Выделение промежуточных белков-нитей из множественных мышечных тканей для изучения связанных со старением пост-трансляционных модификаций

IFS - это семейство белков, которые у людей кодируются 73 генами и подразделяются на шесть основных типов: типы I-IV являются цитоплазматическими ( например, эпителиальные и волосяные кератины (K), миоцит-десмин, нейрофиламенты, глиальный фибриллярный кислый белок (GFAP) и другие); Тип V - ядерные слои; И тип VI являются ПЧ в глазной линзе ¹ . С точки зрения их молекулярной организации, белки IF имеют три общие области: высококонсервативный спиральный «стержневой» домен и шаровые «голова» и «хвостовой» домен. IF-тетрамеры белка собираются с образованием коротких нитевидных предшественников, которые в конечном счете внедряются в зрелые волокна, которые формируют динамические цитоскелетные и нуклеоскелетные структуры, участвующие в механической защите ² , чувствительность к стрессу ^{3 , 4} , регуляцию транскрипции ⁵ и рост и другие критические клеточные функции"> 1 ^{, 6 , 7} .

Функциональное значение IF-системы подчеркивается наличием многих заболеваний человека, вызванных missense мутациями в IF-генах, включая невропатии, миопатии, расстройства хрупкости кожи, метаболические дисфункции и синдромы преждевременного старения ⁸ . Некоторые мутации гена IF не вызывают, но предрасполагают их носителей к прогрессированию болезни, таким как простые эпителиальные кератины при болезни печени ⁹ . Последнее связано с критическими стресс-защитными функциями ИФ в эпителии. IFS в общем случае являются одними из наиболее распространенных клеточных белков в базальных условиях, но дополнительно сильно индуцируются при различных типах стресса ¹⁰ . Например, недавние исследования, оценивающие изменения в широком диапазоне протеомов у нематод C. elegans, показали, что множественные IFs сильно активируются и склонны к агрегатамВо время старения организма ^{11 , 12} . Поскольку поддержание надлежащей структуры IF важно для устойчивости клеток к различным формам стресса ¹⁰ , агрегация IF также может способствовать функциональному снижению во время старения. Однако исследования на организменном уровне, изучающие множественные IF-протеины млекопитающих в разных тканях, подвергающихся стрессу, отсутствуют.

IFs - это высокодинамичные структуры, которые адаптируются к требованиям сотовой связи. Кератины, например, подвергаются независимой от биосинтеза циклизации между растворимым (неволокнистым) и нерастворимым (нитевидным) пулом ¹³ протеинов. При нормальных физиологических условиях приблизительно 5% общий объем пула K8 / K18 может быть экстрагирован в буфере без моющих средств по сравнению с приблизительно 20%, который может быть солюбилизирован в неионном детергенте Nonidet P-40, который биохимически сравним с Triton- X100 ^{14 ,} 15 . Во время митоза наблюдается заметное увеличение растворимости эпителия K8 и K18 ¹⁴ простого типа, которое менее выражено в эпидермальных кератинах, но более выражено у виментина и других IF-белков III типа ^{15 , 16} . Свойства растворимости IF-белков жестко регулируются путем фосфорилирования, ключевой посттрансляционной модификации (PTM) для перегруппировки филаментов и их растворимости ^{17 , 18 , 19 , 20} . Большинство ПЧ подвергаются широкому регулированию рядом ПТМ на консервативных участках, что приводит к функциональным изменениям ¹⁷ .

