Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Протеин-тРНК-агароз-гель-запаздывающие анализы для анализа

9.8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/55638

⸱

21 июня 2017 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Physical Chemical Biology, Center for Biological Research (CIB-CSIC), Spanish National Research Council (CSIC), 2Department of Immunology, Complutense University School of Medicine, 3Abvance Biotech srl

В этой статье

Краткое содержание

Протокол представлен для получения тРНК (UUU) и анализа тРНК (UUU) в комплексе с ферментом TcdA с помощью тестов запаздывания агарозного геля.

Аннотация

Мы демонстрируем способы экспрессии и очистки тРНК (UUU) в Escherichia coli и анализ с помощью анализов на замедление геля связывания тРНК (UUU) с TcdA, дегидратазой N6- треонилкарбамоиладенозина (t 6 A), которая циклизует треонилкарбамоил Боковая цепь, присоединенная к A37 в петле антикодонового штока (ASL) тРНК до циклического t 6 A (ct 6 A). Транскрипцию синтетического гена, кодирующего тРНК (UUU), индуцируют в E.coli с 1 мМ изопропил-D-1-тиогалактопиранозидом (IPTG), а клетки, содержащие тРНК, собирают через 24 ч после индукции. Фракцию РНК очищают с использованием метода экстракции кислотным фенолом. Чистую тРНК получают гель-фильтрационной хроматографией, которая эффективно отделяет малые молекулы тРНК от более крупных интактных или фрагментированных нуклеиновых кислот. Для анализа связывания TcdA с тРНК (UUU) TcdA смешивают с тРНК (UUU) и отделяют на природном агарозном геле при 4 ° С.Свободная тРНК (UUU) мигрирует быстрее, тогда как комплексы TcdA-тРНК (UUU) подвергаются задержке подвижности, которая может наблюдаться при окрашивании геля. Мы демонстрируем, что TcdA представляет собой тРНК (UUU) -связывающий фермент. Этот анализ запаздывания геля может быть использован для изучения мутантов TcdA и эффектов добавок и других белков при связывании.

Введение

Анализ запаздывания геля 1 (также известный как анализ сдвига электрофоретической подвижности, EMSA) представляет собой электрофоретический метод, предназначенный для изучения и характеристики взаимодействия белок-нуклеиновая кислота. Он позволяет анализировать белок-ДНК, а также взаимодействия белок-РНК и, в частности, взаимодействия между тРНК и тРНК-связывающими белками с использованием либо очищенных компонентов, либо сложных смесей белков ( например , клеточных лизатов) или нуклеиновых кислот ( например , тРНК бассейны). Мы применили анализы гель-запаздывания к изучению взаимодействия между очищенной тРНК (UUU) и TcdA, дегидратазой N6- треонилкарбамоиладенозина (t 6 A), которая циклизует боковую цепь треонилкарбамоила, присоединенную к A37 в антикодоновой штоковой петле (ASL) От тРНК до циклического t 6 (ct 6 A) 2 , 3 . TcdA также известен как CsdL 3 ,F "> 4. Ген tcdA / csdL образует кластер с генами csdA и csdE 5 , которые кодируют цистеин-десульфуразу и акцептор серы системы цистеинсульфазасульфиназы (CSD) и требуется для поддержания функции TcdA in vivo 3 .

Обоснованием анализа запаздывания геля является то, что, хотя свободные молекулы нуклеиновой кислоты быстро мигрируют к фронту акриламидных или агарозных гелей из-за их большого отрицательного заряда, электрофоретическая подвижность белковых комплексов тех же нуклеиновых кислот резко снижается. Снижение подвижности визуализируется как «сдвиг» в комплексах нуклеиновых кислот и белков, которые разрешаются в виде дискретных полос. Положительно заряженный и более крупный нуклеиново-кислотно-белковый комплекс проявляет больший сдвиг или снижение подвижности на геле.

Поскольку нейтрализация заряда комплекса является универсальным явлениемДля комплексов белок-нуклеиновая кислота анализ запаздывания геля может быть применен к широкому спектру комплексов и типов нуклеиновых кислот. Метод прост, недорог и может проводиться в лабораториях с минимальным оборудованием. Это требует лишь небольшого количества белков и тРНК. Это преимущество перед альтернативными биофизическими методами, которые обычно потребляют большее количество образца.

