адекватного клеток вложения перед ударной волны облучения.
    Примечание: Для флуоресцентных изображений, клетки быть посеяны в на стерильных стеклянных coverslips.

2. Шок трубки сборки

figure-protocol-1
Рисунок 2 : EVOC Рог и шок трубки Ассамблеи. (A) изображение EVOC буровой установки. (B) схема аппарата трубки шок. Шок трубки измерения включают внутренний диаметр 59 мм, Общая длина, включая EVOC Рог, 4.13 м. Длина ведомый трубки и итоги Рог EVOC 2,71 м. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

  1. Носить ботинки работы стали мыс и лаборатории пальто во время процедур Ассамблеи.
  2. Вставить два выравнивание баров через отверстия для двух болтов нашли в горизонтальной плоскости выхода фланца. Поместите лист прокладки Нитрильный каучук конца выравнивание полосы так, что он сидит между фланцем розетки и Рог ex vivo орган культуры (EVOC).
    Примечание: EVOC Рог является специально разработанный светильник предназначен для использования с Петри 35 мм ( рис. 2A).
  3. Присоедините EVOC rig к розетке фланец трубки шок арматуре за выравнивание баров, обеспечение того, что он ориентирован правильно так, что раздел, содержащий Петри расположен на своей базе.
  4. Вставьте четыре M24 болтов и шайб в оставшиеся отверстия. Позиция гайки так, что они касаются фланца.
  5. Плотно закрепите гайки и болты последовательно в диагонали симметричной моды хотя визуально проверка, что успешно присоединились EVOC Рог и шок трубки.
  6. Прикрепите датчик давления EVOC Рог и подключить его к текущему источнику с помощью кабеля датчика. Затем с помощью BNC кабель, подключите источник тока к осциллографу.
  7. Убедитесь, что все выпуска клапанов и поток управления на шок трубки закрыты. Откройте строку встроенных внешних сжатого воздуха и вручную поверните регулятор давления по часовой стрелке для зарядки электромагнитный для 2,5 бара
  8. Открыть предохранительный клапан на бутылке сжатого газа, повернув его против часовой стрелки 180°.
  9. Медленно поворачивайте регулятор давления, расположенный на вершине газобаллон, по часовой стрелке, чтобы увеличить давление на приблизительно 15 бара
    Примечание: Параметр точки этот регулятор должен быть немного выше самых высоких давление разрыва толстой диафрагмы, которая должна использоваться в эксперименте.
  10. Подготовить диафрагмы путем разрезания 0,125 мм толстой пластиковый лист на квадраты, 10 см х 10 см.
    Примечание: Толщина диафрагмы будет коррелируют с разрывной давлением, изменяя пик давления ударной волны (т.е., толще диафрагмы приведет к ударной волны с более пиковое давление; Таблица 1).
< таблица fo:keep-together.within-страницы = «1» > майлара диафрагмы размеры (см) Разрывное внутреннее давление (бар) диапазон 3 датчика давления (кПа) 10 x 10 x 0,023 2 ± 0,2 47 ± 7,5 10 x 10 x 0,050 4 ± 0,2 72 ± 7,5 10 x 10 x 0,125 9,5 ± 0,5 127 ± 12,5 < / t состоянии >

Таблица 1: взрыв давление соответствующее диафрагму толщиной и пиковое давление.

  1. создать ручки из ленты, прикрепите их к верхней и нижней части диафрагмы и использовать их для тщательно положение диафрагмы рядом с передней малый фланец затвор камеры. Убедитесь, что диафрагма прямой и правильно позиционируется перед закрытием затвора.
  2. Обеспечить это с использованием четырех M24 болтов и гаек. Плотно затяните гайки и болты последовательно в диагонали симметричной моды.

