Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

В модели диабетической крысы блока ультразвуковой инструмент для нервной проводимости

7.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/55675

⸱

20 октября 2017 г.

 ,  ,  , 
1Institute of Biomedical Engineering and Nanomedicine, National Health Research Institutes, 2Department of Neurology, National Cheng Kung University Hospital

В этой статье

Краткое содержание

Эта работа представляет методологию применения высокой интенсивности сосредоточены УЗИ блокировать потенциалы действия диабетической нейропатической нервов.

Аннотация

Недавно в нормальных и диабетической животных моделей выполнена блок проводимости нерва с датчика высокой интенсивности сосредоточены УЗИ (HIFU). HIFU обратимо блокирует проводимости периферических нервов без повреждения нервов при использовании соответствующего параметра ультразвуковой. Временного и частичного блок потенциалы действия нервов показывает, что "ХИФУ" имеет потенциал, чтобы быть полезным клинического лечения для облегчения боли. Эта работа демонстрирует процедуры для пресечения действий потенциалов нейропатической нервов в диабетической крысы в естественных условиях с помощью датчика HIFU. Первым шагом является создание взрослых самцах диабетической нейропатической впрыской Стрептозотоцин (СТЗ). Второй шаг заключается в оценке периферийных диабетической невропатии в СТЗ индуцированной диабетической крысы электронный зонд фон Frey и плита. Последний шаг заключается в записи в vivo внеклеточного потенциалы действия нерва, подвергается HIFU sonication. Метод показал здесь может пользу изучения ультразвукового болеутоляющее приложений.

Введение

Устные лекарства, иглоукалывание1, и электрические нерва стимуляции2 были использованы для лечения болезненных диабетической полинейропатии. Однако побочные эффекты оральные препараты, инвазивные операции акупунктуры и электрические нерва стимуляции препятствовать Терапевтическая эффективность и соблюдение пациента. Блок УЗИ периферических нервов в животных моделях была исследована для десятилетий3,4,5. Проводимости в vitro седалищного нервов большая зеленая лягушка был обратимо ингибирует после лечения 10-20 импульсов ультразвукового воздействия на 0,4 - 1,0 s6. Одним из факторов для блокирования нервной проводимости является повышение температуры, вызванных УЗИ7. Для пациентов с полинейропатия подавление потенциалы действия соединения мышц (CMAPs) была исполнена в малоберцового нерва, подвергается низк интенсивности ультразвука для 2 мин8. Время полного восстановления был в течение 5 мин.

Недавно Продовольственная и лекарствами Соединенных Штатов одобрил HIFU для неинвазивного лечения матки fibroid опухоли9, боль palliations костных метастазов10и11рака простаты. HIFU преобразователь излучает акустическая балки вне тела, и лучи передают в различных средах тканей и сходятся на целевой опухоли в центре внимания. Зоне фокуса немедленно формируется для создания локализованного воздействия на целевой опухоли без повреждения окружающих тканей. HIFU применялось также тормозят нервной проводимости или вызвать денервации нерва в экспериментах в естественных условиях нормальной крысах Sprague-Dawley (SD)12. Кроме того краткосрочные и долгосрочные последствия HIFU нейропатической нервы были исследованы13. Предыдущие результаты показали, что реверсивные или постоянного блок проводимости чувствительных нервных может быть достигнуто путем HIFU с соответствующими параметрами. Помимо приложений, болеутоляющее HIFU может использоваться как инструмент расследовать относительный вклад периферических и центральных компонентов блокада проводимости нерва для фундаментальных исследований неврологии и разработки лекарств боли. Поэтому необходима HIFU блокировки технологической платформы для периферических нервов в животных моделях. Цель этой статьи заключается в демонстрации процедур для частично или полностью блокируя потенциалы действия периферических нервов в диабетической нейропатической крыс путем HIFU. Были созданы модели диабетической крысы и оценки периферийных нейропатической симптомов. Представлены HIFU платформы и экспериментальной процессов для лечения крыса седалищного нервов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

институциональных животное уход и использование Комитета национального здравоохранения научно-исследовательских институтов в Тайване одобрила все животные протоколы.