Анализ запаздывания геля широко использовался для изучения факторов транскрипции. Анализ был использован для анализа кинетики связывания, прочности и специфичности факторов транскрипции для многих различных последовательностей ДНК. Именно в этой области EMSA был впервые разработан 6 , 7 . Анализы запаздывания геля с молекулами РНК 8 , 9 , 10 , 11 и тРНК также использовались в исследованиях рибосомИ проанализировать, как мы здесь делаем, ферменты, которые после транскрипции изменяют нуклеозиды тРНК.

Многие результаты влияют на результат анализа запаздывания геля, такого как температура, качество белка и тРНК, а также прочность связывания. Тщательное планирование и выполнение эксперимента имеет решающее значение для интерпретации результатов свободной нуклеиновой кислоты и связанных с белком видов. Здесь мы использовали синтетический ген, кодирующий тРНК (UUU), клонированный в экспрессионный вектор, промотор которого не обладает сайтом связывания рибосом Shine-Dalgarno, что приводит к синтезу больших количеств тРНК 2 . Этот подробный протокол предназначен для предоставления четкого руководства для проведения экспериментов по замещению гена тРНК, избегая при этом распространенных ошибок.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Предостережение: Перед использованием ознакомьтесь со всеми листами данных о безопасности материалов (MSDS). Некоторые из химических веществ, используемых в этом протоколе, являются токсичными и коррозионными. Используйте подходящие методы при экстракции тРНК с использованием фенола, включая использование вытяжного шкафа и средств индивидуальной защиты (защитные очки, перчатки, лабораторные халаты, штаны полной длины, туфли с закрытыми носками и т . Д.). В этом протоколе используется нетоксичное окрашивание нуклеиновой кислоты. Использование альтернативных пятен может потребовать дополнительных мер предосторожности и специализированного удаления окрашивающего агента, если оно токсично и / или канцерогенно ( например , бромид этидия).

1. Получение агарозного геля

  1. Взвесьте 2 г агарозы и добавьте ее в стеклянную бутылку для приготовления 2% -ного агарозного геля.
  2. Добавить 100 мл 1x буфера трис-борат-этилендиаминтетрауксусной кислоты (EDTA) (TBE) в бутылку, содержащую агарозу. Растопите нагреванием в микроволновой печи. Через 30 с перевернуть содержимое для смешиванияИ повторите этот шаг до полного растворения агарозы. Дайте раствору агарозы остыть примерно до 50-60 ° C.
  3. Наденьте открытые края лотка для геля, чтобы создать форму, поместите подходящий гребень для создания колодцев и влейте в него расплавленную агарозу. Избегайте образования пузырьков и дайте ему застыть при комнатной температуре.
  4. После затвердевания поместите лоток для геля в блок электрофореза и заполните его TBE-буфером до полного покрытия геля.

