Method Article

Визуализация и количественный анализ эмбрионального ангиогенеза у Xenopus tropicalis

DOI:

10.3791/55652

⸱

May 25th, 2017

 , 
1Brain Korea 21 PLUS Project for Medical Science, Yonsei University College of Medicine, 2Department of Anatomy, Brain Research Institute, Yonsei University College of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол демонстрирует основанный на флуоресценции метод для визуализации сосудистой сети и для количественной оценки ее сложности у Xenopus tropicalis . Кровеносные сосуды можно визуализировать через несколько минут после введения флуоресцентного красителя в сердцебиение эмбриона после генетических и / или фармакологических манипуляций для исследования сердечно-сосудистого развития in vivo .

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Кровеносные сосуды снабжают кислородом и питательными веществами всюду по телу, и формирование сосудистой сети находится под жестким контролем за развитием. Эффективная визуализация кровеносных сосудов in vivo и надежная количественная оценка их сложности являются ключевыми для понимания биологии и болезней сосудистой сети. Здесь мы предоставляем подробный метод визуализации кровеносных сосудов с коммерчески доступным флуоресцентным красителем, ацетилированным человеческим плазмом липопротеидом низкой плотности DiI комплекса (DiI-AcLDL) и количественной оценкой их сложности у Xenopus tropicalis . Кровеносные сосуды могут быть помечены простой инъекцией DiI-AcLDL в сердцебиение эмбриона, а кровеносные сосуды всего эмбриона могут быть отображены в живых или фиксированных эмбрионах. В сочетании с пертурбацией гена путем целенаправленного микроинъекции нуклеиновых кислот и / или применения ванны фармакологических реагентов роль гена или сигнального пути в развитии сосудов может быть inveСтигировали в течение одной недели, не прибегая к сложным генетически модифицированным животным. Из-за четко определенной венозной системы Xenopus и его стереотипного ангиогенеза, прорастание уже существующих сосудов, сложность судна могут быть количественно определены после экспериментов по возмущению. Этот относительно простой протокол должен служить легко доступным инструментом в различных областях сердечно-сосудистых исследований.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Васкулогенез, образование новых кровеносных сосудов из новорожденных эндотелиальных клеток и ангиогенез, образование новых сосудов из ранее существовавших сосудов, являются двумя различными процессами, которые формируют эмбриональную сосудистую сеть 1 . Любая дисрегуляция в этих процессах приводит к различным сердечным заболеваниям и структурным аномалиям сосудов. Более того, рост опухоли связан с неконтролируемым ростом сосудов. Таким образом, молекулярные механизмы, лежащие в основе васкулогенеза и ангиогенеза, являются объектом интенсивного исследования 2 .

Xenopus и данио являются привлекательными моделями позвоночных для исследований васкулогенеза и ангиогенеза по нескольким причинам. Во-первых, их эмбрионы небольшие; Поэтому относительно просто отобразить всю сосудистую сеть. Во-вторых, эмбриональное развитие происходит быстро; Требуется всего несколько дней для развития всей сосудистой сети, в течение которых развивающиеся васкулы Ature может отображаться. В-третьих, генетические и фармакологические вмешательства до и во время формирования сосудов легко выполнить, например, посредством микроинъекции антисмысловых морфолиновых нуклеотидов (МО) в развивающийся эмбрион или посредством применения ванн препаратов 3 , 4 , 5 .

Уникальное преимущество Xenopus над рыбой данио заключается в том, что эмбриологические манипуляции могут выполняться, потому что Xenopus следует стереотипным голообластическим расколам, и эмбриональная карта судьбы четко определена 6 . Например, можно создать эмбрион, в котором только одну боковую сторону генетически манипулируют путем инъекции антисмысловой МО к одной клетке на стадии с двумя клетками. Также возможно пересадить зачаток сердца от одного зародыша к другому, чтобы определить, выполняет ли ген свою функцию с помощью клеточного-внутреннего или экссудативного механизмаAss = "xref"> 7. Хотя эти методы в основном были разработаны у Xenopus laevis , который является аллотетраплаидным и поэтому не является идеальным для генетических исследований, их можно непосредственно применять к Xenopus tropicalis , близкородственному диплоидному виду 8 .