1. индукция диабетической модель мужского взрослого Sprague - Dawley (SD) крысы

  1. Удалить Крыса питания гранулы из клетки быстро SD самцах (300-350 g) за 6 ч до СТЗ индукции.
    2. Буфер
  2. Подготовка цитрат натрия (0,1 М, pH 4.5).
    1. Распустить 1,05 г лимонной кислоты моногидрата (C 6 H 8 O 7 · H 2 O; солнечники массовая 210.14) в 50 мл дистиллированной воды, чтобы сделать раствор лимонной кислоты 0,1 М.
    2. Распустить 1.47 g тринатрия цитрат дигидрат (C 8 H 5 O 7 Na 3 · 2 H 2 O; солнечники массовая 294.12) 50 мл дистиллированной воды, чтобы сделать раствор цитрата натрия 0,1 М.
    3. Добавить 25 мл раствора лимонной кислоты раствор цитрата натрия 25 мл. Контролировать pH буфера цитрата натрия (рН 4,5) с помощью рН метр.
      Примечание: Буфер производится изотонический путем добавления соответствующего объема Раствор цитрата натрия 0,1 М.
  3. Распустить СТЗ в буфера цитрата натрия 0,1 М приносить 50 мг/мл раствора СТЗ.
    Примечание: СТЗ решение светочувствительных, таким образом, охватывают СТЗ решение с алюминиевой фольгой и использовать в течение 15-20 минут
  4. Обратить решения СТЗ 50 мг/кг в 1 мл инсулина или туберкулин шприц с 26 - 28-го калибра иглы. очистить место инъекции с площадку этанола и внутрибрюшинно внедрить решение СТЗ в нижнем правом квадранте живота, чтобы избежать повреждения органы брюшной полости.
  5. Питания крыс с 10%-ая сахароза водой как источник единственным воды для 48 ч после инъекции СТЗ для предотвращения гипогликемия.

2. подтверждение от диабета в СТЗ индуцированной крыс

  1. монитор поста концентрация глюкозы плазмы всех крыс, вводят СТЗ пост 72 ч с метр глюкозы.
    1. Быстро уровень глюкозы крови СТЗ индуцированной диабетической крысы на 15 h перед началом измерения поста.
    2. Сдерживать крыс в мешке сдержанность и разоблачить хвосты для забора крови во время измерения глюкозы в крови.
    3. Использовать Ланцет крови колоть кончик хвоста для получения небольшой капли крови. Поместите каплю крови на тест-полоску глюкозы. Запись уровня глюкозы натощак плазмы.
      Примечание: Метр глюкозы обнаруживает и отображает уровень глюкозы в крови в единицах мг/дл. Исключить крыс с поста уровня глюкозы в крови ниже 150 мг/дл после 2 недель СТЗ индукция.

3. Оценка периферической диабетической невропатии в диабетической крысы

  1. оценки механических аллодиния с электронным фон Фрей.
    1. Приучать СТЗ индуцированной диабетической крысы в клетке на 1 см диаметр металлической сетки этаже за 30 мин до оценки задние лапы вывода ответа.
    2. Использовать электронный зонд фон Фрей с жестким наконечником (0,8 мм в диаметре) вручную применить давление на подошвенной поверхности задние лапы крыс и постепенно увеличивать давление до тех пор, пока рассматривается лапы вывода ответа.
    3. Запись давления, который показывает на систему и повторите измерение 5 раз в крысу, с интервалом в 30 s между каждым измерением.
  2. Оценить Гипералгезия тепла с горячей плите.
    1. Приучать СТЗ индуцированной диабетической крысы на горячей пластине (24 ± 0.5 ° C) на 10 минут перед вычислением болевой реакции.
    2. Удалить и поместить обратно в их клетках крыс после привыкания, тепла поджарки и поддерживать поджарки ' s температуре 55 ± 0,5 ° с.
    3. Место крысы на подогревом поджарки при одновременно запуск таймера.
    4. Когда крыса экспонаты различных поведений, как лизать задние лапы или аномально flicking Хинд лапу, остановить таймер и записывать задержка вывода.
      Примечание: Если крыса не выразить собственный поведения после 20 s (20 s cut-off time), прекратить испытания поджарки и удалить крысы из поджарки.

