Этот протокол демонстрирует основанный на флуоресценции метод для визуализации сосудистой сети и для количественной оценки ее сложности у Xenopus tropicalis . Кровеносные сосуды можно визуализировать через несколько минут после введения флуоресцентного красителя в сердцебиение эмбриона после генетических и / или фармакологических манипуляций для исследования сердечно-сосудистого развития in vivo .
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Визуализация и количественный анализ эмбрионального ангиогенеза у
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Кровеносные сосуды снабжают кислородом и питательными веществами всюду по телу, и формирование сосудистой сети находится под жестким контролем за развитием. Эффективная визуализация кровеносных сосудов in vivo и надежная количественная оценка их сложности являются ключевыми для понимания биологии и болезней сосудистой сети. Здесь мы предоставляем подробный метод визуализации кровеносных сосудов с коммерчески доступным флуоресцентным красителем, ацетилированным человеческим плазмом липопротеидом низкой плотности DiI комплекса (DiI-AcLDL) и количественной оценкой их сложности у Xenopus tropicalis . Кровеносные сосуды могут быть помечены простой инъекцией DiI-AcLDL в сердцебиение эмбриона, а кровеносные сосуды всего эмбриона могут быть отображены в живых или фиксированных эмбрионах. В сочетании с пертурбацией гена путем целенаправленного микроинъекции нуклеиновых кислот и / или применения ванны фармакологических реагентов роль гена или сигнального пути в развитии сосудов может быть inveСтигировали в течение одной недели, не прибегая к сложным генетически модифицированным животным. Из-за четко определенной венозной системы Xenopus и его стереотипного ангиогенеза, прорастание уже существующих сосудов, сложность судна могут быть количественно определены после экспериментов по возмущению. Этот относительно простой протокол должен служить легко доступным инструментом в различных областях сердечно-сосудистых исследований.
Введение
Васкулогенез, образование новых кровеносных сосудов из новорожденных эндотелиальных клеток и ангиогенез, образование новых сосудов из ранее существовавших сосудов, являются двумя различными процессами, которые формируют эмбриональную сосудистую сеть 1 . Любая дисрегуляция в этих процессах приводит к различным сердечным заболеваниям и структурным аномалиям сосудов. Более того, рост опухоли связан с неконтролируемым ростом сосудов. Таким образом, молекулярные механизмы, лежащие в основе васкулогенеза и ангиогенеза, являются объектом интенсивного исследования 2 .
Xenopus и данио являют....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все эксперименты соответствовали протоколам, утвержденным Комиссией по лечебным учреждениям и комитетам по применению ухода за больными при Университете им. Йонсей.
1. Приготовление эмбрионов Xenopus tropicalis
ПРИМЕЧАНИЕ : Зародыши Xenopus tropicalis были получены, как описано ранее 10 , с небольшой модификацией. Зародыши Xenopus tropicalis были поставлены согласно таблицам Nieuwkoop и Faber 11 .
