Визуализация и количественный анализ эмбрионального ангиогенеза у Xenopus tropicalis

Васкулогенез, образование новых кровеносных сосудов из новорожденных эндотелиальных клеток и ангиогенез, образование новых сосудов из ранее существовавших сосудов, являются двумя различными процессами, которые формируют эмбриональную сосудистую сеть ¹ . Любая дисрегуляция в этих процессах приводит к различным сердечным заболеваниям и структурным аномалиям сосудов. Более того, рост опухоли связан с неконтролируемым ростом сосудов. Таким образом, молекулярные механизмы, лежащие в основе васкулогенеза и ангиогенеза, являются объектом интенсивного исследования ² .

Xenopus и данио являются привлекательными моделями позвоночных для исследований васкулогенеза и ангиогенеза по нескольким причинам. Во-первых, их эмбрионы небольшие; Поэтому относительно просто отобразить всю сосудистую сеть. Во-вторых, эмбриональное развитие происходит быстро; Требуется всего несколько дней для развития всей сосудистой сети, в течение которых развивающиеся васкулы Ature может отображаться. В-третьих, генетические и фармакологические вмешательства до и во время формирования сосудов легко выполнить, например, посредством микроинъекции антисмысловых морфолиновых нуклеотидов (МО) в развивающийся эмбрион или посредством применения ванн препаратов ^{3 , 4 , 5} .

Уникальное преимущество Xenopus над рыбой данио заключается в том, что эмбриологические манипуляции могут выполняться, потому что Xenopus следует стереотипным голообластическим расколам, и эмбриональная карта судьбы четко определена ⁶ . Например, можно создать эмбрион, в котором только одну боковую сторону генетически манипулируют путем инъекции антисмысловой МО к одной клетке на стадии с двумя клетками. Также возможно пересадить зачаток сердца от одного зародыша к другому, чтобы определить, выполняет ли ген свою функцию с помощью клеточного-внутреннего или экссудативного механизмаAss = "xref"> 7. Хотя эти методы в основном были разработаны у Xenopus laevis , который является аллотетраплаидным и поэтому не является идеальным для генетических исследований, их можно непосредственно применять к Xenopus tropicalis , близкородственному диплоидному виду ⁸ .

Один из способов визуализации сосудистой сети в живом эмбрион Xenopus заключается в введении флуоресцентного красителя для маркировки кровеносных сосудов. Ацетилированный липопротеин низкой плотности (AcLDL), меченный флуоресцентной молекулой, такой как DiI, является очень полезным зондом. В отличие от неацетилированного LDL, AcLDL не связывается с рецептором LDL ^9, а эндоцитируется макрофагами и эндотелиальными клетками. Инъекция DiI-AcLDL в сердце живого животного приводит к специфическому флуоресцентному мечению эндотелиальных клеток, и вся сосудистая сеть может быть визуализирована с помощью флуоресцентной микроскопии в живых или фиксированных эмбрионах ⁴ .

Здесь мыПодробные протоколы визуализации и количественного определения кровеносных сосудов с использованием DiI-AcLDL у Xenopus tropicalis ( рис. 1 ). Мы представляем ключевые практические вопросы, примеры успешных и неудачных экспериментов. Кроме того, мы предоставляем простой метод количественного анализа сосудистой сложности, который может быть полезен при оценке влияния генетических и экологических факторов на формирование сосудистой сети.

Все эксперименты соответствовали протоколам, утвержденным Комиссией по лечебным учреждениям и комитетам по применению ухода за больными при Университете им. Йонсей.

1. Приготовление эмбрионов Xenopus tropicalis

ПРИМЕЧАНИЕ : Зародыши Xenopus tropicalis были получены, как описано ранее ¹⁰ , с небольшой модификацией. Зародыши Xenopus tropicalis были поставлены согласно таблицам Nieuwkoop и Faber ¹¹ .