4. В естественных условиях Нерва закупорки проводимости с HIFU датчика

Примечание: эксперимент в vivo стартует Неделя 5 после инъекций 50 мг/кг СТЗ.

  1. Животных процедуры выполнять блокирование CMAPs с sonication "ХИФУ".
    1. Стерилизовать хирургические инструменты (скальпель, ножницы, пинцет и стекла крюк) в автоклаве до хирургии.
    2. Анестезировать крыс с внутрибрюшинной инъекции tiletamine/zolazepam смеси (40 мг/кг) и ксилазина (10 мг/кг) или через вдыхание 1,75% от изофлюрановая через изофлюрановая испарителем. Место крыс на грелку для поддержания температуры тела.
    3. Позиция крыс для операции в брюшной recumbency. Примените Глазную мазь. Расширение ноги крысы и щепотку подошвенной поверхности стопы с ногти для выяснения глубины анестезии. Если крысы Показать вывод ответы, применяются дополнительные анестезии.
    4. Удаление волос от бедра и Нижняя задней крыс с электрической машинки. Применение жидкой йода с чистой марлей в месте операции и циркулярно переместить марлю наружу хирургической сайта. Использование спиртом салфеткой вытирать жидкой йода с же кругового движения. Этот эксперимент выполняется на левой и правой хирургическое сайте. Повторите эту процедуру на другой Хирургический сайт когда выполнять следующий шаг процедуры.
    5. Использовать стерильные хирургические ножницы или скальпель сделать разрез кожи на спинной бедра. Используйте тупой Ножницы хирургические осторожно отделить ткани под кожей и обеспечить кожи с кожей крючки. бедренной кости можно увидеть внутри мышц.
    6. Использовать ножницы осторожно отделить параллельно бедренной мышцы до середины бедра седалищного нервных волокон, которые внедряются в мышцах видны. Внимательно используйте стекла крюк, чтобы отделить середины бедра седалищного нерва от окружающих соединительной ткани и мышцы.
  2. Позиция седалищного нерва в зоне фокуса HIFU, с помощью фиксаторов на заказ нерва ( рис. 1 и рис. 3).
    Примечание: Фиксатором на заказ нерв состоит из 3 компонентов ( рис. 3). Все компоненты изготовлены из прозрачной полиметилметакрилата (PMMA). Наружная резьба верхней структуры компонента I является 2,5 мм в высоту и M10XP0.7 ( рис. 4A). Центральный скважины — 4,0 мм диаметр отверстия через компонент I. Открытие нижней скважины запечатан лист ленты. Диаметр гнезда 1,2 мм и расстояние между центральной плоскости разъема и верхней поверхности компонента I 3.1 мм. компонент II состоит из главного органа, четыре ноги и нижней структуры ( рис. 4В). Внутренняя резьба нижней структуры — 2,5 мм в высоту и M10XP0.7 по размеру внешняя резьба компонента I. Диаметр центрального отверстия является таким же, как и центрального компонента I. Размеры корпуса являются 32 мм в диаметре и 5,4 мм в толщину. Симметрично развертываются четыре ноги. Две идентичные короткие ноги предназначены для выравнивания и два одинаковых длинные ноги работают для подключения компонента III. Наружный диаметр и высота компонента III являются 41 мм и 9,2 мм. Внутренняя резьба M36XP1.0 и через отверстие 27,5 мм в диаметре (< сильный класс = «xfig»> Рисунок 4 c). Конус-это полый конус с верхней открытия 84 мм в диаметре и нижней открытия 27,5 мм в диаметре. Высота составляет 57,5 мм ( рис. 5A).
    1. До эксперимента, замочить на заказ акриловые нерва фиксатором в раствор отбеливателя для 30-60 мин после замачивания в стерильной воде.
    2. С помощью стекла крюк, осторожно поднимите нерва и положил его в слот компонент I.
    3. Винт компонент II компонент I. заливки Центральной ну компонента, я с звонаря ' s решение для ультразвуковой сохранения распространения и нерва.
    4. Винт компонент III HIFU жилья конуса. Компонент III док с II через четыре ноги компонента II.
      Примечание: Геометрический центр трех компонентов и преобразователя выравниваются. Расстояние между нерва и датчика равно Фокусное расстояние, которое обеспечивает нерв находится внутри зоны фокуса HIFU.
  3. Вставить одну пару акупунктурные иглы в происхождении седалищного нерва и другие пары в икроножных мышц. Соединим все пары иглы к системе приобретения электрофизиологии через электрические коаксиальный кабель ( рис. 1).
    Примечание: На одном конце кабеля являются два крокодил клип две иглы отдельно и на другом конце кабеля разъем BNC для связи системы. Пар иглы для акупунктуры работают как запись электродов в икроножных мышц и стимулирующих электродов на седалищный нерв.