2. Получение тРНК

  1. Экспресс-тРНК (UUU) в E. coli
    1. Утром используйте флакон из замороженной E. coli BL21 (DE3), трансформированный экспрессирующим вектором pET23d-EcUUU 2 (содержит ген, кодирующий тРНК E. coli (UUU)), для полоскания Lolia Broth с низкой солью (LB) С добавлением 100 мкг / мл ампициллина. Инвертируйте планшет и поместите их в 37 ° C инкубатор, пока не появятся колонии (поздний конецУн).
    2. Инокулируют одну хорошо выраженную единичную колонию в 5 мл LB плюс 100 мкг / мл ампициллина и растут в течение ночи при 220 об / мин при 37 ° C.
    3. На следующее утро гранулируют клетки (6500 мкг в течение 10 мин при 4 ° С), заменяют среду 5 мл свежего LB плюс 100 мкг / мл ампициллина и ресуспендируют. Используйте эту суспензию для инокуляции 200 мл LB плюс 100 мкг / мл ампициллина. Растут в течение 5 ч при 220 об / мин при 37 ° С.
    4. Когда оптическая плотность культуры при 590 нм (OD 590 ) достигла 0,6-0,8, добавьте 1 мМ IPTG в культуру, чтобы вызвать экспрессию гена тРНК (UUU). Инкубируйте при 37 ° C в течение 3 часов.
    5. Убирают клетки путем центрифугирования культуры при 6500 мкг в течение 10 мин при 4 ° С.
  2. Лизис и экстракция
    1. Ресуспендируют клеточный осадок в 5 мл буфера для лизиса (0,3 М ацетата натрия, 10 мМ ЭДТА). С этого момента используются автоклавированные буферы и сохраняют все образцы, содержащие тРНК, при 4 ° C, чтобы предотвратить tДеградация РНК.
    2. Добавьте 1 объем кислотного фенола (рН 4,3) в ресуспендированный клеточный осадок в вытяжном шкафу. Смешивают в течение 1 мин путем инверсии для лизиса клеток и центрифугирования при 10000 мкг (10 мин, 4 ° С).
    3. Соберите верхнюю водную фазу, содержащую растворимую тРНК (UUU) (и меньшие концентрации других пулов тРНК), используя пипетку, стараясь не аспирировать органическую (нижнюю) фазу. Отбросьте нижний слой и осадок, который состоит из органической фазы и клеточного мусора, в соответствующий контейнер.
    4. Осаждают тРНК путем тщательного смешивания растворимой (водной) фазы с 2,5 об. 100% об. / Об. Этанолом путем инверсии в течение 1 часа при 4 ° С. Центрифугируют смесь при 15000 xg (30 мин, 4 ° C).
    5. Декантируют супернатант осторожно и ресуспендируют гранулы, богатые тРНК, в 4 мл гель-фильтрационного буфера (20 мМ фосфата натрия или фосфата калия, рН 7,4, 0,1 мМ ЭДТА). Прогон 5 мкл ресуспендированного пула тРНК на 2% -ном агарозном геле.
      ЗАМЕТКА:ТРНК хорошего качества проявляется как одна полоса (молекулярный размер между 50-100 б.п.).
  3. Очистка тРНК (UUU)
    1. Следуя стандартной хроматографической практике 12 , загрузите ресуспендированную тРНК (UUU) на подготовительную гель-фильтрационную колонку высокого разрешения (размеры: 16 x 600 мм, объем слоя: 120 мл, диапазон разрешения: 1000-70 000 Да), предварительно уравновешенный в гелевом фильтровальном буфере (Мобильная фаза). Установите расход до 1 мл / мин для элюирования образцов.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Пик тРНК (UUU) элюируется приблизительно на 75,5 мл. Как правило, может быть получен выход 0,5-1,0 мг / л тРНК культуры.
    2. Проанализируйте образцы в типичных объемах элюирования путем электрофореза на 5-10 мкл каждого образца на 2% -ном агарозном геле.

3. Подготовка проб

  1. Экспресс и очистка TcdA согласно López-Estepa et al . 2 .
    ПРИМЕЧАНИЕ. До 250 мкМTcdA может использоваться для исследования.
  2. Пипеткой соответствующее количество TcdA согласно таблице 1 в правильно помеченные 1,5 мл центрифужные пробирки. Добавить 1,6 мМ трис (2-карбоксиэтил) фосфин (TCEP) (конечная концентрация) и осторожно перемешать с помощью пипетки. Закройте крышку и инкубируйте смесь при комнатной температуре в течение 5 минут.
  3. Добавить 10 мкМ аденозинтрифосфата (АТФ) и 50 мМ MgCl 2 (конечные концентрации). Смешайте с пипеткой и инкубируйте смесь в течение 5 мин при комнатной температуре.
  4. Добавить очищенную тРНК (UUU) (раздел 2.3) согласно таблице 1 , смешать с пипеткой и инкубировать при комнатной температуре в течение 5 мин.
  5. Добавляют фосфатный буферный солевой раствор (PBS) до конечного объема до 100 мкл. Правильно перемешать и добавить глицерин до конечной концентрации 10% об. / Об.
  6. Вверните образец и кратко открутите содержимое трубки (10 000 xg, 1 мин, 4 ° C).

4. Гелевая загрузка и развитие электрофореза

  1. Поместите блок электрофореза в лоток, заполненный измельченным льдом, чтобы поддерживать камеру при 4 ° C во время прогона электрофореза.
  2. Осторожно пипеткой по 5 мкл каждого образца в соответствующую лунку. Добавьте подходящий маркер размера ДНК.
  3. Подключите электроды к соответствующим гнездам блока питания. Включите блок питания и установите напряжение до 100 В и запустите гель в течение 90 мин.

