Методическая статья

Рассечение поджелудочной железы мыши для гистологического анализа и метаболические профили

39.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/55647

⸱

19 августа 2017 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry & Biochemistry, Miami University, 2College of Medicine, Central Michigan University

В этой статье

Краткое содержание

Это видео статья предоставляет подробную демонстрацию процедуры, требуемые для успешного удаления поджелудочной железы от мыши рассечение гистологический анализ и метаболические профили.

Аннотация

Мы исследовали поджелудочной железы конкретных транскрипционный фактор, 1a cre рекомбиназа; жидкий кислород стоп lox Кристен крыса саркома, глицин аспарагиновой кислоты на 12 кодон (Ptf1acre / +; LSL-KrasG12D / +) мыши штамм как модель людского поджелудочного рака. Цель нашего текущего исследования — определить Роман метаболических биомаркеров прогрессирования рака поджелудочной железы. Мы выполнили, метаболические профили мочи, Кала, крови и экстракты ткани поджелудочной железы, а также гистологический анализ стадии прогрессии рака поджелудочной железы. Поджелудочной железы мыши не четко твердые органов как в организме человека, но скорее диффузно распределенных мягких тканей, который не определен, легко люди знакомы с внутренней анатомии мыши или отдельными лицами, которые имеют мало или нет опыта выполнения Анатомирование орган мыши. Целью этой статьи является предоставить подробный скачкообразно демонстрация для новичков в удаления поджелудочной железы мыши рассечение. Эта статья должна быть особенно ценной для студентов и следователи новые исследования, который требует уборки поджелудочной железы мыши путем рассечения метаболические профили или гистологических анализов.

Введение

Мышь стала важным животной модели людского поджелудочного рака1,2. В Ptf1acre / +; LSL-красG12D / + модель мыши, Кристен, крыса саркома (K-Ras) онкогена активируется исключительно в поджелудочной железы, что приводит к инициации предраковых поражений в поджелудочной железе, известный как поджелудочной железы интраэпителиальные неоплазии (Панины), что прогресс для протока поджелудочной аденокарциномы часто называют PDACs3. Эта система модель мыши обеспечивает один из лучших доступных животных моделей для людского поджелудочного рака4,5, с дополнительным преимуществом, что Панины появляются в течение первых пяти месяцев жизни, и часто прогресс PDAC внутри один год4,5, тогда как рак поджелудочной железы чаще всего происходит в организме человека 60-70 лет.

Извлечение поджелудочной железы путем рассечения от Ptf1acre / +; LSL-красG12D / + мышей в различном возрасте позволяет для подробного продольной гистологического исследования развития рака в поджелудочной железе, начиная с самых ранних этапов Панин через прогрессии PDAC3,4 , 5. заготовка поджелудочной железы в возрасте от пяти до пятнадцати месяцев может также использоваться для подготовки ткани экстракты характеризовать глобальные изменения в поджелудочной железы4 метаболизм, возникающие во время перехода от здоровых пораженной ткани 6,7.

Эта статья представляет собой полный визуальный руководство шагов, необходимых для выполнения извлечения поджелудочной железы мыши и обеспечивает руководящие принципы для хранения поджелудочной железы для дальнейшего анализа. Это руководство будет одинаково ценны для лиц, проведение исследований на другие заболевания поджелудочной железы, в том числе диабета типа и должны быть особенно полезны для студентов и следователи, новые исследования, с участием уборки поджелудочной железы мыши с помощью рассечение метаболические профили или гистологических анализов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

процедур осуществляется в видео и описанные ниже были одобрены институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) в Университете Майами.

