Определение высокого сродства антитело-антиген-связывающий Kinetics с использованием четырех биосенсор платформы

Summary

Мы опишем здесь протоколы для измерения антиген-антитело аффинность связывания и кинетики с использованием четырех обычно используемых платформ биосенсора.

Abstract

Этикетка свободной оптические биосенсоры являются мощными инструментами в разработке лекарств для характеристики молекулярно-биологических взаимодействий. В этом исследовании мы описали использование четырех обычно используемых платформ биосенсора в нашей лаборатории, чтобы оценить сродство связывания и кинетику десять с высоким сродством моноклональных антител (мАт) против человеческого пропротеина конвертазы субтилизина Kexin типа 9 (PCSK9). В то время как Biacore T100 и Proteon XPR36 получены из хорошо установлено поверхностного плазмонного резонанса технологии (ППР), бывший имеет четыре ячейки потока, соединенные конфигурации последовательного потока, тогда как последние подарки 36 реакционные пятна параллельно через импровизированного 6 х 6 крест-накрест микрожидкостных конфигурации канала. ИБИС MX96 также работает на основе SPR сенсорной технологии, с дополнительной функцией формирования изображения, которая обеспечивает обнаружение в пространственной ориентации. Этот метод обнаружения в сочетании с непрерывным потоком Microspotter (CFM) расширяет пропускную способность значительно по электронной почтеnabling мультиплексной печать массива и обнаружение 96 реакционных видов спорта одновременно. В противоположности этому, Октет RED384 основан на бислой интерферометрия (Л) оптический принцип, с волоконно-оптических датчиками, действующими в качестве биосенсора для обнаружения интерференционной картины изменений при связывании взаимодействий на поверхности наконечника. В отличии от SPR, основанных на платформы, система BLI не зависит от непрерывных потоков струйных; вместо этого, кончики датчиков собирают показания в то время как они погружены в растворы аналита микропланшет-384 скважины в процессе орбитального перемешивания.

Каждая из этих биосенсоров платформ имеет свои преимущества и недостатки. Для того, чтобы обеспечить непосредственное сравнение способности данных инструментов для обеспечения качества кинетических данных, описанные протоколы иллюстрируют эксперименты, которые используют один и тот же формат анализ и те же высококачественные реагенты характеризовать антитело-антиген кинетики, которые соответствуют простой модели 1: 1 взаимодействия молекул ,

Introduction

Получение надежных кинетических параметров для характеристики взаимодействий антител-антигенов является важным компонентом процесса открытия и разработки лекарств¹. Биосенсоры оптического поверхностного плазмонного резонанса (SPR), «золотой стандарт» для обнаружения этих взаимодействий в режиме реального времени, используются в течение примерно двух десятилетий для обеспечения раннего выбора кандидатов на терапевтические антитела, отвечающих критериям^2,3. В дополнение к обеспечению аффинного ранжирования кандидатов на антитела с помощью быстрого скрининга связывания сырых надосадочных линий⁴ и тщательного определения кинетической константы очищенных препаратов⁵, биосенсоры могут дополнительно дифференцировать функциональную активность кандидатов в антитела с помощью исследований биннинга эпитопов^6,7.

Чтобы удовлетворить растущий спрос на продукты на основе антител для различных терапевтических показаний⁸, в последние годы было разработано большое разнообразие инновационных биосенсорных инструментов, которые повышают эффективность идентификации и определения характеристик кандидатов^9,10. Эти приборы различаются по конфигурации микрофлюидных каналов и/или по оптическим принципам, участвующим в детектировании биомолекулярных взаимодействий. В частности, Octet RED384^{11, ProteOn} XPR36¹² и IBIS MX96⁷ увеличили количество взаимодействий, измеряемых в одном цикле связывания, до 16, 36 и 96 соответственно, что представляет собой значительное улучшение пропускной способности по сравнению с традиционной платформой Biacore. Несмотря на то, что все эти различные биосенсорные платформы предоставляют важные кинетические данные для характеристики взаимодействий антител и антигенов, они различаются по экспериментальной установке и операционным процедурам из-за различий в конфигурациях инструментов. Например, в платформе SPR матрицы изображений IBIS MX96 этап иммобилизации мультиплексного лиганда выполняется в автономном режиме на внешнем печатающем устройстве, отдельном от detector^7,13; В отличие от этого, три другие биосенсорные платформы используют конфигурацию «все в одном», в которой добавление компонента на поверхность сенсора, будь то активирующий реагент, лиганд или аналит, регистрируется в режиме реального времени и с помощью предварительно запрограммированных команд в последовательном порядке. В Octet RED384 уникальной особенностью этой платформы на основе интерферометрии биослоя (BLI) является наличие биосенсоров с предварительно нанесенным покрытием для немедленного использования "dip-and-read" ¹⁴, что устраняет необходимость в подготовке поверхности лиганда и этапах инициации/кондиционирования, которые часто требуются для сенсорных чипов на платформах на основе SPR. Конструкция этого прибора, не содержащая жидкости, также упрощает механику и позволяет избежать проблем с засорением и загрязнением при работе с сырыми образцами. С помощью новой гидродинамической конструкции 6 x 6 в ProteOn XPR36 можно реализовать подход к кинетике «одного выстрела» путем переключения потоковых каналов между горизонтальными и вертикальными направлениями для создания 36 точек взаимодействия¹⁵. Вместо оценки кинетики связывания концентрации одного лиганда или аналита за раз, как это делается в традиционной платформе Biacore T100 с последовательным потоком, этот подход дает возможность контролировать до 36 различных взаимодействий одновременно в одном цикле связывания.