3. Подготовка клетки просто до воздействия ударной волны

  1. Подготовка ткани Ламинарный шкаф, выполняя ультрафиолетовой стерилизации. Очистите его с дезинфицирующего раствора и 70% этанола. Собрать все предметы, необходимые для обработки клеток до до/после-ударные волны облучения и поместите их в стерильных Худ.
    Примечание: Это включает в себя свежие среднего, клей газа проницаемой мембраны, стерильными ножницами, пипетки и пипетки советы.
  2. Передачи одного Петри 90 мм, содержащий три экспериментальных образцов из инкубатора в стерильных Худ.
  3. Вырезать клей газа проницаемой мембраны лист (см. Таблицу материалов) в шести квадратов, таким образом, что каждый является достаточно большой, чтобы покрыть в верхней части одной 35 мм Петри.
  4. Аспирационная среднего от 35 мм Петри, поместите крышку на одной стороне и покрытия с двумя разделами сцепления газ проницаемой мембраны, обеспечивая плотное прилегание между мембраной и краем блюдо.
  5. Передать образец EVOC Рог и закрепите его к основанию прибора таким образом, чтобы в верхней части блюдо выравнивается с внутренней базой трубки шок.

4. Ударные операции трубка

  1. носить слуха, защитные очки, сапоги безопасности и пальто лаборатории при герметизации труб системы шок.
  2. Поверните ручку управления потоком на регулятор по часовой стрелке, позволяя газового потока в гибкий шланг, соединяющий баллон для сжатого воздуха к трубе шок.
  3. В нижней части панели управления, выберите либо " двойной затвор " впуска для краткосрочных шок wave или " трубка драйвер " впуска для длительности повышенной волны.
  4. Выключатель на источник питания постоянного тока и осциллограф для приобретения данных осциллограммы. Настроить осциллограф дискретизации до 50,0 мс/сек, запись длиной 1 М балла. Установить диапазон 50 МВ для стрельбы на 2 бар и 100 МВ для выше 4 бара
  5. Включить огни безопасности, с помощью переключателя на стене напротив панели управления.
    Примечание: Это говорит других исследователей не для того, чтобы войти в комнату, когда шок трубка заряжается.
  6. Включите электромагнитный коробки управления закрыть соленоида.
    Примечание: Эта функция безопасности закрывает клапан, расположенный на двойной затвор камеры, позволяющие системе заряжаться.
  7. На панели управления, медленно откройте управление потоком, повернув ручку против часовой стрелки, чтобы постепенно увеличить давление в камере сжатия. Следить за давлением, с помощью панели управления.
  8. После того, как давление разрыва диафрагмы будет достигнуто, будет разрыв диафрагмы и " Порево " будет услышан. Быстро закрыть элемент потока управления, поворачивая ручку.
    Примечание: Ударная волна будет путешествовать вниз по трубе, над образец клеток и конец трубки.
  9. Открытый электромагнитный поворотом выключателя на блоке управления соленоида и выключить свет безопасности (с помощью переключателя на стене напротив панели управления).
  10. Передать образец клеток стерильных капот, удалить клей газа проницаемой мембраны и заполнить блюдо с 2 мл свежего роста средних. Клетки могут быть использованы сразу для оценки, как описано в шаге 5, или вернулся в инкубатор для долгосрочных исследований.