Один из способов визуализации сосудистой сети в живом эмбрион Xenopus заключается в введении флуоресцентного красителя для маркировки кровеносных сосудов. Ацетилированный липопротеин низкой плотности (AcLDL), меченный флуоресцентной молекулой, такой как DiI, является очень полезным зондом. В отличие от неацетилированного LDL, AcLDL не связывается с рецептором LDL 9, а эндоцитируется макрофагами и эндотелиальными клетками. Инъекция DiI-AcLDL в сердце живого животного приводит к специфическому флуоресцентному мечению эндотелиальных клеток, и вся сосудистая сеть может быть визуализирована с помощью флуоресцентной микроскопии в живых или фиксированных эмбрионах 4 .

Здесь мыПодробные протоколы визуализации и количественного определения кровеносных сосудов с использованием DiI-AcLDL у Xenopus tropicalis ( рис. 1 ). Мы представляем ключевые практические вопросы, примеры успешных и неудачных экспериментов. Кроме того, мы предоставляем простой метод количественного анализа сосудистой сложности, который может быть полезен при оценке влияния генетических и экологических факторов на формирование сосудистой сети.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все эксперименты соответствовали протоколам, утвержденным Комиссией по лечебным учреждениям и комитетам по применению ухода за больными при Университете им. Йонсей.

1. Приготовление эмбрионов Xenopus tropicalis

ПРИМЕЧАНИЕ : Зародыши Xenopus tropicalis были получены, как описано ранее 10 , с небольшой модификацией. Зародыши Xenopus tropicalis были поставлены согласно таблицам Nieuwkoop и Faber 11 .