Несмотря на их различия, все эти четыре биосенсорные платформы широко используются многими лабораториями по всему миру. Для новых пользователей с небольшим практическим опытом работы с биосенсорами выбор инструмента может быть сложной задачей, учитывая различия в конструкции приборов. Чтобы определить наиболее подходящий инструмент для своих исследовательских целей, необходимо рассматривать такие факторы, как качество данных, стабильность производительности, пропускная способность, простота эксплуатации и расход материалов. В то время как в нескольких сравнительных исследованиях изучалась изменчивость констант кинетической скорости, полученных из нескольких лабораторий и биосенсоров^5,16, недавно опубликованное сравнительное исследование более подробно рассматривает систематические факторы, влияющие на надежность данных с точки зрения инструментальной производительности^17,18. Протоколы, представленные в этом видео, подробно посвящены экспериментальной установке и процедурам и сопровождаются исследовательской статьей под названием "Сравнение биосенсорных платформ в оценке кинетики связывания антител и антигенов с высоким сродством"¹⁷. Эти протоколы предназначены не только для того, чтобы помочь новым пользователям биосенсоров внедрить эти инструменты в свои исследовательские цели, но и для того, чтобы предоставить текущим пользователям биосенсоров дополнительную информацию о технических проблемах и соображениях в экспериментальных дизайнах для оценки высокоаффинных взаимодействий антител-антигенов.

Protocol

1. Белки и антитела

1. Продукты и очистить человеческий пропротеина конвертазы субтилизина Kexin тип 9 (PCSK9) и десять мышей , полученных анти-PCSK9 мАт , как описано ранее ^17.
2. Оценка чистоты очищенных продуктов путем последовательных инъекций 10 мкг каждого образца в колонку аналитического эксклюзионный (SEC) с использованием системы UPLC ^19.

2. Кинетические измерения в Т100 Biacore

1. Инструмент и Подготовка реагентов
   1. Равновесие сенсорного чипа CM5 при комнатной температуре в течение 15 мин.
   2. Оттепель два 200 мкл аликвоты 200 мМ 1-этил-3- (3-диметиламинопропил) карбодиимида гидрохлорида (EDC) и двух 200 мкл аликвоты 50 мМ N-гидроксисукцинимида (NHS) при комнатной температуре.
   3. Подготовьте 1-L бутылку 1x HBS-EP (10 мМ HEPES рН 7,4 [], 150 мМ NaCl, 3 мМ ЭДТА и 0,005% об / об полисорбат Р20) работает буфер дификсирующий с 10-кратным HBS-EP + маточным раствором в воде.
   4. Подготовить 1 мл белка А / G при 30 мкг / мл в 10 мМ ацетата натрия (рН 4,5) и 500 мкл каждый образец монАТа при 0,063 мкг / мл в рабочем буфере HBS-EP. Оттепель замороженный флакон человеческого PCSK9 на льду.
   5. В программе управления, откройте меню «Сервис | Eject Chip», поместите фишку датчика в ножны и близко. Нажмите "Инструменты | Set Temperature", введите "25" ° C, так как температура анализа и "10" ° C, так как температура отсека.
2. Поверхность иммобилизации
   1. В программе управления, нажмите кнопку «Файл | Открыть / Новый мастер шаблона» и выберите «иммобилизация» из списка в левой панели.
   2. Нажмите кнопку «Создать», чтобы войти в окно настройки иммобилизации. Выберите «CM5» в качестве типа чипа и выберите «1» ячейку потока за цикл.
   3. Установите флажок рядом с каждой «ячейки иммобилизации потока 1/2/3/4» на ACTIVAт.е варианты. Выберите «Цель для иммобилизованного уровня» и «Амина» в качестве способа для всех проточных ячеек.
   4. Введите «30 мкг / Мл Проа / G» в качестве лиганда, убедитесь, что целевой уровень установлен на «10000» единицы ответа (RU) для всех ячеек потока.
   5. Проверьте «Prime до запуска» и нажмите кнопку «Далее». Выберите «Реагент Rack 2», определить место для реагентов и пипетки в отдельные пробирки образца соответственно. Вставьте стойку обратно в прибор, затем нажмите кнопку «Пуск» и введите название эксперимента, чтобы спастись, чтобы начать бег.
3. Аналит Связывание и циклов регенерации
   1. Нажмите кнопку «Файл | Открыть / Новый метод», выберите «20140812 Hu анти-PCSK9 IgGs связывания с х PCSK9» и открыть метод. Обзор параметров в методе.
   2. В «Assay шаги», обеспечить наличие 10 циклов, в которых «Ху PCSK9» это имя с «Образец» выбрано «PurpОСЭ». Число Репликация устанавливается в„1“.
   3. В «Типах цикла», установить время контакта с «220» с для захвата 1 над путем потока «2», «110» S для захвата 2 над путем потока «3», и «55» S для захвата 3 над путем потока "4". Скорость потока «10» мкл / мин в течение всех циклов захвата.
   4. Выберите «Пример 1», проверьте «Пример решения» в качестве переменной. Установка времени контакта до «600» с и времени диссоциации на «2700» с более пути потока «1, 2, 3, 4». Скорость потока устанавливается на «30» мкл / мин.
   5. Выберите «Регенерация 1», ввести «глицин-HCl рН 1,5» в поле раствора и установить время контакта с «20» с более пути потока «1, 2, 3, 4».
   6. В «Variable Settings», введите в 2 раза титрованием концентрации 100 нМ «- 6,25 нМ» для цикла 1-3, «50 нМ - 3.12 нМ» для цикла 4-8, и «5 нМ - 0,323 нМ» Fили цикл 9-10.
   7. В «Настройка Run», выбрать путь потока обнаружения «2-1, 3-1, 4-1», нажмите кнопку «Далее», установите флажок «Prime до запуска» и нажмите кнопку «Далее».
   8. Выберите «Образец и реагент Rack 1», определить место для реагентов и пипеткой в ​​отдельные пробирки образца соответственно. Вставьте стойку в прибор, затем нажмите кнопку «Пуск» и введите название эксперимента, чтобы спастись, чтобы начать бег.
4. Анализ данных с помощью BIAevaluation
   1. Нажмите «Кинетика / Affinity | поверхности связаны», выберите Fc «2-1», «3-1», или «4-1» по отдельности и проверить все отображенные кривой от различных концентраций аналитов, а также «ноль» концентрация заготовки.
   2. Нажмите кнопку «Далее», чтобы получить в буферном Blank вычитаемых кривых. Затем нажмите кнопку «Кинетика» выбрать: модель «1 1 Binding» и нажмите кнопку «Установить», чтобы получить оборудованный кинетической парамеОслабляет.
   3. Для глобального фитинга нескольких моноклональных антител , поверхностей, нажмите кнопку «Multiple R _макса» в нижней части и добавьте кривые связывания с другими FCS для той же МКИ к списку.
   4. Нажмите кнопку «Далее», чтобы получить все буфера пустыми вычитаются связывания кривых. Затем нажмите кнопку «Кинетика» выберите «1: 1 Переплет» модель, и выбрать «подходят местные» для каждого R _макс в параметрах для получения глобально , установленных кинетических параметров.

