Анализ ретиноевой кислоты-индуцированной Neural дифференциации эмбриональных стволовых клеток мыши в двух и трех-мерных эмбриональных телец

Краткое содержание

Опишем методику с использованием мышиных эмбриональных стволовых клеток для создания двух или трех размерных эмбриональных телец. Затем мы объясним, как вызывать нейронную дифференцировку эмбриональных клеток организма с помощью ретиноевой кислоты, и как анализировать их состояние дифференцировки клеток-предшественников иммунофлюоресценцией маркеров и иммуноблоттингом.

Аннотация

Мышиные эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) , выделенные из внутренней массы бластоцисты (обычно в день E3.5), может быть использован как в пробирке модельной системы для изучения раннего эмбрионального развития. При отсутствии фактора ингибирования лейкемии (LIF), ЭСК дифференцируются по умолчанию в клетки нервных предшественников. Они могут быть накопили в трехмерной (3D) сферический агрегат называется эмбриональное тело (EB) из-за его сходство с ранней стадией эмбриона. ЭТ может быть высевал на фибронектин покрытия покровных, где они расширяются путем выращивания двумерный (2D) расширений, или имплантированный в 3D-матрицах коллагена, где они продолжают расти, как сфероиды и дифференцируются в трех зародышевых слои: эндодермы, мезодермальную и эктодермальных. 3D коллаген культура имитирует среду в естественных условиях более тесно , чем 2D ЭТ. Культура 2D EB облегчает анализ иммунофлюоресценции и иммуноблоттингом для отслеживания дифференциации. Мы разработали два этапа нейронные отличительныеПротокол Тион. На первом этапе, ЭТ генерируются с помощью метода висячей капле, и, одновременно, индуцируются дифференцироваться под воздействием ретиноевой кислоты (RA). На втором этапе, нейронная дифференциация протекает в формате 2D или 3D в отсутствии RA.

Введение

ЭСК происходит из бластоцисты внутренней клеточной массы. Эти клетки плюрипотентные, то есть они обладают способностью дифференцироваться в любой тип клеток организма происхождения. ESC дифференцировки в пробирке имеет широкий интерес в качестве экспериментальной системы для исследования путей и механизмов развития. Он предлагает мощную и гибкую систему модели для тестирования новых терапевтических подходов для коррекции клеточной и тканевой дисфункции. ЭТ резюмировать многие аспекты дифференцировки клеток на ранних стадиях эмбриогенеза. В частности, ЭТ может быть использован , когда эмбриональная летальность делает его трудно определить клеточную основу эмбриональных дефектов ^{1, 2.} ЭТ может быть образован либо за счет висячей капли или жидких методов подвески ^3. Преимущество первого является способность генерировать ЭТ последовательного размера и плотности, что облегчает экспериментальную воспроизводимость.

Взаимодействие с внеклеточным матриксом (ECM) белков адгезии может повлиять на подвижность и выживание адгезивных клеток. В системе культуры 2D, фибронектин часто применяются для увеличения адгезии клеток с субстратом. Фибронектина является базальной пластинкой компонент распознается 10 типов клеточной поверхности интегрин гетеродимеров ^4.

РА представляет собой небольшой липофильный метаболит витамина А , который индуцирует дифференцировку нейронную ^{5, 6.} Высокие концентрации RA способствуют экспрессии генов и нейронную репрессирует экспрессию гена мезодермального в процессе формирования EB ^{7, 8.} РА получают путем окисления витамина А , чтобы ретинальдегида либо спиртом или ретинола дегидрогеназы, с последующим окислением ретинальдегида до конечного продукта с помощью ретинальдегида дегидрогеназы ^9. Нейронная дифференциация требует транспорта РА из цитоплазмы к ядру с помощью клеточного белка РА-2 (связывание CRABP2). В ядре РА связывается с родственным рецепторным комплексом , состоящим из гетеродимер RAR-RXR ^10. Это приводит к тому набору транскрипционных ко-активаторы и инициации транскрипции ^{9, 11.} Кроме того, РА способствует деградации фосфорилированного (активной) Smad1, таким образом антагонизма BMP и СМАД сигнализации ^12. В дополнение к этим деятельности, РА повышает экспрессию Pax6, фактор транскрипции , который поддерживает нейронную дифференциацию ^13. Сигнализации РА модулируется Sirtuin-1 (Sirt1), ядерным никотинамидадениндинуклеотид (НАД +) - зависимый фермент , который деацетилирует CRABP2, препятствуя его транслокацию в ядро, и , следовательно , с РА связывания с RAR-RXR гетеродимер ^{14, 15, 16.}

