Method Article

LERLIC-МС / МС для углубленной характеризации и Количественный глутамин и аспарагин Дезамидирование в Shotgun протеомике

DOI:

10.3791/55626

⸱

April 9th, 2017

 ,  , 
1Division of Structural Biology and Biochemistry, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы приводим протокол шага за шагом в длинномерной электростатическом отталкивание-гидрофильно-хроматографии тандемной масс-спектрометрии метода (LERLIC-МС / МС). Это роман методология, которая позволяет в первый раз и количественного определения характеристик глутамина и аспарагина деамидирования изоформ с помощью дробовика протеомики.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Характеристика белок дезамидирования важно расшифровать роль (ы) и потенциальные возможности этого белка посттрансляционной модификации (PTM) в патологии человека и других биохимических контекстах. Для того чтобы выполнить характеристику белка дезамидировании, недавно мы разработали новый длинномерных электростатическое отталкивание-гидрофильное взаимодействия хромато-тандемной масс-спектрометрии (LERLIC-МС / МС) метод, который может отделить глутамина (Gln) и аспарагин (Asn) изоформы продукты дезамидирования от модельных соединений до чрезвычайно сложных биологических образцов. LERLIC-МС / МС, таким образом, первая стратегия дробовика протеомики для разделения и количественного определения Gln деамидирования изоформ. Мы также продемонстрировать, как новизна, что протокол обработки образцов описанный здесь стабилизирует сукцинимид промежуточное позволяет его характеристику с помощью LERLIC-MS / MS. Применение LERLIC-MS / MS, как показано в этом видео статьи может помочь пролить свет в настоящее время неизвестногоп молекулярных массивы белка дезамидирования. Кроме того, LERLIC-МС / МС обеспечивает дальнейшее понимание ферментативных реакций, которые включают дезамидирование в различных биологических фонах.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Дезамидирование представляет собой модификацию белков посттрансляционная (ПТМ) , который вводит отрицательный заряд белка позвоночника за счет модификации аспарагина (Asn) и / или глутамин (GLN) остатков 1. Эта модификация в то время как остатки Asn влияющие генерирует изомерные продукты isoaspartic кислоты (isoAsp) и п -aspartic кислоты (Asp) в общем соотношении 3: 1 2. Тем не менее, это отношение может быть изменено путем вмешательства фермента ремонта L-isoaspartyl метилтрансферазы (PIMT) 3, 4. Точно так же, деамидирование Gln остатков генерирует изомерные гамма-глутаминовой кислоты (γ-Glu) и изоформы альфа-глутаминовой кислоты (α-Glu) в ожидаемом соотношении 1: 3, 5 7, но это соотношение может быть смещена под действием вездесущий фермент трансглютаминаза 2 и другие трансглутаминазы, в том числе трансглутаминаза 1, электронныеnzyme недавно идентифицирован как связанный с внеклеточной везикул в мозге 6.

Происхождение дезамидировании может быть либо спонтанным или ферментативным, бывшее особенно распространен на Gln остатках , в которых трансглутаминаза и другие ферменты опосредуют меж / внутрисистемное молекулярное сшивание с помощью переамидирования (см 3 для более подробной информации о Gln переамидировании и его последствия в некоторых хронических и смертельные заболевания человека). Таким образом, деамидирование является ПТМ , что имеет решающее резонанс на структуру и функции пораженных молекул 4, 7, 8 и требует углубленного химических характеристик 3 в свете его различных биохимических последствий , включая его службы в качестве молекулярных часов старения 9 ,

Несмотря на то, деамидирование Asn остатков было относительно хорошо характеризуются снизу вверх дробовика протеомики 1, 10, деамидирование Gln остатков до сих пор не имеет подходящий метод характеризации за пределы сложного анализа модельных соединений с помощью электронно-радикальной фрагментации на основе 11. Недавно мы разработали новый один размер дробовика протеомики стратегию (LERLIC-МС / МС) 3 , что делает возможным разделение Gln и Asn деамидирования изоформ из сложных биологических образцов и модельных соединений в одном анализе. LERLIC-МС / МС основан на разделении триптических пептидов переваривали с использованием длинномерных (50 см) ионообменная колонка (LAX) работает в режиме электростатического отталкивания-гидрофильное взаимодействие хроматографии (ERLIC), и в сочетании с тандемной масс-спектрометрии (АЯ МС / МС). Эта новая аналитическая стратегия была использована для характеристики и относительно количественной оценки степени каждого дезамидированного остатка в тканях мозга человекае "> 3. Тем не менее, протокол описанный здесь будет предоставлять видео съемки LERLIC-MS / MS , направленную на изучение особенностей белков дезамидирования в биохимическом контексте интересов.