5. Жизнеспособность клеток

  1. оценки жизнеспособности клеток после воздействия ударной волны, используя сочетание пробирного индикатора окислительно-восстановительные и флуоресцентных изображений живых и мертвых клеток.
    Примечание: Для флуоресцентных изображений, клетки должна быть заполнена на стерильных стеклянных coverslips во время Секция 1: клетки культуры и образец подготовки. Они могут быть размещены в пределах 35-мм Петри.
  2. Передачи 200 мкл Реагента индикатора окислительно-восстановительного (см. Таблицу материалов) к каждой экспериментальной блюдо непосредственно после пополнения их с 2 мл средний после удара волны экспозиции. Инкубируйте на стандартных культуры условий для 4 х.
  3. Для каждого блюдо, передавать (в темный стерильные капот) 2 x 100 мкл аликвоты либо черный или очистить 96-луночных пластины, в зависимости от ли флуоресценции или поглощения будет использоваться для оценки жизнеспособности.
  4. Передача пластину 96-луночных читателя соответствующие пластины оснащен правильные фильтры и читать с помощью возбуждения полосы 530ex/590em для флуоресценции или 570 Нм в сочетании с 600 Нм ссылку для поглощения. Экспортировать и сохранять данные.
  5. Анализ данных для выявления разницы между воздействию ударной волны образцов и не подвергаются элементы управления, как это может означать падение в жизнеспособность клеток.
    Примечание: Отрицательный контроль также должны быть включены в экспериментальный дизайн. Кроме того, интерполяции по калибровочной кривой может использоваться для вычисления числа клеток.
  6. Аспирационная носитель, содержащий реагент индикатора окислительно-восстановительные. Замените его с 2 мл свежей среды и инкубировать клетки на условиях стандартной культуры за 24 ч.
  7. Повторите описанные выше шаги, необходимые для получения второй точки время жизнеспособность.
  8. Для флуоресцентных изображений живых и мертвых клеток, аспирационная среднего и вымыть клетки дважды в 1 мл ФСБ. Передачи 100 мкл полный реагента в изображений комплекта (см. Таблицу материалов) для каждой выборки и инкубации при комнатной температуре в защищенном от света на 15 мин
  9. Аспирационная реагент и мыть после того, как с помощью 1 мл ФСБ. С помощью тонкой точке щипцы, тщательно удалить coverslip из 35 мм блюдо и поместите его лицевой стороной вниз на стекло микроскопии слайд.
  10. Получить изображения для каждого образца, используя флуоресцентный микроскоп (10 X объектив, 0,50 числовая апертура) установлены правильные фильтры возбуждения и выбросов (ex / ет 488 нм/515 нм и 570 Нм/602 Нм).
    Примечание: Живые клетки будет излучать интенсивный, единообразных, зеленый флуоресценции. Мёртвых или погибающих клеток с нарушенной клеточную мембрану будет поглощение мертвых комплект компонент, преимущественно в результате выбросов красной флуоресценцией, нашли в регионе ядерные клетки.
  11. Использовать анализ изображений, программного обеспечения, либо вручную или автоматически подсчитать количество живых и мертвых клеток от каждого образа.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Используя метод, описанный выше, выращенных в монослое клеток были выставлены в трех экземплярах для ударных волн, генерируемых шок трубку (рис. 2B). Маркеры жизнеспособность клеток были оценены. С помощью анализа индикатора окислительно-восстановительные, было установлено, что применение 127 кПа ударной волны удалось значительно сократить жизнеспособность клеток дермального сосочка, по сравнению с элементов управления после 24 ч в культуре (рис. 3). Применение ≤72 кПа ударной волны не снижать жизнеспособность. Для поддержки этих наблюдений, флуоресцентного изображения способны дневно маркировки живые или мертвые клетки с зеленым или красным флуорофоров, соответственно, был использован. Количественная оценка живых и мертвых клеток из 13 флуоресцентных изображений на биологических реплицировать продемонстрировал снижение в жизнеспособность клеток в тех, кто подвергается ударной волны 127 кПа по сравнению с контролем (рис. 4). Статистический анализ был проведен с использованием односторонней ANOVA, последовали несколько испытаний Тьюки сравнение, с p < 0,05 считается статистически значимой. Размер выборки каждой группы составил 9 для assay индикатора окислительно-восстановительные и 39 для анализа изображений количественные флуоресценции.

figure-results-1
Рисунок 3 : Redox индикатор анализа данных показаны время курс ячейки жизнеспособности после воздействия ударной волны. Значительно меньшее количество клеток наблюдалось после 24 ч в группе воздействию ударной волны 127-кПа по сравнению с необработанными управления. Отрицательный контроль, который состоял из 30-s лечения с 2% дезинфицирующего средства (см. таблицу материалы) показали значительно меньше клеток в T0 и 24 ч. по сравнению с другими группами. Каждый бар представляет среднее ± 1 стандартное отклонение (SD); Биологическая реплицирует, N = 3; Технический реплицирует, n = 3. = p < 0,0001. * = p < 0,05. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-2
Рисунок 4 : Флуоресценции Imaging. (A) количественные данные, собранные из флуоресцентного изображения живых и мертвых клеток, захваченные с помощью микроскопа флуоресценции в 24 ч после ударной волны облучения. Значительно меньшее количество жизнеспособных клеток были замечены в 127 кПа (означает = 93.42) воздействию ударной волны образца, по сравнению с 47 кПа (означает = 98.18), 72 кПа (означает = 98.87) и управлять группами (означает = 99.10). Нет жизнеспособных клеток были замечены на негативные контрольной группе после 24 ч (означает = 0). (B) представитель флуоресценции изображения. Green показывает живой клетки, в то время как красный показывает мертвые клетки. Каждый участок поля показывает верхней и нижней квартили с Тьюки усы; Биологическая реплицирует, N = 3; Технический реплицирует, n = 13. = p < 0,0001. Шкалы бар = 300 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Основная травм, полученных от воздействия взрыва события еще полностью не поняты. Выявление и понимание механизмов, которые вызывают взрыв индуцированного повреждения, например черепно-мозговой травмы3,4 и heterotopic окостенение6,7, это важные первые шаги для разработки эффективные методы профилактики. Для достижения этой цели, были разработаны ряд экспериментальных систем для репликации взрыва событие экспозиции11,12,13,14,18,19 . Метод, описанный здесь использует оборудование ударных трубки (рис. 2) способное выстреливать ударных волн в диапазоне давлений в целом тело (т.е., грызун), ткани или образцы клетки. Возможность загружать типы отдельных клеток, а не всей ткани дает возможность разобрать различных клеточных реакций, как повреждения могут произойти одновременно через ряд механизмов1,2. Например модели травматического мозговой травмы, оценки отдельных клеток типов, таких как нейроны и астроциты, можно разрешить для идентификации конкретных клеток травмы. Кроме того ответ целом орган может быть оценена с помощью ткани мозга. Типы индивидуальных клеток и тканей образцы имеют значение и может дать различную информацию. Это также можно изменить количество воздуха, который находится под давлением для создания шок, выбрав двойной затвор или водитель трубка входе. Это определяет продолжительность ударной волны. Другая возможность заключается в том, чтобы изменить мембранный материал и толщина изменить пик давления25.