  1. Индукция овуляции
    1. Для предварительного первичного введения хорионического гонадотропина человека (hCG) в дорсальный лимфатический мешок пары лягушек (один мужчина и одна женщина) на день до дня спаривания. Вводите 20 единиц на женскую лягушку и 10 единиц на самца. Дом мужчины и женщины в одном танке на ночь (более 18 ч).
    2. Для начала, на следующий день, введите 200 единиц ХГЧ в предварительно загрунтованную самку и 100 единиц ХГЧ в предварительно загрунтованнуюмужской; Заложенная самка начнет откладывать яйца примерно через 3 часа и будет продолжать делать это в течение дня. Держите пару мужчин и женщин вместе для естественного спаривания или в отдельных резервуарах для оплодотворения in vitro (шаг 1.2).
  2. опыление
    ПРИМЕЧАНИЕ. Яйца можно оплодотворить путем естественного спаривания или оплодотворения in vitro . В естественных спариваниях яйца оплодотворяются по мере их укладки, и поэтому сроки оплодотворения нельзя контролировать. Альтернативно, примированная самка лягушки может быть размещена в отдельном резервуаре, и неоплодотворенные яйца могут быть собраны для оплодотворения in vitro, в результате чего одновременно оплодотворяются сотни эмбрионов. Последний подход полезен, когда микроинъекция, нацеленная на бластомер, будет выполняться до маркировки сосудов. В этом подходе, однако, самец приносится в жертву.
    1. Естественное спаривание
      1. Оставьте загрунтованные женские и мужские пары в одной емкости. Самец обхватит fЧто приводит к немедленному оплодотворению отложенных яиц. Соберите яйца со стеклянной или пластиковой пипеткой и перенесите их в чашку Петри. Чтобы предотвратить прилипание яиц к пипетке, на внутреннюю поверхность пипетки нанесите 0,5% альбумина бычьей сыворотки (BSA).
    2. Экстракорпоральное оплодотворение (ЭКО)
      1. Отрежьте примированную самку от самца после прайминга. Самка начнет откладывать яйца спонтанно примерно через 3 часа. Перенесите несколько отложенных яиц с помощью пипетки с покрытием BSA в чашку Петри и проверьте их качество под микроскопом. Если были заложены здоровые яйца (прозрачный пигмент, эластичный шаровидный), приготовьте их к вскрытию семенников от примированного самца.
      2. Сделайте 0,4% метансульфоната трикаина (MS222) для эвтаназии и введите 300 мкл в дорсальный лимфатический мешок праймированного самца. Примерно через 10 минут самец потеряет чувство равновесия и останется на плаву; Подтвердите, что самец подвергается эвтаназии путем ущемления задней ноги с помощьюПара тупых щипцов и не заметила никакого ответа.
      3. Разделите два семенника, очистите их, быстро постучав по ним безворсовой бумагой, и перенесите их в микропробирку, содержащую 1 мл 60% среды Лейбовица L-15 (60%) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS); Подробная процедура описана в другом месте 10 .
      4. Мягко mince яичек с пестиком для извлечения спермы. При этой концентрации ( т. Е. 2 яичка в 1 мл 10% FBS в 60% L-15) несколько капель раствора яичка (0,1 мл) могут оплодотворить приблизительно триста яиц. Оставшуюся сперму можно хранить при 4 ° C в плотно закрытой пробирке и использовать для ЭКО на следующий день.
      5. Отжать яйца от самки в маленькую чашку Петри. Держите верхнюю часть женщины вверх ногами на ладони и поместите указательный палец между задними лапами. Расправьте его задние лапы указательным пальцем, а другой рукой обнажите клоаку. Прикоснитесь к клоаке к чашке Петри. Покрытие тОн чашку Петри с 0,5% BSA равномерно распределить яйца в качестве монослоя во время ЭКО.
      6. Добавьте несколько капель (0,1 мл) содержащей спермы среды L-15 к яйцам. Для синхронного оплодотворения осторожно размешайте раствор спермы на чашке. Через 4 минуты при комнатной температуре наполните чашку Петри 0,01 × модифицированным солевым раствором Барта (MBS), инкубируйте в течение 10 минут и замените раствор 0,1 × МБС. Оплодотворенные яйца будут подвергаться первому расщеплению приблизительно через 1 ч при комнатной температуре. 1x MBS представляет собой 88 мМ NaCl, 1 мМ KCl, 2,5 мМ NaHCO 3 , 5 мМ HEPES, 1 мМ MgSO 4 и 0,7 мМ CaCl 2 , pH 7,5.
  3. (Необязательно) Инъекция антисмысловых морфолиновых олигонуклеотидов (МО) и / или мРНК
    1. Чтобы исследовать влияние представляющего интерес гена на образование сосудов, выполните микроинъекцию антисмысловых MO и / или мРНК.
    2. Для таких экспериментов, обезжиренное яйца с 2% L-цистеина в 1x MBS (рН 7.5-7.8).Замените 0,1x МБС в чашке, содержащей оплодотворенные эмбрионы, с 2% L-цистеином в 1x МБС. Аккуратно взболтайте блюдо, чтобы смешать раствор.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Обычно требуется, чтобы эмбрионы были обезжирены в течение 5 минут. Во время этого шага часто наблюдайте за яйцами, чтобы убедиться, что они не слишком подвержены воздействию раствора. Если яйца переэкспонированы, они потеряют эластичность и станут уплощенными, что вызовет аномальное развитие и летальность.
    3. Вымойте яичный порошок пять раз с 0,1x МБС. Выполните микроинъекцию в 4% фиколе, растворенной в 0,1х МБС. Обычно вводят 4 нг МО и 600 мкг мРНК на бластомер на стадии двух клеток. Внедрение в одну клетку для манипуляции экспрессией гена только на одной стороне эмбриона. Используйте неинъецированную сторону того же эмбриона, что и контрольная.
    4. В качестве другого контроля специфичности генной манипуляции вводите такое же количество контрольного МО (CoMO) или контрольной мРНК ( например, мРНК бета-галактозидазы). CoMO должен иметь те же mОлекулярный вес как ген-специфическая МО и не должен нацеливаться на какой-либо ген в геноме Xenopus . Для легкой визуализации инъецированной стороны используйте меченый флуоресцеином MO или совместно инъецируйте индикатор ( например, мРНК EGFP).
    5. Оставьте введенные эмбрионы в 4% Ficoll в течение 2 ч, а затем перенесите их в новую 60-мм чашку Петри, заполненную 0,1 МБС.
  4. привлечение
    1. Поднимите эмбрионы при 23 ° C. Хотя скорость развития может замедляться или ускоряться при использовании температур ниже или выше 23 ° C, соответственно (диапазон: 16-26 ° C), рекомендуется поднимать их при 23 ° C.
  5. (Необязательно) Лечение фармакологическими реагентами
    1. Для фармакологических манипуляций вводят лекарственные средства в развивающиеся эмбрионы путем применения ванны.