e_content "> Наша цель при разработке RA-обработанную протокол EB , описанный здесь , чтобы оптимизировать нейронную дифференциацию для того , чтобы облегчить анализ витро сигнальных путей , которые регулируют ESC дифференцировку в нейрональные клетки - предшественники. Одним из преимуществ этого протокола является содействие анализ функции клеток с помощью иммунофлюоресценции. 3D ЭТ не хорошо проникает антитела и их трудно изображение. EB диссоциации в 2D монослой в определенные моменты времени в ходе дифференцировка нервная облегчает иммунноокрашивание и визуализацию клеток с помощью конфокальной микроскопии.

Протокол

1. Культура мышиных эмбриональных фибробластов (МЭФ)

1. Подготовка MEF среды, среда Игла, модифицированная Eagle (DMEM, высокая глюкоза), с добавлением 15% бычьей эмбриональной сывороткой (FBS).
2. Coat 100 мм чашки для культивирования клеток с 0,5% -ным раствором желатина в течение 30 мин при комнатной температуре (RT).
3. Граф MEFs с помощью цитометра. Удалить раствор желатина и сразу же заливают MEF среды предварительно нагревают до 37 ° С. Быстро разморозить флаконы митомицина обработанных MEFs в водяной бане С 37 ° С в течение 2 мин, затем семена 2,8 × 10 ⁶ MEFs на 100 мм желатин покрытия блюда. Отрегулировать число клеток соответственно при использовании посуды других размеров. Инкубируйте MEFs в течение ночи при 37 ° C, 5% CO _2.
4. Изменение среды на следующий день. Культура в течение 2-3 дней до MEF слоя вырожденная.

2. Мышь ESC Культура

1. Подготовка ESC среды, модифицированная среда Дульбекка Исков (IMDM) с добавлением 15% FBS и 103 ед / мл фактора ингибировани лейкоза (LIF), 0,1 мМ заменимых аминокислот, 55 мМ 2-меркаптоэтанола, пенициллином (100 ед / мл), стрептомицина (100 мкг / мл), гентамицин (200 мкг / мл), и 0,2% микоплазма антибиотик.
2. Удалить MEF среды из тарелки, полученного на стадии 1, и заменить 37 ° C подогретого среды ESC.
3. Размораживание флакона ESC и семенные клетки в верхней части слоя MEF. Инкубируют при 37 ° C, 5% CO _2, пока не достигнут ЭСК слияния.
4. Подготовить новые блюда культуры клеток, содержащих сливающийся монослой MEFs. Для того, чтобы отрывок ЭСК, промыть один раз PBS и снять с 0,25% трипсином / EDTA в течение 2-5 мин при температуре 37 ° С, 5% СО _2. Остановить трипсинизации путем добавления свежей IMDM с 15% FBS с отсоединение клеток, передачи клеточной суспензии в 15 мл пробирку и центрифугируют при 160 х г в течение 5 мин при комнатной температуре.
5. Удалить супернатант, ресуспендирования ESCs со свежим IMDM и проходом одну пятой части клеток к каждому новому блюду MEF покрытия; не инкубировать до клетокдостичь слияния (обычно 4-5 дней).

3. Вывод MEFs и ESCs культуры на пластинах покрытые желатином

1. После того, как ECSS достигли слияния, отделить их и MEFs 0,25% трипсина / EDTA, как на стадии 2.4, ресуспендирования клеток в свежей среде IMDM, передать в неадгезивную бактериологической чашке Петри, и инкубируют в течение 40 мин при 37 ° C, 5% CO _2.
2. Тщательно передача ЭСК и MEFs-среду, содержащий на новую пластину желатина покрытия с использованием 5 мл пипетки, избегая повторное пипетирование. Клетки, оставшиеся в чашках Петри являются MEFs, поскольку ЭСК не придерживаются.
3. Прохождение ЭСК через каждые 3-4 дня. Менее частые пассажи могут уменьшить ESC плюрипотентность. Не более 60% слияния, как это может способствовать дифференциации.
4. Повторите шаги 3.2-3.3 три раза или более, по мере необходимости, пока MEFs больше не обнаруживаются с помощью клеточной культуры микроскопа, используя объектив 20X, чтобы убедиться, что MEFs нет.
5. Проверьте ESC плюрипотентностью путем проверки ESCкультуры , чтобы увидеть , если клетки образуют плотные колонии с типичной ESC многоугольной морфологии (рис 1А). Стволовости Тест клеток с помощью количественной обратной транскриптазы полимеразной цепной реакции (ПЦР-Qrt) ^{17, 17,} иммуноблоттинг или иммунофлуоресценции ядра плюрипотентности факторов транскрипции ¹⁷ (рисунок 2).