ЭТИКА ЗАЯВЛЕНИЕ

Все процедуры этого протокола были одобрены этическими комитетами в Наньянском технологическом университете в Сингапуре и были выполнены в соответствии с институциональными рекомендациями.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Упаковка длинномерных анионообменной (LAX) Капиллярная колонка

(Примечание: Хотя LAX колонка может быть в доме упакован , как мы описываем в этом протоколе, LAX столбцы также коммерчески доступны, см таблицы материалов и реагентов для получения более подробной информации).

  1. Приостановка 50 мг слабой анионообменной упаковочного материала в 3,5 мл буфера упаковки (таблица 1) для приготовления суспензии.
  2. Собрать конец капиллярной колонки (длина 50 см - 200 мкм внутреннего диаметра (ID) трубка) с использованием женских к женщине фитинга, а ферулы и охватывающую гайки. Поместите экран 1/16" OD 1 мкм размер пор внутри фитинга женской на женский (Примечание:. Экран, используемый здесь, должен иметь меньший размер пор, чем размер частиц упаковочного материала, чтобы предотвратить утечку материала из колонка).
  3. Пакет капилляр с суспензией с помощью нагнетательного насоса, работающего при 4500 фунтов на квадратный дюйм. (Примечание: Упаковать coluмлн до упаковочного материала видны на входе колонки).
  4. Собрать другой конец капиллярной колонки, как описано в пункте 1.2.

2. Подготовка проб

Этот протокол описывает применение LERLIC-MS / MS для анализа тканей головного мозга человека в качестве модели протеома. (Примечание: В случае использования других тканей или протеомические образцов, процедуры подготовки образца должны быть адаптированы.)