Другой фактор, чтобы рассмотреть являются вмешательства конец эффекты, которые могут присутствовать, когда образец корпус расположен рядом со съездом шок трубки, как это имеет место на стенде EVOC, описанные в настоящей системе. Чандра и др. посмотрел на взрыв волна профили на различных местах на трубу инициативе сжатия шок и обнаружил, что волны Фридлендер лучше всего представлена в месте глубоко внутри трубки шок15. Чавара и др. также изучал средней загрузки образца и обнаружил, что размещение Концевая плита на конце трубки шок был в состоянии устранить нежелательные отраженные волны16. С учетом данных найдены в эти публикации15,16, будущие изменения для повышения ударной трубы системы, описанные в этой статье может включать в себя размещение EVOC Рог в глубокое место ведомый трубки или, Кроме того включение Концевая плита на трубе шок. Ограничения метода описано может включать относительно низкую пропускную способность проб. Один пользователь может управлять шок трубка благополучно на выходе около 6-8 проб в час. В настоящее время система предназначена вокруг использования единого Петри 35-мм. Таким образом больше экспериментов, содержащий несколько групп и биологических реплицирует может быть трудно достичь.

Методы в статье показано, как жизнеспособность клеток адэрентных дермального сосочка пострадал от воздействия одной ударной волны. Краткосрочной ударной волны (< 10 мс) из ≤72 кПа не влияет на жизнеспособность по сравнению с контролем (рис. 3 и рис. 4). В отличие от ударной волны на 127 кПа стимулировал значительное падение в жизнеспособности на 24 ч после взрыва, как показано пробирного индикатора окислительно-восстановительного (рис. 3) и анализа флуоресцентного изображения (рис. 4). Миллер et al. сообщили аналогичное сокращение в жизнеспособность клеток в крыса organotypic гиппокампа ломтик культур, когда клетки подвергаются либо 147 кПа или 278 кПа ударной волны с помощью открытого, гелий инициативе шок трубки14. В противоположность этому, VandeVord et al. сообщили, что там не влияет на жизнеспособность в астроциты крыс воздействию избыточного давления краткосрочных > 200 кПа, хотя barochamber было использовано вместо трубки шок18. Следует отметить, что внешнее давление зависит от ударной волны, хотя это создает волны комплекс стресс в организме, таким образом делая характер нагрузки сильно зависит от механических свойств ткани или клетки. Дополнительные характеристики исследований клеточным ответом на события взрыва не требуется. Кроме того путем оценки воздействия ударной волны на клеточном уровне, как показано в этой технике, биологических реакций срабатывает от травмы, такие как возмущений сигнализации пути или эпигеномные изменения, можно определить и дальнейшего изучения.

В заключение эта работа описывает использование трубки из нержавеющей стали шок и изменение EVOC Рог для включения начальных клеточных культур. Ударных волн в диапазоне давлений может создается и распространяется через живые клетки для репликации эффекты, которые происходят от воздействия ударной волны. Этот протокол демонстрирует как оценить жизнеспособность клеток, но также могут быть изучены долгосрочные изменения в типы отдельных клеток. Продвигаясь вперед, мы планируем оценить дифференциального эффекты, которые может вызывать комплекс ударных волн в различных типов клеток, с целью углубления нашего понимания взрыв индуцированной первичной травм.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы имеют без финансовых интересов.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы хотели бы отметить финансовую поддержку центра Королевский британский легион взрыва травмы исследований HA и финансирование от Совета медицинских исследований (M01858X/1) к ДСВЗ.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
MEM α, нуклеозидыThermoFisher22571020
фетальная сыворотка крупного рогатого скота, сертифицированная, американского происхожденияThermoFisher16000044Supplement для создания полноценных питательных сред.
Дульбекко s Фосфатно-солевой буферный растворSigma AldrichD8537
Пенициллин-стрептомицин ThermoFisher15070-063Добавка для создания полноценных питательных сред.
Трипсин-ЭДТА (0,5%), без фенола красногоThermoFisher15400-054Разбавьте 1 к 10 перед применением.
CytoOne T-75 Flask, TC-Treatmented, вентилируемаяStarlabCC7682-4875
TC Dish (PS) 35 мм, 8,5 см2Тройная краснаяTCD010035 чашка
Петри (PS) 90 x 14,2 мм без вентиляционных отверстийVWR UK391-0453 
Газопроницаемые клейкие пластинчатые уплотненияThermoFisherAB-0718
LIVE/DEAD Cell Imaging Kit (488/570)ThermoFisherR37601
Alamarblue реактив жизнеспособности клетокFisher Scientific13494309
Virkon таблеткиVWR UK115-0020Используйте для создания 2% раствора в качестве реагента для контроля жизнеспособности.
Щипцы DumontSurgicalTools11295-10Используйте для снятия покровных стекол с чашки Петри.
Покровное стекло, квадратноеVWR UK631-0125
Предметные стекла микроскопаVWR UK631-1553
96 Луночная пластина, сплошной черныйAppletonWoodsCC760Пластина для использования для флуоресцентных измерений.
96 Луночная пластина, прозрачная, (PS)VWR UK734-1799Пластина для измерения абсорбции.
Leica DMi1 Подставка для камерыОптический микроскоп Leica Microsystemsиспользуемый для культивирования клеток.
Zeiss PALM MicroBeam Laser Capture MicrodissecitonZeissFluorescence microsope, используемый для визуализации LIVE/DEAD.
Многоканальный считывательPerkinElmer2104-0010AПластинчатый считыватель для использования для считывания флуоресценции/поглощения.
Mylar Electrical & Химическая изоляционная пленка, 304 мм x 200 мм x 0,023 мм;RS Components785-0782Используется для создания амортизаторной трубки диафрагмы.
Mylar Electrical & Химическая изоляционная пленка, 304 мм x 200 мм x 0,05 мм;RS Компоненты785-0786Используйте для создания мембраны ударной трубки.
Mylar Electrical & Химическая изоляционная пленка, 304 мм x 200 мм x 0,125 мм;RS Components785-0798Используется для создания диафрагмы амортизатора.
Источник тока силового агрегатаDytran Intruments Inc.4103CИсточник питания для датчика 2300В1.
Датчик давления IEPEDytran Intruments Inc.2300V1Датчик давления расположен на амортизаторе.
Цифровой люминофорный осциллографTektronixDPO 4104BИспользуется для сбора и хранения данных датчика 2300V1.
чашка ,