2. Подготовка инъекции DiI-AcLDL

  1. Сделайте коническую стеклянную пипетку, используя стандартную мишеньКопировальная машина. Поместите трубку из боросиликатного стекла в съемник микропипетки и используйте следующие настройки: давление, 200; Тепло, 30; Pull, 30; Скорость 120; Время, 200.
  2. Хранить маточный раствор DiI-AcLDL при 4 ° C. Возьмите верхнюю прозрачную часть раствора для инъекций, но не осажденные частицы на дне пробирки. Любой мусор в стеклянной пипетке будет мешать правильному выталкиванию раствора.
  3. Заполните подготовленную стеклянную пипетку подходящим количеством раствора DiI-AcLDL (~ 5 мкл), используя микропогрузчик.
  4. Сцепите наконечник стеклянной пипетки понемногу, используя прекрасные пара щипцов (число 55). Настроить систему нагнетания под давлением, чтобы примерно 5 нл раствора выбрасывалось за один раз; Для того, чтобы окрасить сосуды одного эмбриона, достаточно 50-60 нл раствора DiI-AcLDL.
  5. Не оставляйте загруженную DiI-AcLDL пипетку на воздухе в течение длительного периода времени, чтобы избежать высыхания. Держите наконечник пипетки погружен в 0,04% MS222 в 0,1х МБС-растворе. Перед инъекцией в эмбрион (шаг 4.2.1), проверьте, выбрасывается ли такое же количество красителя.

3. Установка впрыска

  1. Форма Sylgard
    1. Чтобы подготовить небольшую форму Sylgard, смешайте основание Sylgard и отвердитель с весовым соотношением 10 к 1. Заполните приблизительно половину маленькой чашки Петри (чашка 35 мм или 60 мм) с помощью этого смешанного раствора и затем оставьте его для затвердевания приблизительно 48 ч при комнатной температуре.
  2. обезболивание
    1. Используйте 0.04% MS222 в 1x MBS (pH 7.5-8.0) для анестезии. Когда требуется длительная анестезия ( например, во время живой визуализации), используйте 0.04% MS222 в 0.1x MBS, чтобы уменьшить осмотический дисбаланс. Чтобы отрегулировать pH, добавьте несколько капель NaOH (~ 20 мкл) и проверьте pH с помощью бумаги для измерения рН.
    2. Подождите, пока перенесенные эмбрионы перестанут двигаться. Прикоснитесь к спинным плавникам эмбрионов и проверьте, отвечают ли они на подтверждение полногоnesthesia.
  3. Расположение эмбрионов для инъекций
    1. Выровняйте поверхность закаленной формы Sylgard тонким и острым лезвием. Сделайте V-образный вогнутый отступ, в который помещают эмбрионы (см . Рисунок 2D ). Поместите анестезированный эмбрион, вентральной стороной вверх, слегка наклонным образом (приблизительно 30 °) ( Рисунок 2D ).
    2. Заполните форму раствором MS222 и поместите эмбрионы в форму.