  1. Ткань гомогенизация:
    а. Wash ткань мозга (от 50 до 100 мг) с 1x фосфатного буферным раствором в течение пяти минут трижды.
    б. Однородные ткани в соотношении 1: 1: 2,5 ткани / металлические шарики / SDC буфер для гомогенизации (2 Таблицы) Соотношение (вес / вес / объем) в течение 5 мин при 4 ° С в безопасных блокировках трубок при максимальной интенсивности с помощью гомогенизатора тканей. (Примечание: SDC гомогенизация буфер может включать в себя ингибиторы протеазы , как указано ранее в пункте 3)
    с. Центрифуга гомогената ткани, полученной сюдам на предыдущем шаге, при 10000 х г, 4 ° С в течение 10 мин и собирают супернатант в новую пробирку на 1,5 мл.
    д. Повторите шаги Bc для оставшихся гранул и объединить супернатанты столько раз , сколько необходимо , пока не наблюдается осадок. (Примечание: Если вы должны повторить шаги Ьса более чем в два раза, перемещение образца и бусинки к новой безопасной блокировке трубки для предотвращения потери образца во время стадии центрифугирования).
    е. Количественно концентрации белка в гомогенатах полученных с помощью анализа бицинхониновой кислоты (BCA) 12.
  2. Дезоксихолат натрия (SDC) -поддерживаемая в растворе-триптического пищеварение 13 гомогенатах мозга.
    а. Добавление конечной концентрации 10 мМ дитиотреитолы (DTT) ( с использованием исходного раствора , указанный в растворе 5 таблицы 3) к полученному гомогенато , чтобы инициировать снижение дисульфидных связей белка.
    б. Инкубируйте гомогената в течение 30 мин в ваннепредварительно установлена ​​на уровне 60 ° C.
    с. Добавить в гомогенате конечной концентрации 20 мМ иодацетамида (IAA) с использованием исходного раствора , указанного в растворе 7 таблицы 4.
    д. Инкубируйте гомогената, содержащего IAA при комнатной температуре в темноте в течение 45 мин.
    е. Развести гомогената мозга две складки с использованием буфера для разведения (раствор 6 таблицы 3).
    е. Инкубируйте образец для второй стадии восстановления в течение 30 мин при 37 ° С.
    г. Добавить секвенирование класса-модифицированного трипсина , растворенного в растворе 2 таблицы 2 при белок-к-фермента соотношении 1:50 (вес / вес).
    час Дайджест гомогената с помощью трипсина путем инкубации в течение ночи при 30 ° С.
    я. Гасит ферментативное расщепление на следующий день путем добавления конечной концентрации муравьиной кислоты (FA) 0,5%. (Примечание: Добавление FA будет вызывать осаждение солей SDC в кислых услови х.)
    к. Аккуратно вихрь образцы, содержащие SDC precipiTates.
    к. Гранулы вниз соли SDC пути центрифугирования образцов при 12000 х г, 4 ° С в течение 10 мин.
    л. Собирают супернатант и передавать жидкость в чистую новую пробирку. (Примечание: Будьте осторожны во время пипетки этого шага, чтобы не повторно приостанавливать и / или собирать соли из гранул SDC).
    м. Повторно растворить осадок в SDC SDC повторного растворения буфера (таблица 5) при интенсивном вортексе в течение 1 мин.
    п. Повторите шаги JL дважды , чтобы восстановить осажденных пептиды и объединить супернатант. (Примечание: См . Серра и др 2016 13 для более подробной информации о SDC-помощь в растворе-протокол трипсина переваривания адаптирована здесь.)
  3. Обессоливание триптические переваривается образцы.
    а. Выполните опреснение переваренных образцов с использованием картриджа 1g С-18. (Примечание: Использование большого объема картридж (5 мл), независимо от количества белка, полученной гарантии надлежащей очистки оставшихся солей SDC в образцах передк LC-MS / MS инъекции.)
    б. Выполните кондиционирование С-18 картриджа 1 г с 5 мл ацетонитрила (ACN).
    с. Pass 5 мл очистки буфера (таблица 6) с помощью условного 1g C-18 картриджа , чтобы удалить любые остатки органического растворителя.
    д. Загрузить образец картриджа с 1g C-18.
    е. Выполните 3 - 5 очистку шагов для образца в колонке 1g C-18 с использованием 5 мл буфера очистки каждого шаг.
    е. Элюируйте обессоленные пептиды из С-18 картриджа 1 г с использованием 5 мл буфера для элюции (Таблица 7).
    г. Сушат элюированные пептиды в вакуумном концентраторе.
    с. Развести высушенного образца в конечном объеме 200 мкл буфера для элюции. (Примечание:. Используйте энергичный и длинный (> 10 мин) вортексе с последующей обработкой ультразвуком в ультразвуковой ванне в течение 30 минут, чтобы полностью повторно приостанавливать высушенных пептиды в буфере для инъекций)
    д. Регулировка объема впрыска образца для LERLIC-MS / MS к анелизировать от 1 до 3 мкг белка.

3. Один аспект LERLIC-МС / МС Разделение

  1. Жидкие условия хроматографии:
    Подвижные фазы:
    А: 0,1% ФА в воде (таблица 8).
    Б: 0,1% ФА в ACN (Таблица 9)
    Скорость потока: 0,4 мкл / мин
    Колонка: ЛАКС капиллярная колонка (длина 50 см - 200 мкм ID)
    а. Используйте следующий 1200 мин-градиент: 95% B в течение 40 мин, 95 - 85% B в течение 434 мин, 85 - 70% B в течение 522 мин, 70 - 35% B в течение 124 мин, 35 - 3% B в течение 45 мин , изократическая на 3% B в течение 5 мин, 3 - 95% B в течение 7 мин и выдерживают при изократическая 95% в в течение 23 мин.
    б. Выполните разделение пептидов с использованием LAX капилляра , как указано в Serra & Gallart-Палау и др. 3 с помощью ультра-жидкостной хроматографии высокого давления.
  2. Масс-спектрометр конфигурации:
    а. Настройка сканирования сведений о событиях для выполнения данных переменного сбора betweан полное преобразование Фурье-масс-спектрометрии (FT-MS) и преобразование Фурье-тандемной масс-спектрометрии (ФТ-МС / МС) со следующими параметрами:
    A.1. Режим сбора данных: положительный
    А.2 параметры FT-MS:
    Масс-спектр: 350 - 2000 м / г
    Разрешение: 60 000
    Microscans: 1 за спектр
    Автоматическая регулировка усиления: 1 × 10 6
    а.3 параметров FT-MS / MS:
    Режим Фрагментация Высокоэнергичные столкновительная диссоциации (HCD)
    А.4 Диапазон Масс-спектр: 150 - 2000 м / г
    a.5 Разрешение: 30 000
    А.6 Топ N ионы: 10
    Microscans: 1 за спектр
    Поручите состояние:> 2+
    Ширина Изоляция: 2 Да
    А.7 Автоматическая регулировка усиления: 1 × 10 6
    б. Выполните массовое обнаружение спектрометрии пептидов , как указано в пункте 3 с использованием масс - спектрометра Orbitrap , оснащенным источником nanoelectrospray ионов , работающим при 1,5 кВ.