Цель этого метода заключается в том, чтобы ввести исследователей, которые являются новичками в области ИФ, к биохимическим экстракционным и аналитическим методам исследования IF-протеинов в нескольких тканях мыши. КонкретныйМы сосредотачиваемся на выделении белков IF, используя метод экстракции с использованием соли и оценку изменений в PTM с помощью масс-спектрометрии и PTM-нацеливающих антител. Эти методы основаны на ранее опубликованных процедурах ^21, но включают модификации для извлечения различных типов белка IF, чтобы выявить общий механизм регуляции в IF-семействе. Например, ацетилирование K8 в определенном лизиновом остатке регулирует организацию нитей, тогда как гиперацетилирование способствует нерастворимости K8 и образованию агрегатов ²² . Недавние глобальные исследования протеомного профилирования дополнительно показали, что большинство тканеспецифичных IF-белков также являются мишенями для ацетилирования и что большинство сайтов ацетилирования IF ограничено высококонсервативным доменом палочек. Это подчеркивает необходимость в методах, подходящих для глобального профилирования системы IF. Мы также вводим быстрый метод выделения белков IF из нескольких тканей с использованием автоматической гомогенизации в optiЛизиновая матрица. Полученные препараты пригодны для последующего анализа ПТМ с помощью масс-спектрометрии и других методов.

Протокол одобрен и выполняется в соответствии с Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованием (IACUC) в Университете Северной Каролины.

1. Препараты

1. Приготовьте буфер Triton-X (1% Triton X-100, 5 мМ этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA), добавьте объем в забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS), pH 7,4). Для приготовления 500 мл: перемешивают по 5 мл каждого из тритонов Х-100 и 500 мМ ЭДТА в 490 мл PBS, pH 7,4. Хранить буферный раствор Triton-X при температуре 4 ° C.
2. Готовят буфер с высоким содержанием соли (10 мМ Трис-HCl, рН 7,6, 140 мМ NaCl, 1,5 М KCl, 5 мМ ЭДТА, 0,5% Тритон Х-100, вытягивают объем в дважды дистиллированной (dd) H ₂ O). Для приготовления 500 мл: перемешать 10 мл 0,5 М Трис-HCl (рН 7,6), 14 мл 5 М NaCl, 55,9 г KCl, 5 мл 0,5 М ЭДТА и 2,5 мл Тритона Х-100, доводят объем до 500 Мл с использованием двойной дистиллированной воды). Хранить раствор с высоким содержанием соли в буфере при температуре 4 ° C.
3. Непосредственно перед использованием добавьте соответствующее количество Triton-X и High Salt Buffer (
4. Готовят 5 мМ ЭДТА в 1х PBS, pH 7,4. Для приготовления 500 мл: перемешивают 5 мл 0,5 М ЭДТА в 495 мл 1 × PBS, pH 7,4.
5. Изолируйте различные органы мыши (мозг, сердце, легкие, печень, поджелудочная железа, толстая кишка, кишечник, почка, селезенка), используя утвержденные протоколы, соответствующие ветеринарным рекомендациям и институциональным стандартам. ²³ . Процедура сбора ткани должна длиться не более 5 минут, чтобы сохранить целостность РНК и белка протеазо-богатых тканей ( например, сначала нужно обработать поджелудочную железу).
6. Отрежьте небольшое количество ткани (~ 5-20 мг) и поместите в раствор для хранения РНК, для последующей экстракции РНК, синтеза кДНК и количественного ПЦР-анализа в реальном времени для экспрессии гена IF. Поместите пробирки для хранения раствора РНК с тканью при температуре 4 ° C в течение ночи и следуйте протоколу производителя для дальнейшего sТоре и изоляции.
7. Разрежьте остальную часть ткани на более мелкие фрагменты ( например, 0,5 см) и поместите в криопробирку. Замораживайте и храните флаконы при -80 ° C или жидком азоте для длительного хранения.

2. IF-анализ экспрессии генов

1. Экстрагируют РНК из тканей, сохраненных в реагенте-хранилище РНК. Используйте любой подходящий / предпочтительный метод экстракции РНК в соответствии с протоколом производителя.
2. Определите количественную концентрацию РНК и используйте 2 мкг РНК для получения кДНК с использованием подходящего набора обратной транскрипции в соответствии с протоколом производителя.
3. С использованием генерируемых кДНК и мышиных IF-генов праймеров были созданы реакции qPCR, в том числе три технические повторения каждого образца, а также контрольные пробелы в соответствии с протоколом производителя.
4. Количественная экспрессия IF-гена в виде изменения складки при сравнении различных условий ( например, молодняка или старой ткани).