1. Индукция овуляции
   1. Для предварительного первичного введения хорионического гонадотропина человека (hCG) в дорсальный лимфатический мешок пары лягушек (один мужчина и одна женщина) на день до дня спаривания. Вводите 20 единиц на женскую лягушку и 10 единиц на самца. Дом мужчины и женщины в одном танке на ночь (более 18 ч).
   2. Для начала, на следующий день, введите 200 единиц ХГЧ в предварительно загрунтованную самку и 100 единиц ХГЧ в предварительно загрунтованнуюмужской; Заложенная самка начнет откладывать яйца примерно через 3 часа и будет продолжать делать это в течение дня. Держите пару мужчин и женщин вместе для естественного спаривания или в отдельных резервуарах для оплодотворения in vitro (шаг 1.2).
2. опыление
   ПРИМЕЧАНИЕ. Яйца можно оплодотворить путем естественного спаривания или оплодотворения in vitro . В естественных спариваниях яйца оплодотворяются по мере их укладки, и поэтому сроки оплодотворения нельзя контролировать. Альтернативно, примированная самка лягушки может быть размещена в отдельном резервуаре, и неоплодотворенные яйца могут быть собраны для оплодотворения in vitro, в результате чего одновременно оплодотворяются сотни эмбрионов. Последний подход полезен, когда микроинъекция, нацеленная на бластомер, будет выполняться до маркировки сосудов. В этом подходе, однако, самец приносится в жертву.
   1. Естественное спаривание
      1. Оставьте загрунтованные женские и мужские пары в одной емкости. Самец обхватит fЧто приводит к немедленному оплодотворению отложенных яиц. Соберите яйца со стеклянной или пластиковой пипеткой и перенесите их в чашку Петри. Чтобы предотвратить прилипание яиц к пипетке, на внутреннюю поверхность пипетки нанесите 0,5% альбумина бычьей сыворотки (BSA).
   2. Экстракорпоральное оплодотворение (ЭКО)
      1. Отрежьте примированную самку от самца после прайминга. Самка начнет откладывать яйца спонтанно примерно через 3 часа. Перенесите несколько отложенных яиц с помощью пипетки с покрытием BSA в чашку Петри и проверьте их качество под микроскопом. Если были заложены здоровые яйца (прозрачный пигмент, эластичный шаровидный), приготовьте их к вскрытию семенников от примированного самца.
      2. Сделайте 0,4% метансульфоната трикаина (MS222) для эвтаназии и введите 300 мкл в дорсальный лимфатический мешок праймированного самца. Примерно через 10 минут самец потеряет чувство равновесия и останется на плаву; Подтвердите, что самец подвергается эвтаназии путем ущемления задней ноги с помощьюПара тупых щипцов и не заметила никакого ответа.
      3. Разделите два семенника, очистите их, быстро постучав по ним безворсовой бумагой, и перенесите их в микропробирку, содержащую 1 мл 60% среды Лейбовица L-15 (60%) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS); Подробная процедура описана в другом месте ¹⁰ .
      4. Мягко mince яичек с пестиком для извлечения спермы. При этой концентрации ( т. Е. 2 яичка в 1 мл 10% FBS в 60% L-15) несколько капель раствора яичка (0,1 мл) могут оплодотворить приблизительно триста яиц. Оставшуюся сперму можно хранить при 4 ° C в плотно закрытой пробирке и использовать для ЭКО на следующий день.
      5. Отжать яйца от самки в маленькую чашку Петри. Держите верхнюю часть женщины вверх ногами на ладони и поместите указательный палец между задними лапами. Расправьте его задние лапы указательным пальцем, а другой рукой обнажите клоаку. Прикоснитесь к клоаке к чашке Петри. Покрытие тОн чашку Петри с 0,5% BSA равномерно распределить яйца в качестве монослоя во время ЭКО.
      6. Добавьте несколько капель (0,1 мл) содержащей спермы среды L-15 к яйцам. Для синхронного оплодотворения осторожно размешайте раствор спермы на чашке. Через 4 минуты при комнатной температуре наполните чашку Петри 0,01 × модифицированным солевым раствором Барта (MBS), инкубируйте в течение 10 минут и замените раствор 0,1 × МБС. Оплодотворенные яйца будут подвергаться первому расщеплению приблизительно через 1 ч при комнатной температуре. 1x MBS представляет собой 88 мМ NaCl, 1 мМ KCl, 2,5 мМ NaHCO ₃ , 5 мМ HEPES, 1 мМ MgSO ₄ и 0,7 мМ CaCl ₂ , pH 7,5.
3. (Необязательно) Инъекция антисмысловых морфолиновых олигонуклеотидов (МО) и / или мРНК
   1. Чтобы исследовать влияние представляющего интерес гена на образование сосудов, выполните микроинъекцию антисмысловых MO и / или мРНК.
   2. Для таких экспериментов, обезжиренное яйца с 2% L-цистеина в 1x MBS (рН 7.5-7.8).Замените 0,1x МБС в чашке, содержащей оплодотворенные эмбрионы, с 2% L-цистеином в 1x МБС. Аккуратно взболтайте блюдо, чтобы смешать раствор.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Обычно требуется, чтобы эмбрионы были обезжирены в течение 5 минут. Во время этого шага часто наблюдайте за яйцами, чтобы убедиться, что они не слишком подвержены воздействию раствора. Если яйца переэкспонированы, они потеряют эластичность и станут уплощенными, что вызовет аномальное развитие и летальность.
   3. Вымойте яичный порошок пять раз с 0,1x МБС. Выполните микроинъекцию в 4% фиколе, растворенной в 0,1х МБС. Обычно вводят 4 нг МО и 600 мкг мРНК на бластомер на стадии двух клеток. Внедрение в одну клетку для манипуляции экспрессией гена только на одной стороне эмбриона. Используйте неинъецированную сторону того же эмбриона, что и контрольная.
   4. В качестве другого контроля специфичности генной манипуляции вводите такое же количество контрольного МО (CoMO) или контрольной мРНК ( например, мРНК бета-галактозидазы). CoMO должен иметь те же mОлекулярный вес как ген-специфическая МО и не должен нацеливаться на какой-либо ген в геноме Xenopus . Для легкой визуализации инъецированной стороны используйте меченый флуоресцеином MO или совместно инъецируйте индикатор ( например, мРНК EGFP).
   5. Оставьте введенные эмбрионы в 4% Ficoll в течение 2 ч, а затем перенесите их в новую 60-мм чашку Петри, заполненную 0,1 МБС.
4. привлечение
   1. Поднимите эмбрионы при 23 ° C. Хотя скорость развития может замедляться или ускоряться при использовании температур ниже или выше 23 ° C, соответственно (диапазон: 16-26 ° C), рекомендуется поднимать их при 23 ° C.
5. (Необязательно) Лечение фармакологическими реагентами
   1. Для фармакологических манипуляций вводят лекарственные средства в развивающиеся эмбрионы путем применения ванны.