1. Подготовка и стимул тест

  1. создать две отдельные области для хирургической процедуры, операционный стол и таблицу после операции. Этап обеих областях со всеми материалами и необходимая посуда. Таблица
    1. стадии операционной под вентилируемого капота. Организовать таблицы с оборудованием таким образом, который обеспечивает непрерывный и беспрепятственный производительность процедуры.
    2. Устанавливают послеоперационной таблицу в той же комнате и вблизи главной таблицы операции. Поддерживать обе таблицы как стерильные среды во всей процедуре.
  2. Место следующие поставки на операционном столе: один стеклянную банку с крышкой, один из 15 мл трубки, одна пара Ножницы хирургические, один бутыль на 70% спирте, две пены доски, два щипцы, два шприцев колеи 1 мл 21, две трубы 50 мл, один из пластиковых пробирок , один криогенный флакон, четыре хирургические колодки, десять контактов, диспенсером для стерилизации салфетки и Шарпс контейнер.
  3. Место следующие поставки на таблице после операции: одна аналитические весы, один 4 L Дьюара жидким азотом, широкий неглубокой рот Дьюар, плавающий Микропробирка стойку, одна пара Ножницы хирургические, два щипцы, четыре криогенных флаконов и Диспенсер Стерильные салфетки.
  4. Заполнения 50 мл и один 15 мл до 75% объема с формалином.
  5. С помощью ПИН-кода в каждом углу, аффикс один хирургический pad приблизительно 30 см x 30 см доска пены в качестве Совет рассечение. Используйте оставшиеся четыре булавки в ходе операции. Подготовить меньше доска пены с хирургической площадку для передачи органов к таблице послеоперационное.
    Предупреждение: Изофлюрановая (99,9%) токсичных химических веществ и должны использоваться в вентиляционные вытяжки для обеспечения максимального уровня безопасности от очистки отходов анестезирующий газ 8. Дополнительная информация относительно рисков для исследователей, связанные с использованием метода open-drop, с помощью изофлюрановая можно найти в статье Тейлор и мук 8.
  6. Место один хирургический площадку в стеклянную банку и замочить с несколько капель изофлюрановая (99,9%) и поместите бумажное полотенце поверх для предотвращения прямого контакта мыши с изофлюрановая. Аналогичным образом, использовать пусковую площадку хирургические для линии оставшиеся трубки и замочить с несколько капель изофлюрановая и разместите дополнительную накладку над верхней частью для предотвращения прямого контакта между мышью и изофлюрановая.
  7. Вылейте жидкий азот в мелкой широкий рот Дьюар до тех пор, пока максимальный заполнить линии достигается.
  8. Место мыши, отобранных для рассечения в анестезии камеры, т.е. стеклянную банку салфеткой, смоченной несколько капель изофлюрановая (99,9%) с крышкой, на ~ 1 мин
    Примечание: Это время варьируется от мышь. Когда мышь находится в бессознательном состоянии, удалите его из камеры и поместить его на эксплуатации Совет.
  9. Ориент мыши, таким образом, чтобы он лежал вентральной стороне вверх и с ее головы, указал вдали от ученого. Установите головку внутри трубки выстроились хирургической салфеткой, смоченной несколько капель изофлюрановая (99,9%) и выполнить тест стимул, щепотку ноги, чтобы убедиться, что мышь не реагирует на раздражители.
    1. Если этот тест завершается неудачей и мышь реагирует на ноги щепотку тест, повторите шаг 1.8.

2. Первоначальный разрез, пункции сердца и эвтаназии

  1. Pin конечностей мыши в Правление хирургического пены и мокрой вентральной стороне мыши с 70% этанол.
  2. Ущипнуть мех/кожа возле уретры открытия с щипцами и потяните слегка вверх. Сделайте надрез с Ножницы хирургические через брюшную полость, начиная от уретры, открытие средней линии и заканчивая подбородок.
    1. Рядом с отправной точкой первоначального разреза, захватить одну сторону мех/кожа с щипцами и сделать еще один разрез с ножницами вниз и по диагонали к задней лапой.
    2. Повторить это таким же образом на противоположной стороне.
      Примечание: Мех/кожа может быть возлагали для создания более широкого открытия, но не является обязательным.
  3. Сердце найдите и удалите перикарда, который является мешок вокруг сердца, чтобы избежать засорения иглу шприца.
    1. Понять перикарда с щипцами и резать с ножницами. Выполните пункции сердца, внимательно вставляя иглу шприца в бьющееся сердце и медленно начинают отозвать поршень.
    2. Для оптимальной крови коллекции, используйте поршень иглы имитировать насосное действие сердца и избежать рисунок слишком быстро.
      Примечание: Обычно около 1 мл крови могут быть собраны.
    3. После завершения сбора крови, развеять крови в пластиковых пробирок и распоряжаться шприца в Шарпс контейнер.
    4. После пункции сердца, осуществлять эвтаназии путем удаления вложений, соединяющий сердце.
      Примечание: Гепарин, анти коагулянт, не был добавлен в шприц в этой процедуре до пункции сердца чтобы позволить крови свертываться для сбора сыворотки в рамках этого конкретного исследования. Однако, если исследователь хочет предотвратить свертывание крови для сбора плазмы, гепарин могут быть добавлены к шприцу до пункции сердца.
  4. Если исследование включает генотипирования мыши, СНиП часть уха с помощью ножниц и поместить в пластиковых пробирок для проверки генотипа.