3. PРепарация лизатов общей ткани для иммуноблота

1. Гомогенизируйте 25 мг ткани в 1 мл 2х невосстанавливающего буферного раствора SDS. Опустите бромфеноловый синий краситель из буфера для образцов, если необходимо провести колориметрический анализ белка для количественной оценки концентрации белка.
2. Добавить 5% (об. / Об.) 2-меркаптоэтанола (2-ME) для получения восстановленных образцов. В 200 мкл невосстанавливающих образцов добавить 10 мкл 2-ME.
3. Определить концентрацию белка с помощью анализа белков, совместимых с моющим средством и восстановителем. Если краситель уже включен в буфер для образца, количество протеина можно оценить после запуска геля с помощью ряда методик, включая краситель ²⁴ на основе кумасси.
4. Вортекс все образцы и тепло при 95 ° С в течение 5 мин.
5. Выполняют вестерн-блоттинг как в восстановительных, так и в невосстанавливающих условиях. Кратковременная экспозиция мембраны (<1 мин) для выявления мономерных видов и более (> 1 мин) для выявления комплексов с высокой молекулярной массойNg IF белки. Если вы наблюдаете агрегацию, исследуйте весь гель / мембрану (включая днища гелевых лунок).
6. Проведите параллельный гель и пятно с белковым пятном в качестве контроля нагрузки ²⁴ . В моделях болезней или экспериментах с травмами в качестве контроля нагрузки следует использовать общее окрашивание белка, в отличие от иммуноблотов для «домашних» белков ( например, актина, GAPDH), поскольку последние изменяются при различных стрессовых состояниях.

4. Приготовление растворимых в воде и высокосолевых экстрактов ТФ

1. Добавить 1 мл ледяного буфера Triton X-100 в гомогенизатор для стеклянной трубки и поместить его на лед.
2. Удалите небольшой кусочек ткани (~ 25 мг) из хранилища жидкого азота и поместите непосредственно в стеклянный гомогенизатор. Используйте политетрафторэтиленовый пестик для гомогенизации (50 ударов) и избегайте образования пузырьков. Регулярно поддерживайте гомогенизатор и лизат.
3. Переносят лизат в 1,5 мл микронаНа центрифуге при 20000 мкг в течение 10 мин в предварительно охлажденной центрифуге (4 ° С).
4. Соберите фракцию супернатанта в отдельную пробирку. Это фракция, растворимая в тритоне X, которую можно использовать для иммунопреципитации (ip) и анализа растворимого в воде пула белков IF. Обратите внимание, что шаги 4.1-4.4 могут быть повторены для достижения более чистого экстракта IF из ткани головного мозга.
5. Добавьте 1 мл буфера с высоким содержанием соли в тканевый осадок, переносите в чистый гомогенизатор и окуните 100 ударов. Перенесите гомогенат обратно в микроцентрифужную пробирку и поместите пробирку на вращающийся шейкер в холодную комнату на 1 час.
6. Центрифуга гомогенатов при 20000 мкг в течение 20 мин при 4 ° C. Отбросьте супернатант.
7. Добавить 1 мл охлажденного льдом буфера PBS / ЭДТА в гранулу и гомогенизировать осадок (20 инсультов) в чистом гомогенизаторе в качестве конечной стадии очистки *. Перенесите в новую пробирку и центрифугируйте при 20000 мкг в течение 10 мин при 4 ° С, чтобы получить белок IF-(HSE).
   * Необязательно, на этом этапе вместо гомогенизации вихрь.
8. Отбросьте супернатант и растворите гранулы в 300 мкл буфера для образца без SDS, который был предварительно нагрет. Сначала раскалывают гранулу пипетированием и вортексом, а затем нагревают образцы в течение 5 мин при 95 ° С.
9. Вихрь и пипетка по мере необходимости для обеспечения растворения осадка. Для полного растворения гранул может потребоваться несколько минут.
10. Хранить все образцы при -20 ° C до анализа.