2. Подготовка инъекции DiI-AcLDL

1. Сделайте коническую стеклянную пипетку, используя стандартную мишеньКопировальная машина. Поместите трубку из боросиликатного стекла в съемник микропипетки и используйте следующие настройки: давление, 200; Тепло, 30; Pull, 30; Скорость 120; Время, 200.
2. Хранить маточный раствор DiI-AcLDL при 4 ° C. Возьмите верхнюю прозрачную часть раствора для инъекций, но не осажденные частицы на дне пробирки. Любой мусор в стеклянной пипетке будет мешать правильному выталкиванию раствора.
3. Заполните подготовленную стеклянную пипетку подходящим количеством раствора DiI-AcLDL (~ 5 мкл), используя микропогрузчик.
4. Сцепите наконечник стеклянной пипетки понемногу, используя прекрасные пара щипцов (число 55). Настроить систему нагнетания под давлением, чтобы примерно 5 нл раствора выбрасывалось за один раз; Для того, чтобы окрасить сосуды одного эмбриона, достаточно 50-60 нл раствора DiI-AcLDL.
5. Не оставляйте загруженную DiI-AcLDL пипетку на воздухе в течение длительного периода времени, чтобы избежать высыхания. Держите наконечник пипетки погружен в 0,04% MS222 в 0,1х МБС-растворе. Перед инъекцией в эмбрион (шаг 4.2.1), проверьте, выбрасывается ли такое же количество красителя.