3. Кинетические измерения в XPR36 Proteon

1. Инструмент и Подготовка реагентов
   1. Равновесие сенсорного чипа GLM и 2-L бутылки PBS-T-EDTA (PBS [рН 7,4], 0,005% твин-20, и 3 мМ ЭДТА), работающий буфер при комнатной температуре в течение 15 мин.
   2. В программе управления, нажмите кнопку «Извлечь», а затем вставьте чип GLM. Установите температуру чипа до «25» ° С и температурой автосамплера до «10» ° C.Нажмите кнопку «Глицерин Initialization» и следуйте инструкциям, побудившие для инициализации микросхемы.
   3. Нажмите кнопку «Файл | Открыть» протокол предобусловливания из списка, подготовить решения в 96-луночного планшета. Затем нажмите кнопку «Выполнить», выберите протокол и нажмите кнопку «Пуск».
   4. Оттепель один 1 мл аликвоты 400 мМ EDC и один 1 мл аликвоты 100 мМ N-hydroxysulfosuccinimide (сульфо-NHS) при комнатной температуре.
   5. Подготовьте 2 мл белка А / G при 60 мкг / мл в 10 мМ ацетата натрия (рН 4,5) и 500 мкл каждого образца монАТ на уровне 0,25 мкг / мл, 0,125 мкг / мл, и 0,063 мкг / мл в PBS-T -EDTA рабочего буфера. Оттепель замороженный флакон человеческого PCSK9 на льду.
2. Иммобилизация, Аналит Связывание и регенерация
   1. Нажмите «Файл | Новый | Новый протокол». В разделе «Конфигурация», введите название эксперимента, выберите «GLM» чип, выберите «микропланшетов» и введите «2.2» мл объема.
   2. Выбрать"Протоколы | Образцы", определить "EDC / сульфо-NHS", как "Активатор" в скважинах H1-H6, "Белок A / G", как "лиганд" в G1-G6 "этаноламина" как "Deactivator" в F1-F6 , "Глицин" как "Регенератор" в E1-E6, PBS-T-EDTA "как "пустой" в D1-D6, "моноклональное антитело Х образец", как "лиганд" в C1-C6, и "человеческого PCSK9", как" аналит в скважинах H1-H6 в второй 96-луночного планшета.
   3. Выберите «Шаги», дважды нажмите кнопку «иммобилизация» в «Редактор протоколов», этапы включают в себя три последующие горизонтальные инъекции ВДГ / сульфо-NHS, белок A / G, и 1 М этаноламина каждый со скоростью потока «30» мкл / мин и время контакта «300» с.
   4. Нажмите «Регенерация», ввести три «18» -s импульсы глицина (рН 1,5) при «100» мкл / мин в горизонтальном и вертикальном направлениях, а затем два «60» -s импульсы PBS-T-EDTA в «25» мкл / минКроме того, в обоих направлениях.
   5. Нажмите кнопку «Лиганд», впрыснуть мАт 1 мАт 2 в вертикальном направлении с использованием скорости потока «25» мкл / мин и времени контакта «160» с.
   6. Нажмите кнопку «аналит», ввести пять концентраций человеческого PCSK9 (100 нМ до 6,25 нМ в 2-кратных серийных разведений) и пустой буфер более 6 горизонтальных каналов одновременно, на «40» мкл / мин в течение «600» S времени ассоциации с последующим на «2700» с времени диссоциации.
   7. Нажмите «Регенерация», ввести два «18» -s импульсы глицина (рН 1,5) при «100» мкл / мин в горизонтальном и вертикальном направлениях.
   8. Повторите описанные выше шаги после каждого цикла связывания для остального мАта.
      Примечание: В дополнение к 100 нМ - 6,25 нМ серии концентрация PCSK9 человек, 25 нМ - 1,56 нМ и 5 нМ - 0,313 серии концентраций нМ используются.
   9. Подготовка образцов и реагентов в двух 96-луночных планшетов в соответствии с положениями реагентовопределенный в шаге 3.2.2, а затем перейдите на вкладку «Выполнить», выберите протокол / эксперимент и нажмите кнопку «Пуск».
3. Анализ данных с помощью диспетчера Proteon
   1. Нажмите кнопку «Тип панели» и выберите «аналит». Затем нажмите кнопку «Протокол» Шаг и выбрать все кривые связывания в списке.
   2. Нажмите кнопку "Auto Process" и нажмите кнопку "Process | Channel Reference | Interspot". Затем нажмите кнопку "Process | Double Reference | Строка | A6".
   3. Нажмите кнопку «Создать Dataset» для сохранения отдельных наборов данных для каждой МКИ на все трех поверхности для кинетического анализа.
   4. Нажмите кнопку «Анализ Dataset», выделите каждый МАБ набор данных и нажмите кнопку «Анализ | Kinetic». Выберите модель «Ленгмюра» и «Одновременный ка / K» и нажмите кнопку «Далее».
   5. Выделите как ассоциации и диссоциации подходят диапазон, выберите «Local» R _макс, и нажмите кнопку «Далее» , чтобы выполнить подгонку , чтобы получитьподогнанные кинетические параметры.
   6. Повторите предыдущий шаг , но выбрать «Сгруппированные» R _макс для фитинга , чтобы получить экспериментальные значения Р _макс для вычисления лиганда поверхностной активностью.