3. Добыча поджелудочной

  1. найдите желудка на левой стороне мыши. Начните мягко (с тем чтобы избежать разрывов) отделение поджелудочной железы от желудка и двенадцатиперстной кишки с помощью двух щипцами.
    Примечание: При отключении поджелудочной железы из желудка и кишечника, это очень важно, что щипцы используются осторожно направлять в ткани поджелудочной железы от органов и чтобы не раздавить или сорвать поджелудочной железы с щипцами.
    1. Продолжать отделить поджелудочной железы от секций тощую и подвздошную кишку и наконец от caecum толстой кишки.
  2. В caecum, переместите щипцы и продолжать разделение поджелудочной железы вдоль оставшиеся толстой кишки к прямой кишке.
    Примечание: На данный момент, это удобно вырезать и удалить часть из желудка в регионе Колон, непосредственно предшествующий прямой кишки.
  3. Найти поджелудочной железы и селезенки прилагается. Слайд поджелудочной железы к правой стороне мыши. Отделить остальные соединения между поджелудочной железы и грудной полости с щипцами для полного отсоединения поджелудочной железы и селезенки примыкающими к нему.
  4. Удаление поджелудочной железы и разложил его для осмотра. Оставляйте Хандра, придает поджелудочной железы для целей идентификации.
    1. Удалить все соединительной ткани, жира и брыжеечных ткани поджелудочной железы.
      Примечание: Эта ткань белее цвет и таким образом может быть легко отличить от ткани поджелудочной железы, что pinker цвета. Это особенно важно, если необходимо удалить весь поджелудочной железы. Например, если поджелудочная железа необходимо взвесить и сравнить с веса тела или между группами животных. В Ptf1a cre / +; LSL-крас G12D / + модель мыши, особенно в старых месяцев, жесткий фиброзной ткани поджелудочной железы может присутствовать. В этом случае тщательное удаление поджелудочной железы должны проводиться как кишечника может быть переплетенный в опухолевой ткани. В запущенных случаях, Аномальные селезенки и печени ткани могут также присутствовать.
  5. Если потребуется, удалять других органов на данный момент.

4. сбора и хранения данных

  1. после извлечения органов, переместить образцы в послеоперационной области для сохранения.
  2. Вес каждого органа и поместить их в их соответствующих криогенных флаконе.
    Примечание: вдоль Витh массы каждого образца, любые нарушения должны быть записаны для дальнейшего использования.
  3. Как только органы взвешиваются, поместите их в жидкого азота для замораживания оснастки.
  4. После привязки замораживания, хранения органов-80 ° c для длительного хранения.
  5. Место формалин хранятся образцы на вершине скамейке на ночь и на следующее утро формалин изменить их решение на 70% этиловом спирте.
    Примечание: Эти образцы должны храниться при температуре 4 ° C для долгосрочного хранения.
  6. Для длительного хранения, заморозить кровь и уха удар-80 ° c.. Для сбора сыворотки из крови позволяют крови свертывается на 30 минут, а затем центрифуга его. Удалите часть сыворотки с помощью пипетки и затем хранить на -80 ° C.

5. Очистить

  1. Sanitize рассечение инструменты с стерильным салфетки. Крышка трубки, выстроились с изофлюрановая пропитанные хирургические колодки. Замените хирургические площадки на плате пены свежие хирургические площадку. Распоряжаться части мыши, которые не были собраны в объекте ' s животных удаления политики.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Рисунок 1 показывает обзор области операционной среды и Рисунок 2 показывает область операции пост. Хотя этот параметр обеспечивает минимальное количество оборудования и постановка, люди могут выбрать изменить это лучше всего подходят для индивидуальных потребностей. Протокол должны быть оптимизированы в соответствии с конкретными потребностями эксперимента. Эта процедура проводится в манере, которая завершает жизнедеятельности м...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Значение в отношении существующих методов
В то время как существуют другие неофициальные видео мыши Анатомирование, это видео статья предусматривает первого профессионального качества, рецензируемых, демонстрация всех подробные шаги, необходимые для извлечения и уборки поджелудочной железы мыши путем рассечения10 . С поджелудочной железы, будучи главным органом для метаболической активности и инсулина производства, рассечение и уборки поджелудочной железы позволяет для сохранен...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