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Proud, W. G. The physical basis of explosion and blast injury processes. J R Army Med Corps. 159, Suppl 1 4-9 (2013).
  2. Born, C. T. Blast Trauma: The Fourth Weapon of Mass Destruction. Scand J of Surg. 94 (4), 279-285 (2005).
  3. Kocsis, J. D., Tessler, A. Pathology of blast-related brain injury. J Rehabil Res Dev. 46 (6), 667-671 (2009).
  4. Bass, C. R., et al. Brain Injuries from Blast. Ann Biomed Eng. 40 (1), 185-202 (2012).
  5. Cernak, I. Brain Neurotrauma: Molecular, Neuropsychological, and Rehabilitation Aspects. Frontiers in Neuroengineering. Kobeissy, F. H. , (2015).
  6. Alfieri, K. A., Forsberg, J. A., Potter, B. K. Blast injuries and heterotopic ossification. Bone Joint Res. 1 (8), 174-179 (2012).
  7. Potter, B. K., Burns, T. C., Lacap, A. P., Granville, R. R., Gajewski, D. A. Heterotopic Ossification Following Traumatic and Combat-Related Amputations. Prevalence, Risk Factors, and Preliminary Results of Excision. J Bone Joint Surg Am. 89 (3), 476-486 (2007).
  8. Sasser, S. M., Sattin, R. W., Hunt, R. C., Krohmer, J. Blast Lung Injury. Prehosp Emerg Care. 10 (2), 165-172 (2006).
  9. Cho, S. -I., et al. Mechanisms of Hearing Loss after Blast Injury to the Ear. PLoS ONE. 8 (7), 67618(2013).
  10. Bull, M. A., Clasper, J., Mahoney, P. Blast Injury Science and Engineering: A Guide for Clinicians and Researchers. , Springer. (2016).
  11. Arun, P., et al. Studies on blast traumatic brain injury using in-vitro model with shock tube. Neuroreport. 22 (8), 379-384 (2011).
  12. Ahlers, S. T., et al. Assessment of the effects of acute and repeated exposure to blast overpressure in rodents: toward a greater understanding of blast and the potential ramifications for injury in humans exposed to blast. Front Neurol. 3, 32(2012).
  13. Polfer, E. M., et al. The development of a rat model to investigate the formation of blast-related post-traumatic heterotopic ossification. Bone Joint J. 97 (4), 572-576 (2015).
  14. Miller, A. P., et al. Effects of Blast Overpressure on Neurons and Glial Cells in Rat Organotypic Hippocampal Slice Cultures. Front Neurol. 6, 20(2015).
  15. Chandra, N., et al. Evolution of blast wave profiles in simulated air blasts: experiment and computational modeling. Shock Waves. 22 (5), 403-415 (2012).
  16. Kuriakose, M., et al. Tailoring the Blast Exposure Conditions in the Shock Tube for Generating Pure, Primary Shock Waves: The End Plate Facilitates Elimination of Secondary Loading of the Specimen. PLoS ONE. 11 (9), 0161597(2016).
  17. Reneer, D. V., et al. A Multi-Mode Shock Tube for Investigation of Blast-Induced Traumatic Brain Injury. J Neurotrauma. 28 (1), 95-104 (2011).
  18. VandeVord, P. J., et al. Up-regulation of reactivity and survival genes in astrocytes after exposure to short duration overpressure. Neurosci Lett. 434 (3), 247-252 (2008).
  19. Kane, M. J., et al. Altered gene expression in cultured microglia in response to simulated blast overpressure: Possible role of pulse duration. Neurosci Lett. 522 (1), 47-51 (2012).
  20. Nienaber, M., Lee, J. S., Feng, R., Lim, J. Y. Impulsive pressurization of neuronal cells for traumatic brain injury study. J Vis Exp. (56), (2011).
  21. Zhang, J., et al. Transcriptional Profiling in Rat Hair Follicles following Simulated Blast Insult: A New Diagnostic Tool for Traumatic Brain Injury. PLoS ONE. 9 (8), 104518(2014).
  22. Bo, C., et al. Cellular characterization of compression-induceddamage in live biological samples. AIP Conf Proc. 1426 (1), 153-156 (2012).
  23. Tannous, O., Griffith, C., O'Toole, R. V., Pellegrini, V. D. Heterotopic ossification after extremity blast amputation in a Sprague-Dawley rat animal model. J Orthop Trauma. 25 (8), 506-510 (2011).
  24. Chen, Y. C., Smith, D. H., Meaney, D. F. In-Vitro Approaches for Studying Blast-Induced Traumatic Brain Injury. J Neurotrauma. 26 (6), 861-876 (2009).
  25. Nguyen, T. T. N., Wilgeroth, J. M., Proud, W. G. Controlling blast wave generation in a shock tube for biological applications. JPCS. 500 (14), 142025(2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Blast EffectsShock TubeCell ViabilityRedox Indicator AssayFluorescent ImagingPrimary CellsShock Wave ExposureCell CulturePressure TransducerOscilloscope

Related Articles