5. Автоматизированный лизис тканей для экстракции белка IF в экспериментах с большими объемами

1. Для выделения РНК поместите буфер для лизиса (600 мкл буфера на 25 мг ткани) в пробирку, содержащую матрицу лизиса D (использует маленькие керамические сферы) и дважды в течение 25 с в тканевом лизере. Отдельный лизат от матрицы путем центрифугирования при 20000 мкг и перейти к следующему этапу в отдельности.
2. Для извлечения белка, место TritНа X-100 (или буфере для образцов SDS, если готовят общий лизат) в лизирующей трубке с лизирующей матрицей SS (используйте один шарик из нержавеющей стали). После тестирования нескольких матриц это было выбрано, потому что оно производит экстракты белка IF, которые имеют такое же качество, что и традиционный метод douncing. Обратите внимание, что автоматизированный метод не оптимален для поджелудочной железы и селезенки, и для этих тканей должен использоваться стандартный протокол гомогенизации.
3. Для продолжения подготовки экстракта с высоким содержанием соли удалите шарик из нержавеющей стали с помощью магнита и центрифугируйте пробирки при 20 000 xg в течение 10 минут при 4 ° C.
4. Перейдите к шагу 4.4 (выше) ручного протокола.
5. Хранить все образцы при -20 ° C до анализа.

6. Иммуно-обогащение посттрансляционно модифицированных белков IF

1. Подготовьте PBST буфер (0,02% Tween-20 в PBS). Чтобы сделать 50 мл, добавьте 10 мкл Tween-20 к 50 мл PBS, pH 7,4.
2. Подготовка антитела PTMРаствора (1-10 мкг антитела в 200 мкл PBST). В целом, 3 мкг антитела / реакции являются хорошим стартовым условием, которое может быть дополнительно оптимизировано в случае необходимости.
3. Для каждой реакции аликвоту 50 мкл магнитных шариков в микроцентрифужную пробирку помещают на магнит и аспирируют раствор для хранения шариков.
4. Сопрягайте шарики с антителом иммунопреципитата, повторно суспендируя в растворе антитела и инкубируя на ротаторе (с концевым концом, для обеспечения смешивания небольших объемов) при комнатной температуре в течение 20 мин.
5. Поместите пробирки на раствор магнита и аспирации антител.
6. Промыть конъюгированные с антителом гранулы один раз в 200 мкл PBST и удалить промывочный буфер.
7. Добавляют 0,6-1 мл тканевого лизата к шарикам, перемешивают осторожным пипетированием и инкубируют в течение 3 часов на ротаторе в холодильной камере.
8. Поместите пробирки на магнит, удалите лизат и вымойте бусы пять раз с помощью 200 мкл PBST. После последней стадии промывки собрать гранулы в 100 _6; L PBS (без Tween-20) и перенос в чистую новую пробирку. Поместите трубку на магнит.
9. Аспирируйте PBS и добавьте 100 мкл невосстанавливающего буфера для образцов. Удалите 50 мкл и добавьте 2-ME (5%) для получения восстановительных образцов. Нагревают образцы до 95 ° С в течение 5 мин.
10. Отделите ip фракцию от шариков на магните и соберите ее в новую пробирку.
11. Хранить образцы при -20 ° C до анализа.

7. Подготовка образцов IF-белка для масс-спектрометрического анализа

1. Запланируйте консультацию с экспертом по протеомике до начала исследования, поскольку при анализе масс-спектрометрии имеется значительное время и затраты.
2. Примите особые меры предосторожности, чтобы избежать загрязнения. Обрабатывать все гели с чистыми перчатками и инкубировать в чистых контейнерах, промывать только с использованием ddH ₂ O (избегать мыла).
3. Прогоните 20-50 мкл образца HSE (из разделов 4 и 5) на геле SDS-PAGE в соответствии со стандартными условиями. Пятно с окрашиванием белка в течение 1 часа. Промойте несколько раз и промокните в ddH ₂ O в течение ночи. Полосы белка IF должны быть хорошо видны после удаления пятен.
4. Поместите гель между пластиковыми защитными прокладками, отсканируйте и отметьте полосы, которые будут вырезаны и отправлены на анализ.
5. Акцизные полосы белка IF используют новую чистую бритву.
6. Поместите полоски геля в чистые пробирки для микроцентрифугирования и переносите в установку для масс-спектрометрии.