5. Окрашивание геля для наблюдения взаимодействия тРНК-белок

  1. Подготовьте окрашивающий раствор, смешав 50 мл TBE с 1x подходящего пятна ДНК. Избегайте воздействия на окрашивающий раствор солнечным светом, покрывая окрашивающий контейнер алюминиевой фольгой.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Пятна ДНК обычно хранятся в виде концентрированных запасов в количестве 10 000 или 20 000 штук.
  2. После 90 минут электрофореза осторожно удалите гель из лотка и поместите его в контейнер с окрашивающим раствором. Поместите его на рокер при низкой скорости качания при комнатной температуреВ течение 30 мин.
  3. Удалите агарозный гель из окрашивающего контейнера, осторожно нажмите его на кусок целлюлозной ткани или фильтровальной бумаги, чтобы удалить лишнюю жидкость, и поместите ее непосредственно на трансиллюминатор. Включите УФ-излучение, чтобы визуализировать полосы, содержащие тРНК. Сделайте снимок геля.
  4. Протеиновое окрашивание (необязательно).
    1. Сбросьте раствор для окрашивания ДНК безопасно (в соответствии с процедурами безопасности) и замените его 50 мл раствора Coomassie Brilliant Blue (CBB). Поместите лоток на качалку при комнатной температуре и окрасьте в течение ночи (> 12 часов). Отмените окрашивающий раствор CBB и замените его на 50 мл PBS для удаления избытка красителя. Придерживайтесь в течение 1 часа на качалке.
  5. Визуализируйте белоксодержащие комплексы тРНК под легким трансиллюминатором и сфотографируйте гель, чтобы сравнить с картиной ультрафиолетового геля тРНК.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Большие количества тРНК (UUU) могут быть получены путем экспрессии гена тРНК в E. coli под контролем сильного индуцибельного промотора T7. Выраженная тРНК (UUU) накапливается в цитоплазме и обогащается пулом естественно обильных тРНК. Для получения тРНК EMSA-класса использовали двухстадийный процесс очистки, состоящий из стадии захвата / экстракции и стадии гель-фильтрации / полирования. На стадии захвата / экстракции используется рН 4,3 фенола для достижения одновременного осаж...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Проведенный здесь анализ запаздывания гена агарозы с белком-тРНК может быть модифицирован несколькими способами. Во-первых, процентное содержание агарозы в геле может быть уменьшено, чтобы обеспечить разделение и визуализацию комплексов белок-тРНК, значительно превышающих анализируемый здесь (120 кДа). Во-вторых, если целевой белок термолабилен, необходимо принять дополнительные меры предосторожности, чтобы температура поддерживалась ниже максимально допустимой температуры, перемещая устройство электрофореза в холодную ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

MCV является членом CIB Intrumural Programme «Молекулярные машины для лучшей жизни» (MACBET). Исследование, ведущее к этим результатам, получило финансирование от испанского Instituto de Salud Carlos III (PI12 / 01667 до MCV), Испанского министерства экономики и конкурентоспособности (CTQ2015-66206-C2-2-R и SAF2015-72961-EXP до MCV ), Региональное правительство Мадрида (S2010 / BD-2316 - MCV) и Европейская комиссия (Рамочная программа 7 (FP7)), проект ComplexINC (контракт № 279039 на MCV). Финансисты не играли никакой роли в разработке исследований, сборе и анализе данных, решении опубликовать или подготовить рукопись.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
E. coli BL21(DE3)Novagen70235DE3 лизоген содержит Т7-полимеразу при индукции IPTG.
pET23dNovagen69748-3pET23d придает устойчивость к ампициллину; Промоутер Т7.
бульон LB, с низким содержанием соли (Lennox L Broth), гранулированныйMelfordGL1703Обычный бульон LB с высоким содержанием соли.
АмпициллинСигма-Олдрич10419313
Шейкер для инкубатора (термостатированный)NBSExcella E24 Можно использовать любой шейкер-инкубатор с контролем температуры.
Изопропил-бета-D-тиогалактопиранизид (IPTG), >=99%Acros OrganicsBP1755
Ацетат натрия, безводный, >99%MelfordB4017
Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА), соль динатрия, >99%Acros OrganicsAC327205000вреден при вдыхании.
Центрифуга (охлаждаемая)Eppendorf5430
Центрифуга (охлаждаемая) роторEppendorf5430/5430P
ЦентрифугаSorvallRC5C
Ротор центрифугиSorvallSLA-3000
Раствор фенола, насыщенный 0,1 М цитратным буфером, pH 4,3 & 0,2Sigma-AldrichP4682Острая токсичность (пероральная, кожная, ингаляционная), коррозионный абсолютный
этанол для анализа, 100% v/vMerck Millipore100983
дигидрат диосновного фосфата натрия, Na2HPO4, >=99%Sigma-Aldrich71643
Дигидрофосфат калия, KH2PO4Merck48,730,250
HiLoad 16/60 Superdex 75 GE Healthcare28989333
AgaroseMelfordMB1200
Tris [Трис(гидроксиметил) аминометан HCl]MelfordT1513
Борная кислотаMelfordB0503
Микроволновая печьHaierHDA-2070M
TCEP [Трис(2-карбоксиэтил)фосфина гидрохлорид]Sigma-AldrichC4706Вызывает коррозию металлов и кожи.
АТФ [Аденозин 5′-трифосфат динатрия соль гидрат], Класс I, >=99%Sigma-AldrichA2383
Магния хлорид (MgCl2), безводный, >=98%Sigma-AldrichM8266
Sodium Chloride (NaCl), >99%Fisher BioreagentsBP358
Potassium Chloride (KCl), >99%MelfordP0515
NZYDNA Ladder VINZYtechMB8901
Блок питанияConsortEV261
Установка для электрофорезаReal LaboratoryRELSMINI10
Real Safe окрашивание нуклеиновых кислотReal LaboratoryRBMSAFE20,000X стоковый
УФ-трансиллюминатор (G:Box/EF)Syngene2216498
Coomassie Brilliant Blue GSigma-AldrichB0770
Рокер (Gyro-Rocker)Микшер StuartSSL3
Vortex Бренд Fisher13214789
Также можно использовать