4. Инъекция DiI-AcLDL

  1. Разрез на коже над сердцем
    1. Подготовьте два булавки (Minutiens, 0,10 мм), чтобы разрезать кожу над сердцем. Плотно закрепите каждый штифт на держателе; Сердце должно быть легко идентифицируемым, поскольку оно пульсирует ( рисунок 2A-2C , розовый).
    2. Проколите кожу эмбриона одним пальцем. Вставьте штырь через отверстие в промежуток между сердцем и кожей ( рис. 2C , сплошная стрелка). Не прокалывайте сердце. Поместите вставленную часть этого штифта в область, где будет сделан разрез.
    3. Сделайте линейный разрез, аккуратно протирая другой штырь, находящийся вне кожи, против вставленного штифта. Аккуратно расширьте этот разрез двумя пальцами, обнажив сердце ( Рисунок 2B ' и 2D' , стрелка). Пипетка, загруженная DiI-AcLDL, теперь может непосредственно приближаться к сердцу ( рисунок 2D ' ).
  2. впрыскивание
    1. Вставьте наконечник погруженной стеклянной пипетки в сердце и введите 50-60 нл раствора DiI-AcLDL примерно в 10 импульсов выброса. Не вводите чрезмерное количество раствора, так как это заставляет сердце разрываться. Проверьте, продолжает ли сердце биться после инъекции. После каждой инъекции проверяют, выбрасывается ли такое же количество DiI-AcLDL; В противном случае наконечник пипетки может быть заблокирован (см. Шаг 2.5).
  3. Восстановление и визуальный скрининг
    1. Перенесите введенные эмбрионы в новую чашку Петри, заполненную 0,1 МБС для восстановления. Через 5-10 мин головастики должны прийти в себя и начать двигаться. В это время маркированные сосуды могут быть отображены. Рекомендуется визуально экранировать успешно помеченные эмбрионы под флуоресцентным микроскопом ( рис. 3А и 3В ). Если в эмбрион вводится недостаточное количество DiI-AcLDL, его можно снова вводить ( рис. 3C ).
    2. Откажитесь от головастиков, у которых есть другие органы, обозначенные ( рис. 3D ). Продолжайте, пока не будет получено необходимое количество успешно помеченных эмбрионов.
  4. (Дополнительно) Фиксация эмбрионов
    1. Для более тщательной визуализации кровеносных сосудов используйте конфокальную микроскопию; Было бы легче исправить помеченные эмбрионы для конфокальной микроскопии. Сначала обезболить помеченные эмбрионы в 0,04% MS222 в 1 МБS (pH 7,5-8,0) и затем фиксируют их в 4% параформальдегиде в 1X фосфатно-буферном солевом растворе (PBS) в течение 1 часа при комнатной температуре. Фиксированные эмбрионы могут храниться в течение нескольких дней при температуре 4 ° C; Защищать инъецированные образцы от света, чтобы избежать фотообесцвечивания DiI.