Анализ 4. Данные

  1. Выполните PROTEв поиске в базе данных к LERLIC-MS / MS получены данные , используя следующие параметры , используя конкретное протеомное программное обеспечение: (Примечание: см 3 для получения более подробной информации.)
    а. Ион допуск: 10 частей на миллион
    б. Фрагмент толерантности иона: 0,05 Да
    с. Ложный Discovery Rate (FDR): 1%
    д. База данных: UniProt Человеческая база данных
    е. Фиксированные модификации: Carbamydomethylation на Cys
    е. Переменные модификации (в случае необходимости с помощью программного обеспечения): Окисление (Мет), Дезамидирование (Asn и Gln).
  2. Уверенная характеристика и количественное определение изомерных деамидированных продуктов в данных LERLIC-МС / МС:
    а. Экспорт результатов поиска базы данных из LERLIC-MS / MS в качестве spreedsheet программного обеспечения для анализа.
    б. Найти и извлечь весь список деамидированных пептидов и их недезамидированных коллегами.
    с. Используя список полученных пептидов в качестве ссылки, извлечь ионные хроматограммы (XICs) этих пептидов с использованием программного обеспечения на наши правила 5 частей на миллион массовых толерантности. (Заметка:См 3 для получения более подробной информации о программном обеспечении , используемом для извлечения XICs.)
    д. Визуально проверить полученные XICs идентифицировать отделенный двойной пик элюции изомерных продуктов , как указано 3. (Примечание: изомерные продукты этих пептидов, идентифицированных на уровне MS / MS может быть легко найдено руководствоваться наличием двух различных времен удерживания в результате поиска по базе данных.)
    е. Относительное количественное определение изомерных продуктов из каждого дезамидированной сайта / пептид должен быть выполнен на основе площади пика каждого идентифицированного изомера в полученных XICs.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Дезамидирование из Gln и Asn остатков считаются дегенеративной модификацией белков (ПСБ) участвует в нескольких хронических и смертельных заболеваниях 14. Было показано , что этот ПТМ может предсказать полураспада и дегенеративных состояний антител и других молекул в организме человека и других подобных биологических фонов 1, 15. Значение белка дезамидирования, на самом деле, выходит за рамками биомедицинс...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом видео-статье мы приводим протокол шага за шагом LERLIC-MS / MS 3, способ для выполнения углубленной характеристики и точно определить степень белка дезамидирования и ферментативных процессы , участвующих в этой модификации белка. LERLIC-МС / МС основан на использовании длинной длины (50 см) LAX по принципу электростатического взаимодействия хроматографии отталкивания-гидрофильной (ERLIC) 27. Использование колонны длинномерной, как показано в нашем исследовании