Новый быстрый метод для высокой экстракции на основе солей IF-белков из нескольких тканей мыши с использованием лизирующей матрицы.

Традиционный метод 25 , 26 выделения большей части фракции белка промежуточных филаментов из эпителиальной ткани был модифицирован здесь, чтобы включить 9 различных органов и более быструю процедуру для тканевого лизиса. Хотя для традиционного метода требуется 3 шага ручной гомогенизации, модифицированная процедура имеет только 1 ручной этап гомогенизации, что сокращает процедуру на несколько часов, особенно при обработке более 6 образцов. На рисунке 1A показан типичный результат HSEs из 9 тканей мыши, а таблица ожидаемых белков в ткани и молекулярная масса каждого белка показана на рисунке 1B

Печень K8 и K18 сильно активируется и подвергается повышенному фосфорилированию и ацетилированию лизина в печени от старых мышей.

На рисунке 2 показаны типичные результаты нескольких анализов, описанных в этом протоколе. Панель А изображает анализ экспрессии двух основных IF-генов в печени, кератина 8 ( KRT8 )И кератин 18 ( KRT18 ), которые кодируют IF-белки K8 и K18, соответственно. Эпителиальные кератины сильно активируются при различных стрессовых состояниях. В показанном результате это происходит во время старения, так как KRT8 значительно активируется в печени 24-летних мышей по сравнению с 3-мя мышами. Результаты на уровне протеина более поразительны, так как наблюдаются резкое увеличение мономера К8, а также комплексов с высокой молекулярной массой в старой (24 м) печени. Краситель на основе кумасси здесь служит контролем загрузки, чтобы обеспечить равномерную загрузку белка через образцы. Обратите внимание, что при общем количестве тканевых лизатов легко перегрузить белок на гель, как в этом случае. Загрузка меньшего объема или разбавление образца в буфере додецилсульфата натрия (SDS) уменьшит эту проблему (особенно, если она кажется вязкой и трудной для пипетирования). Панель C изображает типичный результат экстракта печени с высоким содержанием соли, полученного с использованием автоматизированного протокола, demНастойчиво подчеркивая сильное обогащение кератинов 8 и 18 гелем. Красные линии демаркируют область, которая была вырезана и представлена ​​для масс-спектрометрического анализа. На панели D результаты масс-спектрометрического анализа образцов на панели C показывают, что K8 и K18 в старой печени имеют множественные сайты фосфорилирования и ацетилирования, которые не присутствуют в молодой печени.

GFAP сильно активируется, и лизин ацетилируют в мозге старых мышей.

Рисунок 3 демонстрирует, что методы, используемые для извлечения IFs из эпителия, могут также использоваться на неэпителиальной ткани. Кроме того, результаты показывают общую закономерность зависимой от старения регуляции IF-генов и белков. Результатом КПЦР на фиг. 2А показана 5-кратная индукция мРНК GFAP в мозге 24-летних мышей по сравнению с 3-м старыми мышами. Рисунок 2BПоказывает полные белки, присутствующие в фракции Тритона Х-100 и обогащенной ИФБ HSE. Обратите внимание на увеличение интенсивности полосы при 50 кДа, отмеченное стрелкой (соответствующей GFAP) в старом мозге. Анализ вестерн-блоттинга на фиг. 2C дополнительно показывает усиление GFAP и значительное присутствие мономера GFAP и потенциально высокомолекулярного комплекса в фракции Triton X-100 (обе маркированы стрелками). Анализ вестерн-блоттинга тех же образцов с помощью пан-ацетилизинового антитела показывает, что антитело распознает полосу при ~ 50 кДа в HSE старого мозга мыши и ~ 250 кДа в фракции Triton X-100 ( фиг. 2D ). Иммуно-обогащение ацетилированных белков фракциями Тритона Х-100 выявляет повышенное присутствие белка GFAP в лизате, полученном из старого мозга. Показано, что восстанавливающие и невосстанавливающие условия выделяют мономер GFAP и комплексы с высокой молекулярной массой. Масс-спектрометрический анализ (аналогичный фиг.1