5. Изображения DiI-AcLDL

  1. Стереоскопическое изображение
    1. Сфотографируйте под флуоресцентным стереоскопическим микроскопом ( рис. 3 ), чтобы оценить общую морфологию сосудистой сети.
    2. Расплавьте 1% агарозу в 1x PBS для фиксированных эмбрионов или в 1x MBS для живых изображений. Налейте расплавленную агарозу в чашку Петри и подождите, пока она не затвердеет. Сделайте поверхностный отпечаток на поверхности агарозного геля, который будет соответствовать эмбриону, который будет отображаться, когда он лежит на боковой стороне. Наполните блюдо буфером (раствор MS222 для обезболиваемых эмбрионов или 1x PBS для фиксированных эмбрионов).
  2. Флуоресцентная микроскопия (Rhodamine filter seт)
    1. Поскольку DiI является красителем с зеленым возбуждением и красным излучением, изображение с использованием стандартного набора фильтров для родамина или спектрально связанных флуорофоров (максимальное возбуждение при 554 нм и эмиссия при 571 нм). Поместите инъецированные эмбрионы в углубления на агарозной плесени и сделайте фотографии ( рис. 3 ).
  3. Конфокальная микроскопия
    ПРИМЕЧАНИЕ. Для более подробного анализа архитектуры сосудов используйте конфокальную микроскопию.
    1. Если вы используете инвертированный микроскоп, поместите эмбрионы на блюдо со стеклянным дном. Добавьте несколько капель 1 PBS и иммобилизуйте их, поместив наклейку на крышку. Удалите избыток PBS. Если живые эмбрионы должны быть отображены, используйте обезболиваемые эмбрионы и используйте 0,015% MS222 в 0,1х МБС вместо PBS.
    2. Для получения изображений с малым увеличением используйте объект 4X - 10X, чтобы найти интересующую область; Ростральная часть задней кардинальной вены (PCV) является полезным регионом для исследования ангиогенеза развития (рис. 4, пунктирящики).
      1. Используйте настройку сбора для флуорофора красного излучения (такого как родамин).
      2. Сделайте z-stacked изображения, визуализируя боковую половину эмбриона. Во-первых, сфокусируйтесь на PCV на боковой стороне рядом с объективом, а затем установите нижний предел фокуса в том месте, где находятся близко расположенные к цели суда. Установите верхний предел в том месте, где может быть сфокусирована медиальная часть изображения PCV. Изобразите всю эту боковую половину эмбриона. Используйте программное обеспечение, которое хранит метаданные в настройках сбора данных, таких как шкалы x, y и z, так как они необходимы для расчета длины судна.
      3. Если необходимо, используйте режим сканирования черепицы, чтобы отобразить всю сосудистую сеть эмбриона. Эмпирически определите количество горизонтальных и вертикальных плиток.
    3. Для получения изображения с высоким увеличением выполните описанные выше процедуры, чтобы получить изображение ростральной части PCV и четырех самых крупных межсомитовых жил (ISV) ( рис. 4 ,Пунктирная рамка). Откорректируйте количество стеков (z-stack) и плиток (сканирование фрагментов) соответствующим образом.

6. Количественная оценка сосудов, меченных DiI

ПРИМЕЧАНИЕ. Суда с маркировкой DiI можно отследить вручную или с помощью программного обеспечения. Мы используем «Simple neurite tracer», бесплатный плагин ImageJ (NIH), который позволяет полуавтоматическую трассировку трубчатых структур, таких как кровеносные сосуды и нейриты 12 . Используя это бесплатное программное обеспечение, можно рассчитать следующие параметры. Подробная процедура использования этого программного обеспечения описана в другом месте (https://imagej.net/Simple_Neurite_Tracer) 12 . Ниже мы используем примеры сосудистой сети эмбрионов, в которых передача сигналов Tie2 ингибируется или усиливается ( рисунок 4A-4C ) 5 . Антисмысловые эмбрионы, инъецированные Tie2MO, уменьшают ангиогенез и укорачивают ISV ( рисунок 4B ), тогда как совместная инъекция конститутивно активного Tie2Мутантная мРНК (caTie2 мРНК) более-спасает этот фенотип, приводя к обильным ветвям ISV ( рис. 4C ).

  1. ISV-длины
    1. Используя простой нейритовый трассировщик, вычислите длину каждого отслеживаемого судна. Вычислите длины 4-х ростральных ISV.
  2. Отделения ISV
    ПРИМЕЧАНИЕ. У эмбрионов дикого типа на стадии 42 только самые короткие ветви растут у рострального большинства ISV.
    1. В простейшем методе нейритов проследите эти маленькие сосуды после того, как создадите ISV, из которого они берут начало. Рассчитайте следующие параметры этих ветвей, исходящие от независимых поставщиков ПО.
    2. Общее количество филиалов
      1. После того, как все ISV и связанные ветви прослеживаются, вычислите общее число ветвей ( рисунок 5B-5D ).
    3. Заказ филиала
      1. Так как простой нейритовый трассер записывает порядок каждой ветви ( рис. 5А ), вычисляетЕ - количество ответвлений для каждого заказа. Большинство сосудов у эмбрионов дикого типа должны быть первичными ветвями ( т.е. ISVs).
    4. Индекс сложности вены (VCI)
      1. Поскольку VCI является полезным параметром для сложности судна, что дает больший вес ветвям более высокого порядка, вычислить VCI для каждого эмбриона, используя формулу на рисунке 5A . Например, эмбрионы, инъецированные Tie2MO, имеют более низкий VCI по сравнению с контролем ( фиг. 5B и 5C ), и caTie2, инъецированные мРНК эмбрионы, имеют более высокий VCI ( фиг. 5D ).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Временная шкала экспериментов (рисунки 1 и 2)