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была частично поддержана грантами Министерства образования Сингапура (2-го уровня: Грант ARC9 / 15), Национальный Совет по медицинским исследованиям Сингапура (NMRC-OF-IRG-0003-2016) и NTU-NHG Aging Research Grant ( Грант ARG / 14017). Мы хотели бы выразить нашу признательность и искреннюю благодарность доктору Эндрю Альперт и команды PolyLC за любезно предоставил нам упаковочные материалы, которые сделали возможным это исследование.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
PolyCAT 3 и микро; m 100-Å (сыпучие материалы)PolyLC Inc.Специальный заказ
Ионообменный капиллярный столб большой длины 50 см - 200 мкм; m IDPolyLC Inc.специальному заказу
1/16" OD x 200 & микро; m ID x 50 см длинаSGE Analytical Science под руководством Trajan Scientific Australia 620050
Фитинг с внутренней резьбой для трубки с наружным диаметром 1/16"Upchurch ScientificUPCHF-125
Внутренняя гайка для микроферулыUpchurch ScientificUPCHP-416
MicroferuleUpchurch ScientificUPCHF-132
Бомба под давлением NanoBaumeWestern Fluids EngineeringSP-400
Shimadzu Prominence UFLC системаShimadzuProminence UFLC
Bullet BlenderNext AdvanceBBX24
Safe-lock tubesEppendorf T9661-1000EA
Бусины из нержавеющей стали. 0,9 – 2,0 мм. 1 фунт. Нестерильный.Next AdvanceSSB14B
Настольная центрифуга Hettich ZentrifugenRotina 380 R
Стандартная цифровая циркуляционная ванна с подогревом, 120 В переменного токаPolyScience 8006 6 л8006A11B
Sep-pack c18 картридж для обессоливания 50 мгводыWAT020805
концентратор VacummEppendorf Концентратор Плюс Система
Dionex UltiMate 3000 UHPLC DionexUltiMate 3000 UHPLC 
Orbitrap Elite масс-спектрометрThermo Fisher Scientific Inc.ORBITRAP ELITE
Michrom Thermo CaptiveSpray Михром-Брукер Инк.Инкубатор TCSI-SS2
INCUCELL MMM GroupINCUCELL111
Секвенирование модифицированного трипсинаPromegaV5111
Коктейль ингибиторов протеазыRoche11836170001 (ROCHE)
Фосфатный буферный раствор 10x (разбавленный до 1x)Sigma-AldrichP5493
Ацетат аммонияSigma-AldrichA1542
Дезоксихолат натрияSigma-AldrichD6750
ДитиотреитолSigma-AldrichD0632
ЙодоацетамидSigma-Aldrichi6125
Муравьиная кислотаSigma-AldrichF0507 (HONEYWELL)
Гидроксид аммонияSigma-Aldrich338818 (HONEYWELL)
Ацетонитрил ВЭЖХ маркиSigma-Aldrich675415
Изопропанол ВЭЖХ маркиSigma-Aldrich675431
воды ВЭЖХ маркиSigma-Aldrich14263
Трубка PEEKsil по