4. Кинетические измерения в октете RED384

1. Реагент и подготовка образцов плиты
   1. Подготовьте 50 мл 1x KB (кинетический буфер, содержащий PBS рН [7,4], 0,02% твина-20, 0,1% альбумина и 0,05% азида натрия) путем разбавления 10x маточного раствора в PBS.
   2. Распределяют 1x KB в 96-луночный планшет при 200 мкл на лунку. 48 Гидрат против человеческого захвата (АКА) биосенсора советы в этих отдельных скважинах в течение по крайней мере 10 мин.
   3. Подготовьте каждый образец Mab при 20 мкг / мл, 10 мкг / мл и 5 мкг / мл в 1x КБ, а также человеческий PCSK9 в 7 титруемых концентрациях от 100 нМа до 1,56 нМ в 2-кратном серийные разведения.
   4. Загрузка образцов Mab в 384-луночный наклоненным дном микропланшет (REFErred в качестве реагента плиты) и PCSK9 решений человека в другом 384-луночный микропланшет (именуемого в качестве образца плиты) при 90 мкл на лунку.
   5. Нагрузка серия 1x KB и глицин (рН 1,5) растворы в скважинах внутри образца плиты.
      Примечание: Эти 1x KB скважины используются для чипа предобусловливания, базовой стабилизации и аналит диссоциации. Раствор глицина используется для регенерации.
2. Экспериментальный метод установки
   1. В программе сбора данных, нажмите кнопку «Эксперимент | Новый Мастер Эксперимент | Новая Кинетика Эксперимент | Основные Kinetics».
   2. В «Тарелка Определение», выполните действия, описанные ниже, чтобы определить типы выборок и позиций.
      1. Выбор каналов «16» и «формат 384-а».
      2. Определение местоположения реагента и образца на дисплее пластины, удерживая клавишу Shift, то время как левой кнопкой мыши на лунку, чтобы выделить 16 скважин одновременно.
      3. Щелкните правой кнопкой мыши налунки, содержащие образцы монАТа и выберите «Загрузить», чтобы обозначить стадию, на которой будет загружен мАт (или захваченный) на датчики AHC. Введите имена МАБ и концентрации в таблице справа.
      4. Правой кнопкой мыши на скважинах, содержащих человеческий PCSK9 и выберите «образец», чтобы указать шаг, при котором моноклональное антитело-захваченные датчики смоченным и связывающие взаимодействия измеряются. Введите соответствующие молярные концентрации в таблице на правой стороне.
      5. Определить лунки, содержащие 1x KB как «буфер» или «нейтрализация», и лунки, содержащие глицин в качестве «регенерации».
   3. В «Пробирной Определение», выполните действия, описанные ниже, чтобы определить экспериментальную установку:
      1. Нажмите кнопку «Добавить» и выберите «Базовый уровень», «Регенерация», «уравновешивания», «Загрузка», «Ассоциация» и «диссоциация» шагов в список с временами «30» с «30" , "18", с "200" с, "500" с, и "1800" с, соответственно. Скорость встряхивания "1000" показывает оборотов в минуту.
      2. Чтобы добавить шаги «Список Assay Steps», первый щелчок на шаг, а затем нажмите на скважинах, расположенных в любом образце или пластины реагента. Эти меры заключаются в следующем:
         1. Уравновешивание-Регенерация: предпосылкой датчики AHC по трем циклам «15» -s провалов в глицина (рН 1,5), чередующихся с «15» -s провалов в 1x КБ.
         2. Загрузка: захват образцов МАБ на датчики AHC для «200» с.
         3. Исходные данные: установить сигнал BLI для «60» с до стадии объединения.
         4. Ассоциация: погружение датчиков в лунки, содержащих различные концентрации человеческого PCSK9 для -s периода объединения «500».
         5. Разобщение: окунуть PCSK9 переплет датчиков в новые лунки 1x КБ для «1800» -s периода диссоциации.
         6. Регенерация: окунуть MAB-PCSK9 Bouй датчики в лунки глицина (рН 1,5) с двумя «18» -s импульсов между каждым циклом связывания.
   4. В «Experiments Review», скользит по шагам и внести необходимые изменения, возвращаясь к предыдущим закладкам.
   5. В «Выполнить эксперименты», введите время «60» S задержки и встряхнуть образец пластину во время ожидания. Установите температуру пластины на «25» ° C и нажмите «GO».
3. Анализ данных с помощью программного обеспечения для анализа данных ForteBio в
   1. Нажмите «Выбор данных | Загруженные данные | Кинетика | PCSK9 антитела связывания с PCSK9 7.23.14»
   2. В «Обработка», обрабатывать данные следующим образом:
      1. На шаге 1: нажмите кнопку «Sensor Selection», чтобы выделить датчики в H1-H6, щелкните правой кнопкой мыши на них и нажмите кнопку «Изменить тип датчика | Reference Sensor.»
      2. На шаге 2 установите флажок «Вычитание» и выберите «Среднее Эталонные датчики»; вычитать каждый активный датчик образца от среднего значения из 6 пустых датчиков буфера.
      3. На шаге 3, нажмите на кнопку «Align Оси Y» и выбрать «базовый», чтобы выровнять все кривые связывания к базовой стадии перед ассоциацией.
      4. На шаге 5, проверьте «Савицкого-Голея фильтрации», чтобы сгладить кривые связывания путем увеличения отношения сигнал-шум, и нажмите кнопку «Process Data!».
      5. На шаге 6, нажмите кнопку «Обработанные результаты», чтобы просмотреть обработанные кривые связывания.
      6. На шаге 7, рассмотреть четыре панели на правом отображаются обязательные кривые после каждого этапа обработки, и нажмите «Сохранить Обработанные данные».
   3. В «Анализ», «проверить ассоциации и диссоциация» и выбрать: модель «1 1».
   4. Выделите обязательные кривые «Global (полный)» подходит и группировать их по «цвету». Используйте «R _макс связанный» , чтобы выполнить установку на группу датчиков , покрытых тем же мКонцентрация Ab , чтобы получить экспериментальные значения Р _макс для расчета поверхностной активности лиганда и «R _макс UNLINKED датчиком» , чтобы выполнить глобальную установку на датчики , покрытые с несколькими концентрациями моноклональных антител , .
   5. Нажмите кнопку «Fit Curves» для получения искомых параметров кинетики. Сохранение результатов в конце каждого фитинга анализа.