Вскоре после оплодотворения может быть проведена целенаправленная микроинъекция для модуляции экспрессии генов. Например, антисмысловая МО, которая специфически связывается с инициирующим кодоном эндогенной мРНК Tie2, может быть инъецирована, ингибируя трансляцию Tie2-мишени-мишени при помощи стерических затруднений. МО может быть конъюгирован с флуоресцеином для легкого визуального с...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Протокол, представленный здесь, был впервые разработан Али Х. Бриванлу и его коллегами для изучения событий развития во время формирования сосудов у Xenopus laevis 4 , но, как показано в этой рукописи, он может применяться к другим мелким животным. Инъекция красителя в сердце проста для выполнения, и вся сосудистая сеть может быть отображена под микроскопом флуоресцентного вскрытия, а также конфокальным микроскопом. Если краситель вводится в сердце во время развития сосудов, динамика рос...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было вдохновлено работой Levine et al. , В котором описан этот экспериментальный метод и дано подробное описание развития сосудов у Xenopus laevis. Мы благодарим членов нашей лаборатории за их вклад. Это исследование было поддержано исследовательской инициативой Университета Йонсей в 2015 году (2015-22-0095) и Программой развития биомедицинских технологий Национального исследовательского фонда (NRF), финансируемой Министерством науки, ИКТ и планирования будущего ( NRF-2013M3A9D5072551)

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Чашка Петри 35 ммSPL10035Рамка формы Sylgard
60 мм Чашка ПетриSPL10060Лоток для поднятия эмбрионов
Боросиликатное стеклоИнструмент SutterB100-50-10Игла для инъекций
BSASigmaA3059-10GРеактив для покрытия
CaCl2D.S.P.GR Реактив0,1x MBS
компонент Покровное стеклоSuperiorHSU-0111520Для конфокальной визуализации
DiI-AcLDLThermo Fisher ScientificL3484Раствор для окрашивания сосудов
FBSHycloneSH.30919.02Для хранения яичек
Волоконно-оптический осветительWorld Precision InstrumentsZ-LITE-ZLight
FicollSigmaF4375Буфер для впрыска
Пылающий/коричневый Пуллер для микропипетокИнструмент для саттераP-97Пуллер для инъекций
ЩипецFine Science Tool11255-20Для вылупления эмбрионов и<бр/> резки кончика иглы
Стеклянное дно тарелкиSPL100350Для конфокальной визуализации
ХГЧMNS КореяДля праймирования лягушек
HEPESSigmaH3375Буферный агент
ИнкубаторЛаборатория КомпаньонILP-02Для выращивания эмбрионов
KClDAEJUNG6566-4400MBS компонент
L15 средаGibco11415-114Для хранения яичек
L-цистеинSigma168149-100GДежелейный реагент
MgSO4SigmaM7506MBS компонент
МикропробиркаAxygenMCT-175-C-SДля хранения яичек
MS222SigmaE10521Обезболивающий порошок
NaClDAEJUNG7647-14-5MBS компонент
NaOHSigmaS-0899Реактив для коррекции pH
ПараформальдегидSigmaP6148Фиксаторы
PBSBIOSESANGP2007Буфер для визуализации
pH бумагиSigmaP4536-100EAДля подтверждения pH
PICO-LITER INJECTORWaner instrumentsPLI-100AДля инъекционного
штифтаPinservice26002-10Для разреза
Держатель булавкиScitech Korea26016-12Для разреза Прецизионный
стерео зум Бинокулярный микроскопWorld Прецизионные приборыPZMIIIДля визуального досмотра
Стандартный микроманипулятор с ручным управлением Waner instrumentsW4 64-0056Для микроинъекции
SYLGARD 184 КомплектDow CorningДля DiI инъекции
Трансфер пипеткаКорея Ace Scientific Co.YM. B78-400Для сбора яйцеклеток и<бр/> эмбрионов