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hao, P., Adav, S. S., Gallart-Palau, X., Sze, S. K. Recent advances in mass spectrometric analysis of protein deamidation. Mass Spectrom Rev. , (2016).
  2. Geiger, T., Clarke, S. Deamidation, isomerization, and racemization at asparaginyl and aspartyl residues in peptides. Succinimide-linked reactions that contribute to protein degradation. J Biol Chem. 262 (2), 785-794 (1987).
  3. Serra, A., Gallart-Palau, X., Wei, J., Sze, S. K. Characterization of Glutamine Deamidation by Long-Length Electrostatic Repulsion-Hydrophilic Interaction Chromatography-Tandem Mass Spectrometry (LERLIC-MS/MS) in Shotgun Proteomics. Anal Chem. , (2016).
  4. Reissner, K. J., Aswad, D. W. Deamidation and isoaspartate formation in proteins: unwanted alterations or surreptitious signals. Cell Mol Life Sci. 60 (7), 1281-1295 (2003).
  5. Capasso, S., Mazzarella, L., Sica, F., Zagari, A. First evidence of spontaneous deamidation of glutamine residue via cyclic imide to [small alpha]- and [gamma]-glutamic residue under physiological conditions. JChem Soc, Chem Commun. (23), 1667-1668 (1991).
  6. Gallart-Palau, X., Serra, A., Sze, S. K. Enrichment of extracellular vesicles from tissues of the central nervous system by PROSPR. Mol Neurodegener. 11 (1), 41(2016).
  7. Gallart-Palau, X., et al. Gender differences in white matter pathology and mitochondrial dysfunction in Alzheimer's disease with cerebrovascular disease. Mol Brain. 9, 27(2016).
  8. Gallart-Palau, X., et al. Temporal lobe proteins implicated in synaptic failure exhibit differential expression and deamidation in vascular dementia. Neurochem Int. 80, 87-98 (2015).
  9. Robinson, N. E., Robinson, A. B. Molecular clocks. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 98 (3), 944-949 (2001).
  10. Hao, P., et al. Enhanced separation and characterization of deamidated peptides with RP-ERLIC-based multidimensional chromatography coupled with tandem mass spectrometry. J Proteome Res. 11 (3), 1804-1811 (2012).
  11. Li, X., Lin, C., O'Connor, P. B. Glutamine deamidation: differentiation of glutamic acid and gamma-glutamic acid in peptides by electron capture dissociation. Anal Chem. 82 (9), 3606-3615 (2010).
  12. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).
  13. Serra, A., et al. Plasma proteome coverage is increased by unique peptide recovery from sodium deoxycholate precipitate. Anal Bioanal Chem. , 1-11 (2016).
  14. Gallart-Palau, X., Serra, A., Sze, S. K. Uncovering Neurodegenerative Protein Modifications via Proteomic Profiling. Int Rev Neurobiol. 121, 87-116 (2015).
  15. Liu, Y. D., van Enk, J. Z., Flynn, G. C. Human antibody Fc deamidation in vivo. Biologicals. 37 (5), 313-322 (2009).
  16. Serra, A., et al. Commercial processed soy-based food product contains glycated and glycoxidated lunasin proteoforms. Sci Rep. 6, 26106(2016).
  17. Serra, A., et al. A high-throughput peptidomic strategy to decipher the molecular diversity of cyclic cysteine-rich peptides. Sci Rep. 6, 23005(2016).
  18. Leo, G., et al. Deamidation at asparagine and glutamine as a major modification upon deterioration/aging of proteinaceous binders in mural paintings. Anal Chem. 83 (6), 2056-2064 (2011).
  19. Wilson, J., van Doorn, N. L., Collins, M. J. Assessing the extent of bone degradation using glutamine deamidation in collagen. Anal Chem. 84 (21), 9041-9048 (2012).
  20. Buszewski, B., Noga, S. Hydrophilic interaction liquid chromatography (HILIC)--a powerful separation technique. Anal Bioanal Chem. 402 (1), 231-247 (2012).
  21. Alpert, A. J., Hudecz, O., Mechtler, K. Anion-exchange chromatography of phosphopeptides: weak anion exchange versus strong anion exchange and anion-exchange chromatography versus electrostatic repulsion-hydrophilic interaction chromatography. Anal Chem. 87 (9), 4704-4711 (2015).
  22. Adav, S. S., et al. Dementia-linked amyloidosis is associated with brain protein deamidation as revealed by proteomic profiling of human brain tissues. Mol Brain. 9 (1), 20(2016).
  23. Golde, T. E., Borchelt, D. R., Giasson, B. I., Lewis, J. Thinking laterally about neurodegenerative proteinopathies. J Clin Invest. 123 (5), 1847-1855 (2013).
  24. Gallart-Palau, X., Ng, C. H., Ribera, J., Sze, S. K., Lim, K. L. Drosophila expressing human SOD1 successfully recapitulates mitochondrial phenotypic features of familial amyotrophic lateral sclerosis. Neurosci Lett. 624, 47-52 (2016).
  25. Ouellette, D., Chumsae, C., Clabbers, A., Radziejewski, C., Correia, I. Comparison of the in vitro and in vivo stability of a succinimide intermediate observed on a therapeutic IgG1 molecule. mAbs. 5 (3), 432-444 (2013).
  26. Kumar, S., et al. Unexpected functional implication of a stable succinimide in the structural stability of Methanocaldococcus jannaschii glutaminase. Nat Commun. 7, 12798(2016).
  27. Alpert, A. J. Electrostatic Repulsion Hydrophilic Interaction Chromatography for Isocratic Separation of Charged Solutes and Selective Isolation of Phosphopeptides. Anal Chem. 80 (1), 62-76 (2008).
  28. Hao, P., Ren, Y., Alpert, A. J., Sze, S. K. Detection, Evaluation and Minimization of Nonenzymatic Deamidation in Proteomic Sample Preparation. Mol Cell Proteomics. 10 (10), 111(2011).
  29. Hao, P., Ren, Y., Datta, A., Tam, J. P., Sze, S. K. Evaluation of the effect of trypsin digestion buffers on artificial deamidation. J Proteome Res. 14 (2), 1308-1314 (2015).
  30. Liu, S., Moulton, K. R., Auclair, J. R., Zhou, Z. S. Mildly acidic conditions eliminate deamidation artifact during proteolysis: digestion with endoprotease Glu-C at pH 4.5. Amino Acids. 48 (4), 1059-1067 (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

LERLIC MS MSGlutamine DeamidationAsparagine DeamidationShotgun ProteomicsProtein DeamidationSuccinimide IntermediateAnion Exchange ChromatographyPeptide SeparationProteome AnalysisPosttranslational Modification

Related Articles