5. Кинетические Измерения в IBIS MX96

1. Инструмент и Подготовка реагентов
   1. Равновесие чип СООН-G при комнатной температуре в течение 15 мин.
   2. Подготовьте 1-L бутылку работающей системы буфера (PBS, [рН 7,4], 0,01% твин-20) и буфер иммобилизации (10 мМ ацетат натрия [рН 5,0], 0,01% твин-20).
   3. Подготовьте каждый мАт с 20 мкг / мл до 0,16 мкг / мл с помощью 2-кратных серийных разведений как в системном буфере работает и ацетат натрия (рН 5,0) буфер иммобилизации.
   4. Разлить образцы Mab на два снаarate 96-луночные планшеты, в которых каждый мАт занимает 8 вертикальных скважин в концентрациях титрования при 200 мкл на лунку.
   5. Оттаивания аликвоты 400 мМ EDC и 100 мМ сульфо-NHS ​​при комнатной температуре.
   6. Подготовьте 300 мкл протеина А / G при 50 мкг / мл в ацетата натрия (рН 5,0) буфера иммобилизации и пипеткой его в пробирку.
   7. Подготовьте 200 мкл человеческого PCSK9 от 100 нМ до 0,39 нМ на 2-кратных серийных разведений в системе, работающей буфер. Пипетировать их в отдельные флаконы.
2. Кинетика несколько циклов с массивами антител аминных связью
   1. Смешайте EDC / сульфо-NHS ​​(400 мМ / 100 мМ) аликвоты и дозировать смесь в верхние 48 лунок нового 96-луночный планшет в количестве 200 мкл на лунку.
   2. Поместите исходный пластину (MAB разводили в ацетат натрия [рН 5,0]) в положении 2 и реагента пластины ВДГ / сульфо-NHS ​​в положении 1 внутри принтера.
   3. Установите сенсорный чип в CFM. Откройте «CFM 2,0» Softwarе, а затем нажмите кнопку «Загрузить настройки | 96 Амин Пара». Массив 10 х 8 антитела создается следующим образом:
      1. Доставьте EDC / сульфо-NHS ​​в верхней половине пластины реагента к датчику с использованием 48 микроканалов, и цикл их по поверхности датчика для «5» мин.
      2. Доставка образцов Mab в верхней половине пластины источника к датчику и циклу их через активированные поверхности для мин «10».
      3. Deliver буфер иммобилизации из конической трубки 50 мл на поверхности антитела для «5» мин.
      4. Повторите вышеуказанные процедуры для остальных образцов моноклональных антител, в нижней половине исходной пластины.
   4. Закрепление печатной микросхемы датчика в прибор. В программе управления, нажмите кнопку «Файл | Connect | Открыть измерения | Существующие измерения» и выберите «2014-08-15».
   5. В «Общие» выберите «G - System Prime» в разделе «Полный сценарий системы». Затем выберите «G - QuEncч», чтобы дезактивировать поверхности Mab путем инъекции 150 мкл 1 М этаноламина.
   6. Нажмите кнопку «Камера» для визуализации массивов МАБ и при необходимости отрегулировать контрастность. Поместите красные квадратики, чтобы окружить пятна МАБА и перемещать зеленые квадратики в interspots, расположенного между активными моноклональными антителами, местами для ссылок.
   7. В "Анализ цикла", выберите "A - AP Standard Run" в разделе "IBIS Scripts". Установить 1,0 мин для базовой линии, 10,0 мин для ассоциации, и 90 шагов для диссоциации со скоростью 8 мкл / с.
   8. Внутри «Циклы», вводят человеческий PCSK9 одну концентрацию в момент времени после пяти буферных инъекций. Регенерация поверхности Mab с глицином рН 2,0 между каждым циклом связывания.
3. Кинетика однотактной с Fc-захвачены массивами антител
   1. Установить новый сенсорный чип в CFM. Повторите шаги 5.2.3 на 5.2.5 выше, путем замены образцов Mab с белком A / G.
   2. УдалитьДатчик стружки от MX96 и вставить его обратно в принтер CFM.
   3. Доставить мАт в верхней половине пластины с белком A / G поверхности датчика с использованием 48 микроканалов, и цикл их по всей поверхности с использованием двунаправленного потока в течение 10 мин.
   4. Повторите описанную выше операцию для остальных образцов моноклональных антител, в нижней половине пластины.
   5. Закрепление напечатанного обломка датчика в прибор MX96. В программном обеспечении сбора данных, нажмите кнопку «Файл | Connect | Open измерения | Существующие измерения | Далее» и выберите «Protein A + G связывания kinetic7.30.14».
   6. Нажмите кнопку «камеры», чтобы визуализировать массивы МАБ и при необходимости отрегулировать контрастность. Поместите красные квадратики, чтобы окружить пятна МАБА и перемещать зеленые квадратики в interspots, расположенного между активными моноклональными антителами, местами для ссылок.
   7. В "Анализ цикла", выберите "A - AP Standard Run" в разделе "IBIS Scripts". Набор «1,0 мин» для базовой линии, «10.0мин»для объединения, и„“шаги для диссоциации на„10“/ сек скорость 8 мкл.
   8. Внутри «Циклы», вводят человеческий PCSK9 одну концентрацию в момент времени после пяти буферных инъекций. Регенерация не выполняется между каждой инъекцией аналита.
4. Анализ данных с помощью Спринт и Поломоечные
   1. В Sofware SprintX, нажмите «Файл | Открыть Triangle Файл», выберите все образцы уколы в списке, и «перед нажатием кнопки» Анализировать флажок «Сохранить SprintX файл», «Калибровка», и «определение RLL».
      Примечание: Значения RLL относятся к иммобилизованным / захваченным уровням моноклональных антител, на поверхности сенсора.
   2. Проверьте «Реферирование» и выберите «Локальный», чтобы использовать соседние опорные точки. Также проверьте «Align» на первой инъекции, а затем нажмите кнопку «Пуск автоматизации.»
   3. На вкладке Последовательная выберите «Показать линейки на панели инструментов,» настроить ихчтобы выбрать небольшую область базовой линии непосредственно перед первой инъекцией образца, и выберите «Ноль».
   4. Сформировать файл .IBMX для анализа в скруббер, выбрав «Экспорт в файл IBMX», а затем нажмите кнопку «Пуск автоматизации.»
   5. Запустите Поломоечные и загрузите файл .IBMX. Введите «100N», как «Фондовая конц» и «2», как «фактор разведения».
   6. Данные Crop, удалить все базовые до начала впрыска и выровнять кривые связывания в начале объединения.
      Примечание: Для эксперимента кинетики одного цикла, не совпадают кривые.
   7. Перейдите на вкладку «Kinetics», установите линейку для конечного времени впрыска, выберите «K _D» и нужный, то «исправить K _D.» Выберите «K _A K _D» и установить его снова.
   8. Поплавок столбца K _D и установить снова для дальнейшего уточнения подгонки.
      Примечание: Для подгонки одного цикла связывания кривых, Нажмите кнопку «Opts» и снимите флажок «Вычитание», затем выберите «Separate» и плывет колонку «Begin INJ», чтобы соответствовать профилям ассоциации обратно к теоретическому базового происхождения.
   9. Обзор искомых параметров кинетики на вкладке Результаты.