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Herbert, S. P., Stainier, D. Y. Molecular control of endothelial cell behaviour during blood vessel morphogenesis. Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (9), 551-564 (2011).
  2. Augustin, H. G., Koh, G. Y., Thurston, G., Alitalo, K. Control of vascular morphogenesis and homeostasis through the angiopoietin-Tie system. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (3), 165-177 (2009).
  3. Lawson, N. D., Weinstein, B. M. Arteries and veins: making a difference with zebrafish. Nat Rev Genet. 3 (9), 674-682 (2002).
  4. Levine, A. J., Munoz-Sanjuan, I., Bell, E., North, A. J., Brivanlou, A. H. Fluorescent labeling of endothelial cells allows in vivo, continuous characterization of the vascular development of Xenopus laevis. Dev Biol. 254 (1), 50-67 (2003).
  5. Yang, C., et al. Calmodulin Mediates Ca2+-Dependent Inhibition of Tie2 Signaling and Acts as a Developmental Brake During Embryonic Angiogenesis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 36 (7), 1406-1416 (2016).
  6. Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 32-cell-stage Xenopus embryo. Dev Biol. 122 (2), 300-319 (1987).
  7. Elliott, K. L., Houston, D. W., Fritzsch, B. Transplantation of Xenopus laevis tissues to determine the ability of motor neurons to acquire a novel target. PLoS One. 8 (2), 55541(2013).
  8. Grainger, R. M. Xenopus tropicalis as a model organism for genetics and genomics: past, present, and future. Methods Mol Biol. 917, 3-15 (2012).
  9. Weisgraber, K. H., Innerarity, T. L., Mahley, R. W. Role of lysine residues of plasma lipoproteins in high affinity binding to cell surface receptors on human fibroblasts. J Biol Chem. 253 (24), 9053-9062 (1978).
  10. Showell, C., Conlon, F. L. Egg collection and in vitro fertilization of the western clawed frog Xenopus tropicalis. Cold Spring Harb Protoc. 2009 (9), 5293(2009).
  11. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal Table of Xenopus laevis (Daudin). , North-Holland Publishing Company. Guilders. Amsterdam. (1956).
  12. Longair, M. H., Baker, D. A., Armstrong, J. D. Simple Neurite Tracer: open source software for reconstruction, visualization and analysis of neuronal processes. Bioinformatics. 27 (17), 2453-2454 (2011).
  13. Marshak, S., Nikolakopoulou, A. M., Dirks, R., Martens, G. J., Cohen-Cory, S. Cell-autonomous TrkB signaling in presynaptic retinal ganglion cells mediates axon arbor growth and synapse maturation during the establishment of retinotectal synaptic connectivity. J Neurosci. 27 (10), 2444-2456 (2007).
  14. Cha, H. J., et al. Evolutionarily repurposed networks reveal the well-known antifungal drug thiabendazole to be a novel vascular disrupting agent. PLoS Biol. 10 (8), 1001379(2012).
  15. Ny, A., et al. A transgenic Xenopus laevis reporter model to study lymphangiogenesis. Biol Open. 2 (9), 882-890 (2013).
  16. Bussmann, J., et al. Arteries provide essential guidance cues for lymphatic endothelial cells in the zebrafish trunk. Development. 137 (16), 2653-2657 (2010).
  17. Li, X. M., Hu, Z., Jorgenson, M. L., Slayton, W. B. High levels of acetylated low-density lipoprotein uptake and low tyrosine kinase with immunoglobulin and epidermal growth factor homology domains-2 (Tie2) promoter activity distinguish sinusoids from other vessel types in murine bone marrow. Circulation. 120 (19), 1910-1918 (2009).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Xenopus tropicalisBlood Vessel VisualizationDiI AcLDL InjectionFluorescent Dye LabelingVascular Network AnalysisEmbryonic AngiogenesisConfocal MicroscopyVein Complexity IndexGene PerturbationPharmacological Application

Related Articles