3. Установка впрыска

1. Форма Sylgard
   1. Чтобы подготовить небольшую форму Sylgard, смешайте основание Sylgard и отвердитель с весовым соотношением 10 к 1. Заполните приблизительно половину маленькой чашки Петри (чашка 35 мм или 60 мм) с помощью этого смешанного раствора и затем оставьте его для затвердевания приблизительно 48 ч при комнатной температуре.
2. обезболивание
   1. Используйте 0.04% MS222 в 1x MBS (pH 7.5-8.0) для анестезии. Когда требуется длительная анестезия ( например, во время живой визуализации), используйте 0.04% MS222 в 0.1x MBS, чтобы уменьшить осмотический дисбаланс. Чтобы отрегулировать pH, добавьте несколько капель NaOH (~ 20 мкл) и проверьте pH с помощью бумаги для измерения рН.
   2. Подождите, пока перенесенные эмбрионы перестанут двигаться. Прикоснитесь к спинным плавникам эмбрионов и проверьте, отвечают ли они на подтверждение полногоnesthesia.
3. Расположение эмбрионов для инъекций
   1. Выровняйте поверхность закаленной формы Sylgard тонким и острым лезвием. Сделайте V-образный вогнутый отступ, в который помещают эмбрионы (см . Рисунок 2D ). Поместите анестезированный эмбрион, вентральной стороной вверх, слегка наклонным образом (приблизительно 30 °) ( Рисунок 2D ).
   2. Заполните форму раствором MS222 и поместите эмбрионы в форму.

4. Инъекция DiI-AcLDL

1. Разрез на коже над сердцем
   1. Подготовьте два булавки (Minutiens, 0,10 мм), чтобы разрезать кожу над сердцем. Плотно закрепите каждый штифт на держателе; Сердце должно быть легко идентифицируемым, поскольку оно пульсирует ( рисунок 2A-2C , розовый).
   2. Проколите кожу эмбриона одним пальцем. Вставьте штырь через отверстие в промежуток между сердцем и кожей ( рис. 2C
   3. Сделайте линейный разрез, аккуратно протирая другой штырь, находящийся вне кожи, против вставленного штифта. Аккуратно расширьте этот разрез двумя пальцами, обнажив сердце ( Рисунок 2B ' и 2D' , стрелка). Пипетка, загруженная DiI-AcLDL, теперь может непосредственно приближаться к сердцу ( рисунок 2D ' ).
2. впрыскивание
   1. Вставьте наконечник погруженной стеклянной пипетки в сердце и введите 50-60 нл раствора DiI-AcLDL примерно в 10 импульсов выброса. Не вводите чрезмерное количество раствора, так как это заставляет сердце разрываться. Проверьте, продолжает ли сердце биться после инъекции. После каждой инъекции проверяют, выбрасывается ли такое же количество DiI-AcLDL; В противном случае наконечник пипетки может быть заблокирован (см. Шаг 2.5).
4. Перенесите введенные эмбрионы в новую чашку Петри, заполненную 0,1 МБС для восстановления. Через 5-10 мин головастики должны прийти в себя и начать двигаться. В это время маркированные сосуды могут быть отображены. Рекомендуется визуально экранировать успешно помеченные эмбрионы под флуоресцентным микроскопом ( рис. 3А и 3В ). Если в эмбрион вводится недостаточное количество DiI-AcLDL, его можно снова вводить ( рис. 3C ).
5. Откажитесь от головастиков, у которых есть другие органы, обозначенные ( рис. 3D ). Продолжайте, пока не будет получено необходимое количество успешно помеченных эмбрионов.