4. Е. Б. Формирование

1. Подготовьте все-транс-RA маточного раствора в концентрации 10 мМ в ДМСО, и аликвоты в 1,5 мл защищенном от света микроцентрифужные пробирки. Раствор стабилен при температуре -80 ° С в течение до двух недель. Защита от света.
2. Trypsinize ЭСК как на шаге 2.4; replate в свежей среде IMDM без LIF, как одной клеточной суспензии.
3. Граф клеток с помощью гемоцитометра, и подготовить 5 × 10 ⁵ клеток / мл суспензии в IMDM с 0,5 мкМ RA.
4. Пластина 100 мкл 20-капли на 100 мм чашки Петри с помощью 8-канальной пипетки и 200 мклы советов, инвертныеблюда, а также заполнить перевернутую крышку с PBS, чтобы предотвратить висячие капли от высыхания. Защита RA-содержащих питательные среды от воздействия света.
5. Культура ЭТ в висячей капли при 37 ° C, 5% CO _2, в течение 4 дней.

5. 2D EB Культура

1. Coat 12 мм круглой покровные стекла с 30 мкг / мл фибронектина в течение 30 мин при комнатной температуре. Место каждого покровное в лунку 24-луночного планшета, и добавить 1 мл IMDM на лунку.
2. Урожай 3 день взрослый висячей капли ЭТ один за другим с 200 мкл наконечниками пипетки и семя их на покровных фибронектина покрытием, 20 ЭТ на лунку, используя те же наконечники пипеток.
   Примечание: 3-дневный ЭТ предпочтительнее более 4 дней ЭТ, потому что они придерживаются лучше покровных.
3. Продолжить культуру с IMDM-15% FBS без LIF. Замените среду каждые 3-4 дня. Сбор использованной среды для анализа секреции белка по мере необходимости.

6. Обнаружение секретируемых белков

1. Передача 500 мкл EB лечебмкм до 10 кДа-отрезные центробежные фильтры, спина при 20000 мкг в течение 60 мин при 4 ° C.
2. Проверьте среду, остающуюся внутри центробежных фильтров каждые 15-20 минут, чтобы предотвратить чрезмерное обогащение. Стоп центрифугирование, когда объем оставшейся среды упала до 25 мкл.
3. Собрать оставшуюся Концентрированную среду после того, как инвертирующий фильтр и вращается со скоростью 160 мкг при 4 ° С, в соответствии с инструкциями изготовителя.
4. Обнаружить секретируемые белки с помощью иммуноблоттинга со специфическими антителами ^17.

7. 3D EB Культура

1. Сбор ЭТ, выращенный в течение 4 дней в подвесных капель, как описано на стадии 5.2, и поместите их в 1,5 мл центрифужных пробирок (30 ЭТ на пробирку).
2. Готовят раствор геля коллагена следуя инструкциям набора коллагена культуры 3D (см Материалы / оборудование Стол). Развести соответствующие объемы раствора коллагена и 5-кратным DMEM (набор компонентов); добавить пРешение eutralization (набор компонентов) и хорошо перемешать немедленно, и сохранить это на льду.
3. Пипетировать соответствующий объем охлажденного раствора коллагена в 1,5 мл пробирку, содержащую ЭТ, и осторожно перенести в лунки 6-луночного планшета с использованием 1 мл пипетки. Избегайте пузырьков.
4. Сразу передачи пластины до 37 ° C, 5% CO _2, в течение 60 мин для инициирования полимеризации коллагена.
5. Перекрытие EB-содержащий пластину с IMDM.
6. Изменение средних каждые 3-4 дня.