    1. Задать частоту выборки и пропускной способности системы приобретения электрофизиологии до 50 и 70 Гц - 3 кГц, соответственно. Обратиться стимулирующих электродов на происхождение седалищного нерва выше максимальные стимул с шириной импульса 0,1 мс.
    2. Запись CMAPs от записи электродов и усилить CMAPs с встроенным усилителем в системе приобретения электрофизиологии.
      Примечание: Используйте встроенный усилитель в системе приобретения электрофизиологии усилить нервные сигналы и записывать CMAPs от записи электродов с системой приобретения электрофизиологии.
  4. Использовать преобразователь HIFU коммерческих 2,68 МГц для подавления CMAPs в диабетической нейропатической крысы.
    Примечание: Технические характеристики датчика описаны следующим образом: один элемент сферической чаши с отверстие диаметром 6 см и фокусное расстояние 5 см и эллипсоид фокальной зоне 4 мм в глубину и 0,8 мм в ширину, в свободном поле.
    1. Погрузиться сферических конуса, HIFU датчика и конус покрова в бак наполнен дегазации воды. Положите HIFU датчика в сферических конуса и исправить крышку конуса в верхнее отверстие сферической конуса, 6 винтов ( Рисунок 5B). После того, как пузырьки сферической конуса изгоняются естественно из-за низкой плотности по сравнению с водой пузырьки, печать интерфейсных открытие конуса, прозрачной 0,03 мм толщиной ленты. Компонент III винт на сферической конуса.
    2. Вывезти HIFU датчика с сферически конуса и компонент III из резервуара для дегазации воды.
      Примечание: Обратного осмоса вода, используемая в исследовании является вода, очищенная методом обратного осмоса. Обратного осмоса воды кипятят изгнать газ. После охлаждения, дегазации воды получается в отдельных герметичных резервуар.
  5. Положить компонент я в пространство между нервной и мышечной тщательно и положение нерва в зазоре компонент I. выполняют шаги 4.2.3 и 4.2.4 обеспечить, что нерв находится внутри зоны фокуса HIFU ( Рисунок 3A < / сильный >).
  6. Ссылка функция генератор и усилитель мощности радиочастот. Подключите усилитель к HIFU датчика для поколения HIFU луча. Вручную задайте выходного напряжения генератора функция HIFU датчика через усилитель мощности. Вручную выключите функции генератора после HIFU-Выдержка вверх. Соблюдать время с помощью таймера.
    Примечание: Интенсивность и энергии пучка HIFU, используемые в данном исследовании не 2810 Вт/см 2 и 84 J/мм 2, соответственно.
  7. Одновременно, доставить стимул через систему приобретения электрофизиологии (шаг 4.3) и HIFU пучка через HIFU системы (шаг 4.6) седалищного нерва во время записи CMAPs. Постепенно увеличивать HIFU воздействия на седалищный нерв от 3 сек, 5 s до 8 s до тех пор, пока наблюдается уменьшение или ингибитированием амплитуды CMAPs.
    1. Запись CMAPs один раз в секунду во время доставки HIFU луча. После наблюдения за изменением амплитуды CMAPs, выключите HIFU системы и вручную нажмите на значок записи на электрофизиологии приобретение программного обеспечения для записи CMAPs каждые 2 мин в начале 10 мин, каждые 5 минут в подряд 30 мин и каждые 10 минут в Последний этап до тех пор, пока время записи достигает 2 х.
  8. Отдельный компонент II и III нерва фиксаторов ( рис. 3) для удаления HIFU датчика из сайта разрез. Отдельный компонент II и я выпустить обеспеченного седалищного нерва. Шовные хирургические сайт диабетической крысы по 4-0 Хромовой Кетгуд после записи CMAPs. Применение жидкой йода на хирургический сайт для предотвращения инфекции.
    1. Место клетки на грелку и позволяют крыс восстановить в их клетках до возвращения их в объекте животных. Предоставить крыс с ибупрофен в питьевой воде для 3 дней или внутрибрюшинной инъекции бупренорфин (0,05 - 0,1 мг/кг).
  9. Вставить стимулирования и записи электродов в происхождении седалищного нерва и икроножных мышц наркотизированных крыс диабетической нейропатической, как описано в шагах 4.1.2 и 4.3 на 7, 14 и 28 дней после первоначального HIFU sonication. Повторите шаги 4.3.1 в 4.3.2.
    1. Место клетки на грелку и позволяют крыс восстановить в их клетках перед перемещением клеток для животных фонда.
  10. Усыпить крыс после эксперимента. Место крыса в камеру углекислого газа. Подождите около 5 минут для крыс остановить дыхание. Убедитесь, что сердце перестало биться.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