5. Изображения DiI-AcLDL

1. Стереоскопическое изображение
   1. Сфотографируйте под флуоресцентным стереоскопическим микроскопом ( рис. 3 ), чтобы оценить общую морфологию сосудистой сети.
   2. Расплавьте 1% агарозу в 1x PBS для фиксированных эмбрионов или в 1x MBS для живых изображений. Налейте расплавленную агарозу в чашку Петри и подождите, пока она не затвердеет. Сделайте поверхностный отпечаток на поверхности агарозного геля, который будет соответствовать эмбриону, который будет отображаться, когда он лежит на боковой стороне. Наполните блюдо буфером (раствор MS222 для обезболиваемых эмбрионов или 1x PBS для фиксированных эмбрионов).
2. Флуоресцентная микроскопия (Rhodamine filter seт)
   1. Поскольку DiI является красителем с зеленым возбуждением и красным излучением, изображение с использованием стандартного набора фильтров для родамина или спектрально связанных флуорофоров (максимальное возбуждение при 554 нм и эмиссия при 571 нм). Поместите инъецированные эмбрионы в углубления на агарозной плесени и сделайте фотографии ( рис. 3 ).
3. Конфокальная микроскопия
   ПРИМЕЧАНИЕ. Для более подробного анализа архитектуры сосудов используйте конфокальную микроскопию.
   1. Если вы используете инвертированный микроскоп, поместите эмбрионы на блюдо со стеклянным дном. Добавьте несколько капель 1 PBS и иммобилизуйте их, поместив наклейку на крышку. Удалите избыток PBS. Если живые эмбрионы должны быть отображены, используйте обезболиваемые эмбрионы и используйте 0,015% MS222 в 0,1х МБС вместо PBS.
   2. Для получения изображений с малым увеличением используйте объект 4X - 10X, чтобы найти интересующую область; Ростральная часть задней кардинальной вены (PCV) является полезным регионом для исследования ангиогенеза развития (рис. 4, пунктирящики).
      1. Используйте настройку сбора для флуорофора красного излучения (такого как родамин).
      2. Сделайте z-stacked изображения, визуализируя боковую половину эмбриона. Во-первых, сфокусируйтесь на PCV на боковой стороне рядом с объективом, а затем установите нижний предел фокуса в том месте, где находятся близко расположенные к цели суда. Установите верхний предел в том месте, где может быть сфокусирована медиальная часть изображения PCV. Изобразите всю эту боковую половину эмбриона. Используйте программное обеспечение, которое хранит метаданные в настройках сбора данных, таких как шкалы x, y и z, так как они необходимы для расчета длины судна.
      3. Если необходимо, используйте режим сканирования черепицы, чтобы отобразить всю сосудистую сеть эмбриона. Эмпирически определите количество горизонтальных и вертикальных плиток.
   3. Для получения изображения с высоким увеличением выполните описанные выше процедуры, чтобы получить изображение ростральной части PCV и четырех самых крупных межсомитовых жил (ISV) ( рис. 4 ,Пунктирная рамка). Откорректируйте количество стеков (z-stack) и плиток (сканирование фрагментов) соответствующим образом.

6. Количественная оценка сосудов, меченных DiI

ПРИМЕЧАНИЕ. Суда с маркировкой DiI можно отследить вручную или с помощью программного обеспечения. Мы используем «Simple neurite tracer», бесплатный плагин ImageJ (NIH), который позволяет полуавтоматическую трассировку трубчатых структур, таких как кровеносные сосуды и нейриты ¹² . Используя это бесплатное программное обеспечение, можно рассчитать следующие параметры. Подробная процедура использования этого программного обеспечения описана в другом месте (https://imagej.net/Simple_Neurite_Tracer) ¹² . Ниже мы используем примеры сосудистой сети эмбрионов, в которых передача сигналов Tie2 ингибируется или усиливается ( рисунок 4A-4C ) ⁵ . Антисмысловые эмбрионы, инъецированные Tie2MO, уменьшают ангиогенез и укорачивают ISV ( рисунок 4B ), тогда как совместная инъекция конститутивно активного Tie2Мутантная мРНК (caTie2 мРНК) более-спасает этот фенотип, приводя к обильным ветвям ISV ( рис. 4C ).