8. EB диссоциация

1. Собирают день 4 ЭТ (со стадии 4) один за другим, с 200 мкл наконечниками пипетки и передавать их на неадгезивную бактериологические чашки Петри, содержащей IMDM с 15% FBS; культуры при 37 ° C, 5% CO ₂ в течение более 4 дней. Проверяйте ЭТ в два раза каждый день, чтобы убедиться, что они не прикрепляются к нижней части; встряхните блюдо, чтобы предотвратить EB прикрепление к основанию.
2. Центрифуга ЭТ при 185 х г в течение 5 мин приРТ, в лабораторной центрифуге.
3. Удалить супернатант. Осадок не должен превышать 100 мкл в каждой пробирке.
4. Добавить в осаждали ЭТ 1 мл 0,25% тип I коллагеназы на пробирку, дополненную 20% FBS в PBS.
5. Инкубируйте EB-коллагеназы смесь в течение 1 ч при 37 ° C, 5% CO _2, пипеткой осторожно каждые 20 мин, используя 1 мл наконечники пипеток.
6. Вымойте клетки мягко 3x с PBS. Если клеточные агрегаты присутствуют, используют клеточный фильтр с сеткой 100 мкм, чтобы удалить их.
7. Replate клетки на желатиновой оболочкой 60 мм чашках в IMDM. Затем инкубируют при 37 ° C, 5% CO _2.

9. Трансфекция диссоциированных ЭТ

1. Для QRT-ПЦР и иммуноблоттинга, пальто 6-луночный планшет с 0,5% желатина.
2. Для иммунофлюоресценции, пальто покровные стекла с 30 мкг / мл фибронектина в течение 30 мин при комнатной температуре. Место каждого покровное в лунку 24-луночного планшета. Добавить IMDM.
3. Семенной 4,75 × 10 ⁵ или 1 × 10 ⁵ диссоциированные EB-клетки (шаги 8.4-8.7) на лунку в 6- или 24-луночные планшеты, соответственно.
4. Расти клетки до 70% слияния до трансфекции.
5. Трансфекции клеток с помощью nonliposomal липидного стволовых клеток оптимального реагента ¹⁷ (см Материалы / Оборудование таблицу), в соответствии с инструкциями изготовителя.
   Примечание: реагент мы использовали , как правило , достигается эффективность трансфекции в 50% (см Представитель Результаты).
6. Анализ образцов от QRT-ПЦР или с помощью иммуноблоттинга ¹⁷ 2 или 3 дня после трансфекции, соответственно.

10. Анализ EB дифференциации с помощью иммунофлуоресценции

1. Промывочный 2D ЭТ или диссоциирован 3D ЭТ с PBS и исправить с 4% параформальдегидом в PBS в течение 30 мин при комнатной температуре. Промыть фиксированные клетки 3x с PBS для удаления плавающих остатков клеток.
   Примечание: параформальдегид кожи и раздражение глаз; Соблюдайте осторожность при обращении с ним.
2. Добавить 1% Triton X-100 в PBS, чтобы клетки проницаемыми в течение 20 минут при комнатной температуре, затем промывают 3 раза с PBS.
3. Удалить PBS и блокируют с 5% BSA в PBS в течение 30 мин.
4. Готовят разбавления первичного антитела в 1% BSA / PBS с добавлением 0,03% Triton X-100. Заменить блокирующий раствор с помощью раствора первичного антитела. Инкубирую в течение 3 ч при комнатной температуре или в течение ночи при 4 ° С, затем промыть клетки 3x с PBS.
5. Применение вторичного антитела в PBS в соответствии с инструкциями изготовителя. Инкубировать в течение 1 ч при комнатной температуре, затем промыть клетки 3 раза с PBS.
6. Гора покровные на стеклах с анти-выцветанию среды для оптической микроскопии.

Результаты

Oct4, Nanog и SOX2 являются основными факторами транскрипции, которые придают ESC самообновлению и плюрипотентности. Мы применили вышеуказанный протокол для сравнения нейронную дифференцировку ЭСК от дикого типа и от штамма генетически модифицированных мышей , где Syx, ген , кодирующий для RhoA-специфического фактора обмена Syx, нарушается. Мы замешан Syx в ангиогенез ^18. Мы заметили , что различия в поведении ЭТ агрегируются из Syx ^{+ / +}