В естественных условиях исследование показало, что, с HIFU доза 3 s sonication на интенсивность 2810 Вт/см2, CMAPs были подавлены 20% от базового уровня, но они были полностью оправился после 30 мин (рисунок 2A, алмазы) и были почти Константа в период 28 дней (Рисунок 2Б, алмазы). 5 s HIFU воздействия на той же интенсивности CMAPs снизилась до 65,4% (9,5%) базового уровня в 4 мин и восстановлены 73,7% (12,6%) ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Частичное и временное подавление action potentials нейропатической нервов от диабетической крысы в естественных условиях и мгновенное появление блокирующий эффект после лечение HIFU, которые оба были замечены. 28-день последующее исследование по CMAPs продемонстрировал, что безопасного блокады нервной проводимости может осуществляться на соответствующей экспозиции HIFU. В результате выше протокол лечение HIFU может предоставить альтернативное решение для блока реверсивные проводимости седалищного нервов в диабет...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Это исследование было поддержано Министерством науки и технологии (проект наиболее 105-2221-E-400-001) и национального здравоохранения научно-исследовательских институтов (проекта БН-105-PP-10), Тайвань.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
стрептозотоцинSigma85882
лимонной кислоты моногидрат SigmaC1909
дигидрат цитрата тринатрияSigmaW302600
глюкометрыRoche Accu-Check ActiveGC
электронное устройство фон ФреяIITC Life Science2390
горячая плитаIITC Life Science
Biopac MP36 система сбора данныхBiopac Systems, Inc.
Преобразователь HIFUSonic ConceptsH108
генератор функцийAgilent33250A
Усилитель мощностиЭлектроника и Инновация1040L
Rats Biolasco taiwanSprague-Dawley
Puralube vet мазьDechra
isoflurane vaporizerParkland ScientificV3000PS
IsofluranceAttane
Restraint bag (Decapicones)Braintree ScientificDC 200