Results

На рисунке 1 показано изображение массива антитела из CFM и пятнистых уровней моноклональных антител , с помощью двух методов иммобилизации, а на рисунок 2 показаны соответствующие обязательные сенсограммы , генерируемые в MX96 от мульти-цикла кинетических и кинетических измерения Однотактных на этих моноклональные антителах , массивы , Связывание и кинетический подогнанные кривые из нескольких поверхностей покрытых антител , генерируемых в четыре биосенсоре платформ в режиме реальное время показано на рисунках 3 - 6. На фиг.7 показано сравнение конечных кинетических скоростей и равновесных констант связывания , полученных из глобального анализа этих кривых связывания. Отдельные ассоциации (к _а), диссоциации (K _d), и равновесие _(KD) константы связывания представлены в таблице 1. Для того, чтобы продемонстрировать изменчивость наборов данных, генерируемых в рамках одного инструмента, K _A, K _D и K _D при различных плотностях мАта поверхности, и фиг.9 дополнительно сравнивает вычисленную связывающую деятельность поверхностей моноклональных антител , биосенсор платформ.

Рисунок 1. Мультиплекс Лиганд Массивы аминной связи (А) и Fc-захвачены (B) антитела поверхностей от CFM печати в IBIS MX96. Изображения печатных массивов показаны в левой панели, где серые зоны , окруженные красными квадратами указывают на наличие антител. Более темные interspots, расположенные между активными пятнами антител используются для эталонного вычитания. Каждый столбец содержит антитело, напечатанное в концентрациях, указанных ниже титрования и слева от изображения. Количества печатных антител количественно путем расчета диfference в объемных сдвигах между активными и опорными точками приведены в правых панелях. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2. Сравнение реального времени Binding сенсограмм из нескольких циклов (А) и один цикл (B) Кинетические эксперименты в IBIS MX96. Последовательные инъекции человеческого PCSK9 при увеличении концентраций через решетку 10 х 8 антител отмечены выше каждый соответствующий сегмент сенсограммы. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

(верхние панели), средне- (средние панели), а также с низкими (нижними панелями) поверхности плотности. Налагаемое гладкие черные линии представляют собой кинетическую подгонку связывания ответных сигналов при различных концентрациях человека PCSK9 (цветные линии) к 1: 1 модели взаимодействия. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4. Связывание сенсограмм захваченных антител человека Взаимодействие с PCSK9 и 1: 1 кинетической моделью Fit наложений в Proteon XPR36. Взаимодействие оценивается более высокие (верхние панели), MediUM - (средние панели), а также с низкими (нижние панели) поверхность плотности. Налагаемое гладкие черные линии представляют собой кинетическую подгонку связывания ответных сигналов при различных концентрациях человека PCSK9 (цветные линии) к 1: 1 модели взаимодействия. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 5. Связывание сенсограмм захваченных антител человека Взаимодействие с PCSK9 и 1: 1 кинетической моделью Fit наложений в октете RED384. Взаимодействие оценивается более высоко- (верхние панели), средне- (средние панели), а также с низкими (нижними панелями) поверхности плотности. Налагаемое красные линии представляют собой кинетическую подгонку связывания ответных сигналов при различных концентрациях человека PCSK9 (цветные линии) до 1: 1 модель взаимодействия. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 6. Связывание сенсограмм из аминных в сочетании (А) и Fc-захваченных (B) антител человека Взаимодействия с PCSK9 и 1: 1 кинетической моделью Fit наложений в IBIS MX96. Связывающие профили организованы в виде 10 х 8 панелей , которые следуют карте массива пластины на рисунке 1. Черные линии представляют собой записанные обязательные ответные сигналы при различных концентрациях PCSK9 человека, и наложенные красные линии представляют собой встроенные кривые. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

фигура 7" SRC = "/ файлы / ftp_upload / 55659 / 55659fig7.jpg" />
Рисунок 7. Сравнение Ассоциации K _A (A), диссоциация к _D (B), и равновесный К _Д (С) константами связывания , порожденных платформами Четыре биосенсора. Кинетические параметры получены из глобального анализа связывания кривых на рисунках 3 - 6. Приборы представлены следующим образом: Biacore T100 (синий), Proteon XPR36 (зеленый), октет RED384 (красный), ИБИС MX96, амин связи (фиолетовый), и ИБИС MX96, Fc-захвачены (оранжевый). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 8. Сравнение Консистенции кинетических Констант За множество антител поверхностных плотностей в BIAC руда Т100 (А), Proteon XPR36 (В), октет RED384 (С), ИБИС MX96, амин связью (D) и ИБИС MX96, Fc-захвачена (Е). Кинетические параметры K _A (верхний субпанели), K _(D среднего суб-панели), а К _D (нижние субпанели) получают из группового анализа на индивидуальной поверхностной плотности антитела. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 9. Связывание Деятельности антител поверхностей и их стандартные отклонения (погрешности) в платформах Четыре БИОСЕНСОРА. Значения вычисляются с использованием уравнений , описанных в научных статьях ^17.large.jpg»целевых =„_blank“> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