1. ISV-длины
   1. Используя простой нейритовый трассировщик, вычислите длину каждого отслеживаемого судна. Вычислите длины 4-х ростральных ISV.
2. Отделения ISV
   ПРИМЕЧАНИЕ. У эмбрионов дикого типа на стадии 42 только самые короткие ветви растут у рострального большинства ISV.
   1. В простейшем методе нейритов проследите эти маленькие сосуды после того, как создадите ISV, из которого они берут начало. Рассчитайте следующие параметры этих ветвей, исходящие от независимых поставщиков ПО.
   2. Общее количество филиалов
      1. После того, как все ISV и связанные ветви прослеживаются, вычислите общее число ветвей ( рисунок 5B-5D ).
   3. Заказ филиала
      1. Так как простой нейритовый трассер записывает порядок каждой ветви ( рис. 5А ), вычисляетЕ - количество ответвлений для каждого заказа. Большинство сосудов у эмбрионов дикого типа должны быть первичными ветвями ( т.е. ISVs).
   4. Индекс сложности вены (VCI)
      1. Поскольку VCI является полезным параметром для сложности судна, что дает больший вес ветвям более высокого порядка, вычислить VCI для каждого эмбриона, используя формулу на рисунке 5A . Например, эмбрионы, инъецированные Tie2MO, имеют более низкий VCI по сравнению с контролем ( фиг. 5B и 5C ), и caTie2, инъецированные мРНК эмбрионы, имеют более высокий VCI ( фиг. 5D ).

Временная шкала экспериментов (рисунки 1 и 2)

Вскоре после оплодотворения может быть проведена целенаправленная микроинъекция для модуляции экспрессии генов. Например, антисмысловая МО, которая специфически связывается с инициирующим кодоном эндогенной мРНК Tie2, может быть инъецирована, ингибируя трансляцию Tie2-мишени-мишени при помощи стерических затруднений. МО может быть конъюгирован с флуоресцеином для легкого визуального скрининга успешно введенных эмбрионов. Альтернативно, мРНК-индикатор ( например, мРНК, кодирующая EGFP) может быть совместно инъецирован MO. Кроме того, препараты могут быть обработаны применением ванны после вылупления (ранняя фаза хвостового оперения, вокруг стадии 26 NF). Растворяют препарат в 0,1х МБС и добавляют его к эмбрионам. Для более ранней обработки эмбрионы могут быть освобождены от мембран с помощью пары щипцов. DiI-AcLDL можно вводить в сердце вокруг стадии 33/34, чтобы исследовать динамику формы сосудаНо обычно мы вводим их на стадии 37/38 или позже ( фиг. 2 , окрашенные области).

Типичные примеры успешных и неудачных инъекций (шаг 4.3) (Рисунок 3)

Стереоскопическая визуализация подходит для визуального скрининга. Если в сердце вводится достаточное количество DiI-AcLDL, PCV должен быть немедленно виден под флуоресцентным стереоскопом ( рис. 3A и 3B ). Недостаточно или неправильно введенные эмбрионы легко идентифицировать ( Рисунок 3C и 3D ). Эмбрионы с недостаточным количеством DiI-AcLDL ( рис. 3C ) можно снова вводить с тем же красителем, пока сосуды не станут хорошо заметны. Изображение успешно вводили эмбрионы под конфокальным микроскопом, живым или после фиксации.

Разработка постеровИли кардинальной вены (PCV) и межсомитовых вен (ISV)

PCV простирается в ростально-каудальном направлении, и это расширение заканчивается вокруг стадии 37/38. ISV всплывают дорзально от PCV в передне-задней части волны. Эта волна формирования ИВС начинается на стадии 36 и заканчивается вокруг стадии 40/41; ISV продолжают расти и разветвляться до стадии 43 ( рис. 3A и 3B ).

Передача сигналов Tie2 контролирует развитие ветвления ISV (рисунок 4)

PCV и ISV растут стереотипно, и их развитие находится под жестким контролем ( Рисунок 4A ). Образование ISV из PCV можно описать как ангиогенез, и, следовательно, это полезная модель для исследования молекулярных механизмов, лежащих в основе ангиогенеза. Введем результат нашего недавнего исследования showiНг, что сигналы развития подавляют передачу сигналов Tie2 в ISV, чтобы ограничить их ветвление 5 . Нокдаун сигнализации Tie2 посредством антисмыслового MO уменьшает длину и сложность ISV (рисунок 4B), а экспрессия активной формы Tie2 (caTie2) вызывает чрезмерное ветвление ISV ( рисунок 4C ).