Обсуждение

В этом протоколе мы представляем относительно простой и доступный метод для изучения нейронной дифференцировки мышиных ЭСК. В предыдущих протоколах, РА был добавлен в среду в день 2 или 4 -й день в EB-висячей капли ⁸ или суспензионной культуры ^7, соответственно, или сразу же после того , как Е.Б. висит агрегации капель ^21. В протоколе мы сконструировали, RA был добавлен ранее. Несмотря на ранее введение RA к ЭТ , образованное суспензионной культура,...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Materials
MEFs	EMD Millipore	PMEF-CF	ESC питательный слой
ESC	EMD Millipore	CMTI-2
Чашка для клеточных культур (60 мм)Чашка для клеточных культур	Eppendorf	30701119	Cell Culture
Чашка для клеточных культур (100 мм)	Falcon	353003	Чашка Петри для клеточной культуры
(100 мм)	Corning	351029	Подвесные капли
24-луночный планшет	Greiner Bio-One	662160	2D EBs
6-луночный планшет	Eppendorf	30720113	Transfection
Dark 1,5 мл центрифужная пробирка	Celltreat Scientific Products	229437	РА стоковый раствор
Микроскоп покровное стекло	Fisherbrand	12-545-80	Круглый, диаметр 12 мм
Предметные стекла для микроскопа Superfrost-plus	Fisherbrand	12-550-15
3D набор для культивирования коллагена	EMD Millipore	ECM675	3D культура
Effecten Реагент для трансфекции	Qiagen	301427	Трансфекция стволовых клеток
Microcon  Центробежные фильтры (10 кДа)	EMD Концентрация миллипор	MRCPRT010	белка
Name	>Company<	strong>Номер в каталоге<	>Комментарии
Reagents
DMEM	Lonza	12-709F	MEFs культура
IMDM	Gibco	12440-046	Культура ESCs Фетальная
бычья сыворотка (FBS)	EMD Millipore	ES-009-B	ESCs культура
желатин	Sigma-Aldrich	G2625	Покрытие для посуды
LIF	R& D Systems	8878-LF-025	Для поддержания плюрипотентности ESC
Растворы заменимых аминокислот MEM	Gibco	11140050	Клеточная культура
2-меркаптоэтанол	Gibco	21985023	Клеточная культура
Пенициллин-стрептомицин	Gibco	15140122	Клеточная культура
Гентамицин	Gibco	15750060	Клеточная культура
MycoZap Plus-PR	Lonza	VZA-2022	Клеточная культура
0,25% Трипсин-ЭДТА	Gibco	25200-072	Клеточная культура
DMSO	Sigma-Aldrich	D2650
Полностью транс-ретиноевая кислота	Sigma-Aldrich	R2625-50MG	Индукция нейронной дифференцировки
Сыворотка крупного рогатого скота Альбумин	Sigma-Aldrich	A7030-50G	Блокирование и разведение антител
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787-100ML	Пермеабилизация клеточной мембраны
Клеточный фильтр	Corning	352360
Prolong Gold реагент против выцветания с DAPI	Life Tech.	P36931	Реагент монтажный
16% параформальдегида	Электронная микроскопия наук	15710	Фиксация клеток
Фибронектин	R& D Systems	1030-FN	Покрытие для посуды
PBS	Gibco	10010049
коллагеназой типа I	Worthington Biochem. Corp	LS004196	EB dissociation
Name	>Company	Номер в каталоге	>Комментарии
Первичные антитела
Nestin (Rat-401)	Santa Cruz Biotech	sc-33677	Обнаружение нейронной дифференцировки
Oct4	Santa Cruz Biotech	sc-5279	Обнаружение нейронная дифференцировка
Nanog	Bethyl Laboratories	A300-398A	Обнаружение нейронной дифференцировки
Sox2	Cell Signaling	3579	Обнаружение нейронной дифференцировки
Tubulin b3 (AA10)	Santa Cruz Biotech	sc-80016	Обнаружение нейронной дифференцировки
Name	>Company	Номер в каталоге	Комментарии
Вторичные антитела
Donkey anti-Mouse-Alexa555	Life Tech.	A31570	Иммунофлуоресцентный
ослик против мышей-Alexa488	Технологии жизни.	A21202	Иммунофлюоресцентный
<сильный>Название	Company	Номер в каталоге	Комментарии
Инструменты
Широкоугольный микроскоп	Nikon	Eclipse TS100	Визуализация клеточных культур
Конфокальный микроскоп	Nikon	C2	Иммунофлуоресцентная визуализация