- Индукция овуляции
- Для предварительного первичного введения хорионического гонадотропина человека (hCG) в дорсальный ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Временная шкала экспериментов (рисунки 1 и 2)
Вскоре после оплодотворения может быть проведена целенаправленная микроинъекция для модуляции экспрессии генов. Например, антисмысловая МО, которая специфически связывается с инициирующим кодоном эндогенной мРНК Tie2, может быть инъецирована, ингибируя трансляцию Tie2-мишени-мишени при помощи стерических затруднений. МО может быть конъюгирован с флуоресцеином для легкого визуального с.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Протокол, представленный здесь, был впервые разработан Али Х. Бриванлу и его коллегами для изучения событий развития во время формирования сосудов у Xenopus laevis 4 , но, как показано в этой рукописи, он может применяться к другим мелким животным. Инъекция красителя в сердце проста для выполнения, и вся сосудистая сеть может быть отображена под микроскопом флуоресцентного вскрытия, а также конфокальным микроскопом. Если краситель вводится в сердце во время развития сосудов, динамика рос.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Это исследование было вдохновлено работой Levine et al. , В котором описан этот экспериментальный метод и дано подробное описание развития сосудов у Xenopus laevis. Мы благодарим членов нашей лаборатории за их вклад. Это исследование было поддержано исследовательской инициативой Университета Йонсей в 2015 году (2015-22-0095) и Программой развития биомедицинских технологий Национального исследовательского фонда (NRF), финансируемой Министерством науки, ИКТ и планирования будущего ( NRF-2013M3A9D5072551)
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Чашка Петри 35 мм | SPL | 10035 | Рамка формы Sylgard |
| 60 мм Чашка Петри | SPL | 10060 | Лоток для поднятия эмбрионов |
| Боросиликатное стекло | Инструмент Sutter | B100-50-10 | Игла для инъекций |
| BSA | Sigma | A3059-10G | Реактив для покрытия |
| CaCl2 | D.S.P.GR Реактив | 0,1x MBS | |
| компонент Покровное стекло | Superior | HSU-0111520 | Для конфокальной визуализации |
| DiI-AcLDL | Thermo Fisher Scientific | L3484 | Раствор для окрашивания сосудов |
| FBS | Hyclone | SH.30919.02 | Для хранения яичек |
| Волоконно-оптический осветитель | World Precision Instruments | Z-LITE-Z | Light |
| Ficoll | Sigma | F4375 | Буфер для впрыска |
| Пылающий/коричневый Пуллер для микропипеток | Инструмент для саттера | P-97 | Пуллер для инъекций |
| Щипец | Fine Science Tool | 11255-20 | Для вылупления эмбрионов и<бр/> резки кончика иглы |
| Стеклянное дно тарелки | SPL | 100350 | Для конфокальной визуализации |
| ХГЧ | MNS Корея | Для праймирования лягушек | |
| HEPES | Sigma | H3375 | Буферный агент |
| Инкубатор | Лаборатория Компаньон | ILP-02 | Для выращивания эмбрионов |
| KCl | DAEJUNG | 6566-4400 | MBS компонент |
| L15 среда | Gibco | 11415-114 | Для хранения яичек |
| L-цистеин | Sigma | 168149-100G | Дежелейный реагент |
| MgSO4 | Sigma | M7506 | MBS компонент |
| Микропробирка | Axygen | MCT-175-C-S | Для хранения яичек |
| MS222 | Sigma | E10521 | Обезболивающий порошок |
| NaCl | DAEJUNG | 7647-14-5 | MBS компонент |
| NaOH | Sigma | S-0899 | Реактив для коррекции pH |
| Параформальдегид | Sigma | P6148 | Фиксаторы |
| PBS | BIOSESANG | P2007 | Буфер для визуализации |
| pH бумаги | Sigma | P4536-100EA | Для подтверждения pH |
| PICO-LITER INJECTOR | Waner instruments | PLI-100A | Для инъекционного |
| штифта | Pinservice | 26002-10 | Для разреза |
| Держатель булавки | Scitech Korea | 26016-12 | Для разреза Прецизионный |
| стерео зум Бинокулярный микроскоп | World Прецизионные приборы | PZMIII | Для визуального досмотра |
| Стандартный микроманипулятор с ручным управлением | Waner instruments | W4 64-0056 | Для микроинъекции |
| SYLGARD 184 Комплект | Dow Corning | Для DiI инъекции | |
| Трансфер пипетка | Корея Ace Scientific Co. | YM. B78-400 | Для сбора яйцеклеток и<бр/> эмбрионов |
Ссылки
- Herbert, S. P., Stainier, D. Y. Molecular control of endothelial cell behaviour during blood vessel morphogenesis. Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (9), 551-564 (2011).
- Augustin, H. G., Koh, G. Y., Thurston, G., Alitalo, K. Control of vascu....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