Количественная оценка сложности ISV (рисунок 5)

В дополнение к длинам и номерам филиалов независимых поставщиков ПО можно рассчитать индекс сложности вены (VCI), чтобы оценить их сложность ( рисунок 5A ). Мы приняли «индекс сложности», разработанный Коэн-Кори и его коллегами, который был разработан для количественной оценки сложности нейронных аксональных или дендритных беседок 13 . В этом индексе эмбрион с более высокими ветвями высшего порядка получает более высокий балл, чем эмбрион с таким же количеством общих отрубейНо с более низкими уровнями ветвей. Таким образом, более высокий VCI указывает на то, что этот эмбрион имеет более сложную венозную сеть. «Простой нейритовый трассер» - полезное программное обеспечение для отслеживания порядка и длины отдельных ветвей. Также возможно генерировать «визуализированные пути», что является полезным способом визуализации общей архитектуры сосудистой сети ( рис. 5B-5D , правые панели).

Рисунок 1: Временная шкала экспериментов. В день оплодотворения морфолиноз (МО), ДНК, РНК или белок могут быть введены в оплодотворенные яйца на стадии 1 NF (st1) или 2 (st2). Если вводить только в один бластомер при st2, вводимый реагент будет воздействовать только на одну боковую сторону. Неинъецированная сторона может использоваться как элемент управления. Совместно вводят индикатор ( например, мРНК EGFP) для идентификации инъецированной стороны. На второй день, ea(~ St24) эмбрионы могут обрабатываться фармакологическими реагентами путем применения ванны. Сердце хорошо видно на третий день. DiI-AcLDL можно вводить в сердце, и кровеносные сосуды могут быть отображены вскоре после инъекции. Используйте эмбрионы st33-37, чтобы отобразить динамику роста сосудов или эмбрионов st42 для изображения полностью развитых сосудов. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Расположение инъекции DiI-AcLDL на st42. Боковые ( AB ' ) и вентральные ( CD ) виды эмбриона стадии 42. Сердце окрашено розовым в AC , в изображениях, взятых из Xenbase (www.xenbase.org). Представленные стереоскопические изображения показаны в A ' , <strOng> B 'и D. Для инъекций проколите кожу, лежащую над сердцем ( C , сплошная стрелка), сделайте линейный разрез и откройте кожу латерально, чтобы открыть сердце (красные стрелки). После выполнения надреза сердце будет четко различимым для инъекции ( D ' ). Масштабы шкалы = 200 мкм. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Ожидаемые результаты (стереоскопические изображения). Репрезентативные изображения флуоресценции со стадии 37/38 ( A ) и стадии 42 ( B ) эмбрионов. Показаны левые стороны эмбрионов. Задняя кардинальная вена (PCV) простирается каудально, из которой межсомитовые вены (ISVs) отходят дорсально в рострально-каудальном wavе. На стадии 37/38 ( A ) видны только ростральные ISV, и большинство ISV сформировались на этапе 42 ( B ). Если вводится недостаточное количество DiI-AcLDL, PCV будет нечетко виден даже после 30 мин ( C ). В этом случае можно вводить большее количество DiI-AcLDL. Если DiI-AcLDL случайно инъецируется в другие органы ( D ), выбросьте эмбрионы. Шкала шкалы = 500 мкм. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Влияние сигнализации Tie2 на развитие ISV. Экспрессия гена Tie2 была сбита путем инъекции бластомера трансформирующих трансляцию антисмысловых морфолиновых олигонуклеотидов (Tie2MO). Контрольный морфолино (CoMO) имеет одинаковую молекулярную массу, но nОт любого гена в Xenopus tropicalis . Кодирующий мРНК конститутивно активный мутант Tie2 (caTie2) был введен совместно для спасения фенотипа нокдауна Tie2. В отличие от контроля ( A ), инъекция Tie2MO привела к резкому уменьшению длины и количества независимых поставщиков программного обеспечения ( B ). Этот фенотип был чрезмерно спасен caTie2, который показал ISV с избыточными побочными ветвями ( C ). Сложность ISV в областях, обозначенных синими пунктирными коробками, количественно представлена ​​на рисунке 5. Шкала масштабирования = 200 мкм. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 5: Количественная оценка сложности вены. ( A ) Сложность ISV может быть представлена ​​индексом сложности вены (VCI).( BD ) VCI вычисляли из эмбрионов, показанных на фиг.4. Шкала шкалы = 200 мкм. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Авторам нечего раскрывать.