Ссылки

  1. Scott, V., Clark, A. R., Docherty, K. The gel retardation assay. Methods Mol Biol. 31, 339-347 (1994).
  2. López-Estepa, M., et al. The crystal structure and small-angle X-ray analysis of CsdL/TcdA reveal a new tRNA binding motif in the MoeB/E1 superfamily. Plos One. 10 (4), e0118606(2015).
  3. Miyauchi, K., Kimura, S., Suzuki, T. A cyclic form of N6-threonylcarbamoyladenosine as a widely distributed tRNA hypermodification. Nat Chem Biol. 9 (2), 105-111 (2013).
  4. Bolstad, H. M., Botelho, D. J., Wood, M. J. Proteomic analysis of protein-protein interactions within the Cysteine Sulfinate Desulfinase Fe-S cluster biogenesis system. J Proteome Res. 9 (10), 5358-5369 (2010).
  5. Loiseau, L., Ollagnier-de Choudens, S., Lascoux, D., Forest, E., Fontecave, M., Barras, F. Analysis of the heteromeric CsdA-CsdE cysteine desulfurase, assisting Fe-S cluster biogenesis in Escherichia coli. J Biol Chem. 280 (29), 26760-26769 (2005).
  6. Fried, M. G., Crothers, D. M. Equilibrium studies of the cyclic AMP receptor protein-DNA interaction. J Mol Biol. 172 (3), 241-262 (1984).
  7. Garner, M. M., Revzin, A. A gel electrophoresis method for quantifying the binding of proteins to specific DNA regions: application to components of the Escherichia coli lactose operon regulatory system. Nucleic Acids Res. 9 (13), 3047-3060 (1981).
  8. Rio, D. C. Electrophoretic mobility shift assays for RNA-protein complexes. Cold Spring Harb Protoc. 2014 (4), 435-440 (2014).
  9. Ryder, S. P., Recht, M. I., Williamson, J. R. Quantitative analysis of protein-RNA interactions by gel mobility shift. Methods Mol Biol. 488, 99-115 (2008).
  10. Yakhnin, A. V., Yakhnin, H., Babitzke, P. Gel mobility shift assays to detect protein-RNA interactions. Methods Mol Biol. 905, 201-211 (2012).
  11. Ream, J. A., Lewis, L. K., Lewis, K. A. Rapid agarose gel electrophoretic mobility shift assay for quantitating protein: RNA interactions. Anal Biochem. 511, 36-41 (2016).
  12. Hagel, L. Gel-filtration chromatography. Curr Protoc Mol Biol. , Chapter 10, Unit 10.9 (2001).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Связывание белка с тРНКочистка тРНКгель-фильтрационная хроматографияфермент TcdAэлектрофорез РНК в гелеиндукция IPTGкислотно-фенольная экстракциянативный агарозный гельанализ тРНК(UUU)
Протеин-тРНК-агароз-гель-запаздывающие анализы для анализа
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.