	к а	к д	K D
	(М -1 с -1)	(с -1)	(нМ)
мАт 1	11,7 (7,8) × 10 5	4,89 (4,18) х 10 -5	0,052 (0,05)
мАт 2	1,53 (0,28) × 10 5	1,30 (1,54) х 10 -5	0,092 (0,12)
мАт 3	11,4 (8,3) × 10 5	27,6 (11,0) × 10 -5	0,333 (0,20)
мАт 4	3,61 (1,6) × 10 5	20,1 (12,3) х 10 -5	0,659 (0,54)
мАт 5	0,59 (0,21) × 10 5	3,46 (2,50) х 10 -5	0,663 (0,46)
мАт 6	1,19 (0,78) × 10 5	7,21 (3,83) х 10 -5	0,894 (0,64)
мАт 7	1,29 (0,53) × 10 5	16,4 (5,63) х 10 -5	1,57 (1,02)
мАт 8	4,02 (2,23) × 10 5	22,8 (10,7) х 10 -5	0,768 (0,68)
мАт 9	4.20 (2.13) × 10 5	6,67 (4,3) × 10 -5	0,197 (0,16)
МКА 10	1.20 (0.49) X 10 5	12,5 (7,64) х 10 -5	1,27 (0,80)

Таблица 1: Кинетические Цены и Равновесие константы связывание 10 моноклональных ПОЛУЧЕННОГО Глобальной фитинге кривых связывания с четыре БИОСЕНСОРОМ инструментов в 1: Модель взаимодействия 1.

Discussion

Наше исследование сравнения головы к голове показывает, что каждая биосенсора платформа имеет свои сильные и слабые стороны. Несмотря на то, связывающие профили антител подобны путем визуального сравнения (Рисунки 3 - 6), и ранг порядок полученных констант кинетических скоростей весьма последовательно через инструментов (рисунок 7), полученные нами результаты показывают , что ППР на основе приборов с непрерывная струйная потока) лучше при разрешении высокой аффинности взаимодействий с низкой скоростью диссоциации. Восходящий дрейф во время фазы диссоциации наблюдается в наборах данных (например, МАт 2, мАт 5, и мАт 9; Рисунок 5) , порожденный BLI гидросистемы свободного инструментом. Этот вывод может быть связан в значительной степени испарения образца с течением времени в микропланшете, который является основным ограничением системы. С помощью этого присущего ограничения, экспериментальное время также ограничено до менее чем 12 ч; Поэтому эксперименты были запрограммированы с шorter раз (500 сек ассоциации и диссоциации 30 мин) по сравнению с теми из других платформ (10 мин ассоциации и диссоциации 45 мин). Тем не менее, сокращение экспериментального времени не появлялось , чтобы смягчить влияние испарения на качестве данных / консистенции, так как константы скорости , генерируемые Л на основе прибора , показывают меньшую линейность в результате флуктуаций в некоторых из отходящих ставок (фиг.8С ). В дополнении к испарению образца, различие в используемых реагентах, используемых захвата может также способствовало различиям в полученных результатах. В то время как белок A / G использовали во все три гидросистеме на основе SPR платформы, датчики AHC были использованы в не-гидросистеме BLI платформе. Так как белок A / G, вероятно, имеют более слабое сродство к мАт, чем делает ПВК, антитело на основе биосенсора поверхность, отходящие темпы мАт-антиген комплекса от белка A / G поверхностей может искусственно появляться быстрее, чем те, получено от поверхности AHC. Эта возможность поддерживается бу экспериментальные данные , показывающие , что значения вне скорости , генерируемые платформой BLI были последовательно ниже , чем полученные от других инструментов (рисунок 7, красная линия). Тем не менее, BLI платформа имеет различные преимущества по сравнению с другими платформами. Например, она обладает высокой гибкостью в отношении выбора датчика и конфигурацию анализа из-за различные предварительно покрытые датчиками для немедленного использования. В наших экспериментах, использование датчиков AHC устраняет необходимость шагов лиганда иммобилизации, сокращая время приготовления. Кроме того, платформа ЛА требует гораздо меньшее техническое обслуживания по сравнению с другими струйной SPR платформ, которые отличают сложную насосно-компрессорную и переключатель значения конфигурации. Эта функция является преимуществом для экспериментов с сырой образцы, которые могут вызвать проблемы засорения и загрязнения.

Поскольку спрос на эффективное, быстрое и точное выявление терапевтических кандидатов возрастает, потребность в биosensor пропускная способность также растет. Среди четыре биосенсора платформ, пропускная способность от биосенсора, способного 96-лиганда печати массива является самым высоким, с последующим биосенсором, соединенным с пересекающим 36-лигандом формата и Л на основе биосенсора с 16-канальным синхронным считыванием, которая в конечном счете увеличить число взаимодействий, измеренных в одном цикле связывания до 96, 36 и 16, соответственно. Эти возможности пропускная способность значительно выше, чем у традиционной SPR платформы, которая ограничена наличием только четыре ячейки потока, соединенные один последовательный поток. Поскольку наши эксперименты включали относительно небольшой набор образцов из 10 моноклональных антител оценивали в нескольких поверхностных плотностей с большим временем диссоциации, инструментальные пропускные способности играет умеренную роль в определении эффективности экспериментов. Там не было никаких существенных различий в экспериментальных времен трех высокопроизводительных платформ, а также во всех случаях опыты были проведены в один день, С другой стороны, традиционные эксперименты SPR последовательного потока требуется 3 дня, чтобы закончить, несмотря на блуждания одноразовая автоматизации сбора данных после установки в. В других исследованиях, включающие большое количество образцов (например , в сотнях или тысячах), для ранжирования от скорости / Кинетическая скрининга или эпитоп биннинговых целей, пропускная способность становится критическим фактором.

Хотя пропускная способность в IBIS MX96 на несколько порядков выше, чем у других биосенсоров и поэтому является оптимальным выбором для этих целей, он имеет несколько недостатков. В частности, печать массива с помощью CFM показывает большие поверхностные несоответствия (рисунок 1) и снижение воспроизводимости данных (рис 8D и 8E). Для получения точных кинетических измерений, количество лиганда на поверхности биосенсора является критическим параметром, который необходимо контролировать, чтобы гарантировать, что связывание ответы не нарушается вторичными факторами, такие какмассоперенос или пространственное затруднение. Для Biacore T100 и Proteon XPR36, уровни оптимальной R _L были определены на основе стандартного расчета значений _макс множество R , как описано в статье ¹⁷ исследований. С другой стороны, для платформ Октета RED384 и ИБИС MX96, уровни захвата монАТа были достигнуты эмпирический с использованием ряда 2-кратно серийно разведенными антител при постоянном время. Отсутствие знаний или контроля стадии захвата привело к поверхности с высокой плотностью и высокими сигналами связывания отклика (рисунок 2) , что , возможно, скомпрометированных точностью констант кинетических скоростей. Кроме того, разделение принтера от детектора SPR также представляет собой проблему при проведении нескольких измерений связывания цикла с участием перерождения. Единственный способ выполнить настройку кинетики мульти-цикла путем прямое аминное сочетание из мАта, в отличие от захвата через монАТ Fc с иммобилизованным белком A / Gповерхность в трех других платформах биосенсора. В результате дополнительный эксперимент регенерации разведки требовалось, чтобы определить оптимальные условия регенерации. Исход этой установки был связан с ~ 90% меньше наблюдаемой поверхностной активностью по сравнению с методом захвата Fc (рисунок 9), в дополнении к уже времени эксперимента. Для того, чтобы выполнить метод захвата Fc, был принят кинетический подход Альтернативы однотактного. Этот подход включает в себя последовательное введение анализируемого вещества при увеличении концентраций без регенерации между каждой инъекции (рисунок 2). Это очень удобно, но менее часто применяется подход не только сократил время эксперимента и снижение расхода реагента, но и получает константы кинетической скорости весьма сходные с теми из других биосенсоров (рисунок 7). Поэтому, применяя эту кинетику однотактного подход преодолевает присущее конфигурации ограничение прибора и представляет собойвозможность для получения констант с высокой разрешающей способностью кинетических скоростей в высокой пропускной образом.

Несмотря на пропускной способности является основным ограничением в Biacore T100, наши результаты в совокупности показывают, что она породила наиболее последовательные данные с высоким качеством. Это сопровождалось Proteon XPR36, который имеет ~ 10 раз выше пропускной способности. Их способность генерировать высококачественные данные становится преимуществом при характеристике высоким сродством антитело-антиген взаимодействий, которые могут быть технически сложной задачей при достижении пределов обнаружения инструментов. В то время как систематические ограничения в измерительных приборах октет RED384 препятствуют точному измерению констант диссоциации скорости (т.е. далеко от чувствительности разрешить достаточное затухание сигнала для медленного офф-ставка), как Biacore T100 и Proteon XPR36 может обеспечить чувствительным и надежным обнаружения для дифференцировки.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Система Biacore T100	GE Healthcare	28975001	Система T100 была модернизирована до
сенсорного чипа T200 CM5	GE Healthcare	BR100012
BIAevaluation	GE Healthcare		Версия 4.1
Программное обеспечение для управления Biacore T100	GE Healthcare		Программное обеспечение для управления T100 было обновлено до T200
Amine Coupling Kit	GE Healthcare	BR100050	Содержит: 750 мг 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида гидрохлорида (EDC), 115 мг N-гидроксисукцинимида (NHS), 10,5 мл 1,0 М этаноламин-HCl pH 8,5
Буфер HBS-EP+ 10&раз;	GE Healthcare	BR100669	Решение для концентрированных запасов
Пластиковые флаконы, наружный диаметр 7 мм	GE Healthcare	BR100212
Резиновые колпачки, тип 3	GE Healthcare	BR100502
Пластиковые флаконы и колпачки, наружный диаметр 11 мм	GE Healthcare	BR100214
ProteOn XPR36 Система матриц взаимодействия белков	Bio-Rad	1760100
Программное обеспечение ProteOn Manager	Bio-Rad	1760200	Версия 3.1.0.6
Чип датчика GLM	Bio-Rad	1765012
Аминный соединительный комплект	Bio-Rad	1762410	Он включает в себя EDAC (EDC), сульфо-NHS, этаноламин HCl
Набор для регенерации и кондиционирования и буферов	Bio-Rad	1762210	включает в себя по 1 глицину буфера (pH 1,5, 2,0, 2,5, 3,0), а также NaOH, SDS, HCl, фосфорную кислоту, NaCl; по 50 мл раствора
2 л PBS/Tween/EDTA buffer	Bio-Rad	1762730	Включает в себя хосфатный буферизованный физиологический раствор (PBS), pH 7,4, 0,005% Tween 20, 3 мМ EDTA
Октет RED384 Система	Forté
Программное обеспечение для анализа биоданных	Forté		Био версия 9.0.0.4
Погружение и чтение анти-hIgG Fc Capture (AHC) биосенсоры	Forté Bio	18-5060	Один лоток из 96 биосенсоров
384-луночная пластина с наклонным дном	Фортé Bio	18-5080
Биосенсорный диспенсер	Forté Bio	18-5016
Kinetics Buffer 10x	Forté Bio	18-1092	10-кратная концентрация. Содержит ProClin 300.
IBIS MX96 SPRi System	Wasatch Microfluidics
Microfluidics Непрерывный микроспоттер (CFM) принтер	Wasatch Microfluidics		Версия 2.0
SensEye COOH-G чип	Wasatch Microfluidics		1-09-04-004
Программное обеспечение для анализа данных	Wasatch Microfluidics		Версия 6.19.3.17
SPRint Программное обеспечение	для анализа данныхWasatch Microfluidics		Версия 6.15.2.1
Скруббер 2	Программное обеспечение		Версия 2
Пирс Рекомбинантный белок A/G	ThermoFisher Scientific	21186