Ссылки

  1. Abuaisha, B. B., Costanzi, J. B., Boulton, A. J. Acupuncture for the treatment of chronic painful peripheral diabetic neuropathy: A long-term study. Diabetes Res Clin Pract. 39 (2), 115-121 (1998).
  2. Hamza, M. A., et al. Percutaneous electrical nerve stimulation: A novel analgesic therapy for diabetic neuropathic pain. Diabetes Care. 23 (3), 365-370 (2000).
  3. Ballantine, H. T. Jr, Bell, E., Manlapaz, J. Progress and problems in the neurologic applications of focused ultrasound. J Neurosurg. 17, 858-876 (1960).
  4. Foley, J. L., Little, J. W., Vaezy, S. Image-guided high-intensity focused ultrasound for conduction block of peripheral nerves. Ann Biomed Eng. 35 (1), 109-119 (2007).
  5. Lee, Y. F., Lin, C. C., Cheng, J. S., Chen, G. S. High-intensity focused ultrasound attenuates neural responses of sciatic nerves isolated from normal or neuropathic rats. Ultrasound Med Biol. 41 (1), 132-142 (2015).
  6. Young, R. R., Henneman, E. Reversible block of nerve conduction by ultrasound. Arch Neurol. 4, 83-89 (1961).
  7. Lele, P. P. Effects of focused ultrasonic radiation on peripheral nerve, with observations on local heating. Exp Neurol. 8 (1), 47-83 (1963).
  8. Hong, C. Z. Reversible nerve conduction block in patients with poly- neuropathy after ultrasound thermotherapy at therapeutic dosage. Arch Phys Med Rehabil. 72 (2), 132-137 (1991).
  9. Okada, A., Morita, Y., Fukunishi, H., Takeichi, K., Murakami, T. Non-invasive magnetic resonance-guided focused ultrasound treatment of uterine fibroids in a large Japanese population: impact of the learning curve on patient outcome. Ultrasound Obstet Gynecol. 34 (5), 579-583 (2009).
  10. Huisman, M., et al. International consensus on use of focused ultrasound for painful bone metastases: current status and future directions. Int J Hyperthermia. 31 (3), 251-259 (2015).
  11. Dickinson, L., et al. Medium-term Outcomes after Whole-gland High-intensity Focused Ultrasound for the Treatment of Nonmetastatic Prostate Cancer from a Multicentre Registry Cohort. Eur Urol. 70 (4), 668-674 (2016).
  12. Foley, J. L., Little, J. W., Vaezy, S. Effects of high-intensity focused ultrasound on nerve conduction. Muscle Nerve. 37 (2), 241-250 (2008).
  13. Lee, Y. F., Lin, C. C., Cheng, J. S., Chen, G. S. Nerve conduction block in diabetic rats using high-intensity focused ultrasound for analgesic applications. Br J Anaesth. 114 (5), 840-846 (2015).
  14. Donoff, R. B. Nerve regeneration: basic and applied aspects. Crit Rev Oral Biol Med. 6 (1), 18-24 (1995).
  15. Fawcett, J. W., Keynes, R. J. Peripheral nerve regeneration. Annu Rev Neurosci. 13, 43-60 (1990).
  16. Nightingale, S. The neuropathic pain market. Nat Rev Drug Discov. 11 (2), 101-102 (2012).
  17. Lipton, R. B., et al. Single-pulse transcranial magnetic stimulation for acute treatment of migraine with aura: a randomised, double-blind, parallel-group, sham-controlled trial. Lancet Neurol. 9 (4), 373-380 (2010).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Высокоинтенсивный фокусированный ультразвукпериферический нерврегистрация электрофизиологических данныхдатчик HIFUинъекция стрептозотоцинаэлектронный эстезиометр фон Фреясложные мышечные потенциалы действияультразвуковой параметр
В модели диабетической крысы блока ультразвуковой инструмент для нервной проводимости
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.