Рисунок 1: Автоматизированный лизис и экстракция IF-белков из нескольких тканей мыши. ( A ) Гель-пятно HOMs на основе кумасси от обозначенных тканей мыши. Показанные ткани были получены от той же взрослой мыши (3 м) взрослого самца CBA. Образцы обрабатывались, как описано в разделе 5. Мозг : обратите внимание, что NFL, NFM и NFH в значительной степени фосфорилированы 27 и мигрируют медленнее, чем ожидалось, при ~ 70, 145 и 200 кДа, соответственно. Сердце : в дополнение к полосе 53 кДа, соответствующей десмину и виментину), образцы сердца также содержат полосу ~ 42 кДа, наиболее вероятно представляющую актин, который, как известно, совместно очищается десминами 28 . LArge intestine: Идентичность видных полос выше 25 кДа, которые совместно экстрагированы с K8 / K18, неизвестны, но эти полосы отсутствуют, если ткани обрабатываются с использованием традиционного метода гомогенизатора dounce. Поджелудочная железа и селезенка: Обратите внимание, что автоматическая гомогенизация не подходит для выделения кератинов из поджелудочной железы и виментина из селезенки, по-видимому, из-за чувствительности лизата к незначительному повышению температуры во время импульса в тканевом лизере. ( B ) Таблица, показывающая основные типы белка IF, присутствующие в разных тканях, и их предсказанная молекулярная масса в качестве эталона для панели A. Пожалуйста , нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: МолекулаИ биохимические различия в кератинах печени у молодых и старых мышей. ( A ) Анализ мРНК KRT8 и KRT8 с использованием стандартной процедуры (Протокол 1) показывает значительную индукцию в транскрипте KRT8 в печени от старых мышей. N = 6 для каждого условия (для каждой группы использовались 3 самцы и 3 самки CBA). ** p <0,01; Односторонний дисперсионный анализ. ( B ) Всего лизаты печени были получены у 3 молодых (3 месяца) и 3 старых (24 месяцев) самцов мышей линии CBA с использованием Протокола 2, и образцы были проанализированы в невосстанавливающих условиях. Для исследования экспрессии K8 использовали TS1-антитело, а в качестве контроля нагрузки использовали окрашивание белка на основе кумасси. ( C ) Высокие солевые экстракты из молодой и старой печени мыши, соответствующие мышам № 1 и № 4, соответственно, из панели B. Две стрелки указывают на K8 и K18 на геле, а красная рамка указывает на часть геля, которая была Вырезаны и представлены для масс-спектрометрического анализа. ( D Сильный>) PTM-сайты, идентифицированные с помощью анализа масс-спектров образцов, показанных на рисунке C. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Молекулярные и биохимические различия в GFAP из мозга молодых и старых мышей. ( A ) Анализ мРНК GFAP с использованием стандартной методики (Протокол 1) выявил существенную индукцию в мозге у старых мышей. N = 6 для каждого условия (для каждой группы использовались 3 самцы и 3 самки CBA). ** p <0,01; Односторонний дисперсионный анализ. ( B ) Белок белка Triton X-100 и фракции HSE из мозговой ткани молодых (3 месяца) и старой (24 месяца) мышиного белка на основе кумасси. Обратите внимание на увеличение полосы GFAP ~ 50 кДа в HSE от старого мозга (стрелка). ( C ) GFAP иммуноблот (мышиный моноклональный, GA5-клон) тех же образцов, что и панель B. ( D ) Иммуноблот ацетил-лизина (поликлональный кролик Abcam ab80178) тех же образцов, что и на панели B. ( E ) GFAP-блот после иммунопреципитации ацетил- Лизин. Образцы анализировали в условиях невосстановительного (NR) и восстановительного (R) состояний, и стрелки указывают на увеличение присутствия GFAP в иммунопреципитате из старого мозга. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.