MAK признает поддержку для этой работы национальных институтов здравоохранения / Национальный институт рака предоставить номер - 1R15CA152985-01A1. Этот проект также был поддержан Майами Undergraduate исследований премии программы университета, возможности доктора-бакалавриат университета Майами для стипендиальной программы и программы ученых летнего университета Майами.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Стеклянная банка Corning3140-150Стеклянная банка, использованная в видео, снята с производства. Это его замена.
Крышка стеклянной банкиCorning9985-150Крышка стеклянной банки, использованная в видео, снята с производства.  Это его замена.
15 мл Falcon TubesFisher Scientific339650
Хирургические ножницыFisher Scientific9201
Squeeze bottle Fisher Scientific03-409-10DD
100% этанолFisher Scientific22-032-103
ФормалинFisher Scientific245-684
Пенопластовые доскиТерапак562908
щипцамиFisherScientific 200205SHN
1 мл 21G ШприцыBD Biosciences309624
50 мл Falcon TubesFisher Scientific339652
2,0 мл Микроцентрифужные пробирки Fisher Scientific02-681-258
Хирургические прокладкиFisher ScientificS67011
Т-образные штифты Длина:  2" Advance Store ProductsX32T-05
Стерилизующие салфеткиProfessional Disposables International Inc.Q85084
Контейнер для острых предметовFisher Scientific14-827-122
Аналитические весы MarshallScientificME-AE200
4L DewarTaylor-Wharton4LD
Неглубокий широкий горловина DewarFisher ScientificF3087-V
Плавающий штатив для микротрубокVWR60986-100
Криогенный флакон 1,2 мл, стерильныйFisher Scientific10-500-25
изотезия (изофлуран) Henry Schein Animal Health050033
Жидкий азотWright BrothersNIT-60-XX
Mouse KrasStrain The Jackson LaboratoryOO8179
Mouse Cre StrainMMRRCOOO435-UNC

Ссылки

  1. Fesinmeyer, M. D., Austin, M. A., Li, C. I., De Roos, A. J., Bowen, D. J. Differences in Survival by Histologic Type of Pancreatic Cancer. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 14 (7), 1766-1773 (2005).
  2. Jackson-Grusby, L. Modeling cancer in mice. Oncogene. 21 (35), 5504-5514 (2002).
  3. Heid, I., et al. Early requirement of Rac1 in a mouse model of pancreatic cancer. Gastroenterology. 141 (2), 719-730 (2011).
  4. Hingorani, S. R., et al. Preinvasive and invasive ductal pancreatic cancer and its early detection in the mouse. Cancer cell. 4 (6), 437-450 (2003).
  5. Shi, C., et al. KRAS2 Mutations in Human Pancreatic Acinar-Ductal Metaplastic Lesions Are Limited to Those with PanIN Implications for the Human Pancreatic Cancer Cell of Origin. Mol Cancer Res. 7 (2), 230-236 (2009).
  6. LaConti, J. J., et al. Distinct serum metabolomics profiles associated with malignant progression in the KrasG12D mouse model of pancreatic ductal adenocarcinoma. BMC Genomics. 16 (1), 1-10 (2015).
  7. Ludwig, M. R., et al. Surveying the serologic proteome in a tissue-specific kras(G12D) knockin mouse model of pancreatic cancer. Proteomics. 16 (3), 516-531 (2016).
  8. Taylor, D. K., Mook, D. M. Isoflurane Waste Anesthetic Gas Concentrations Associated with the Open-Drop Method. J Am Assoc Lab Anim Sci. 48 (1), 61-64 (2009).
  9. Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. Blood sample collection in small laboratory animals. J Pharmacol Pharmacother. 1 (2), 87-93 (2010).
  10. Li, D. S., Yuan, Y. H., Tu, H. J., Liang, Q. L., Dai, L. J. A protocol for islet isolation from mouse pancreas. Nature Protocols. 4 (11), 1649-1652 (2009).
  11. Auer, H., et al. The effects of frozen tissue storage conditions on the integrity of RNA and protein. Biotech Histochem. 89 (7), 518-528 (2014).
  12. Ma, J., Leung, L. S. Limbic System Participates in Mediating the Effects of General Anesthetics. Neuropsychopharmacology. 31, 1177-1192 (2006).
  13. Ijichi, H., et al. Aggressive pancreatic ductal adenocarcinoma in mice caused by pancreas-specific blockade of transforming growth factor-β signaling in cooperation with active Kras expression. Genes Dev. 20 (22), 3147-3160 (2006).
  14. Abiatari, I., et al. Moesin-dependent cytoskeleton remodelling is associated with an anaplastic phenotype of pancreatic cancer. J Cell Mol Med. 14 (5), 1166-1179 (2010).
  15. Goodpaster, A. M., Romick-Rosendale, L. E., Kennedy, M. A. a Statistical significance analysis of nuclear magnetic resonance-based metabonomics data. Analytical biochemistry. 401, 134-143 (2010).
  16. Yadav, D., et al. Idiopathic Tumefactive Chronic Pancreatitis: Clinical Profile, Histology, and Natural History After Resection. Clin Gastroenterol Hepatol. 1 (2), 129-135 (2003).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи