Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Фенотипический анализ грызунов малярии паразита асексуальных и сексуальной крови этапов и комаров этапов

11.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/55688

⸱

30 мая 2019 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Beykoz Institute of Life Sciences and Biotechnology, Bezmialem Vakif University, Istanbul, Turkey, 2School of Public Health and Tropical Medicine, Department of Tropical Medicine, Tulane University

В этой статье

Краткое содержание

Из-за поразительного сходства жизненного цикла и биологии малярийных паразитов грызунов с малярийными паразитами для человека модели малярии, модели малярии грызунов стали незаменимыми для исследований малярии. В этой области мы стандартизировали некоторые из наиболее важных методов, используемых в фенотипическом анализе видов малярии дикого типа и трансгенного грызунов.

Аннотация

Недавние достижения в области генетики и технологий системной биологии способствовали нашему пониманию биологии малярийных паразитов на молекулярном уровне. Однако эффективные цели малярийного паразита для вакцинации и развития химиотерапии по-прежнему ограничены. Это в значительной степени связано с отсутствием соответствующих и практических моделей инфекции in vivo для человека Plasmodium видов, в первую очередь для P. falciparum и P. vivax. Таким образом, виды малярии грызунов широко используются в качестве практической альтернативы in vivo моделям вакцины против малярии, таргетинга лекарств, иммунного ответа и функциональных исследований характеристик сохраненных Plasmodiumspp. Действительно, модели малярии грызунов оказались бесценными, особенно для изучения биологии передачи комаров и печеночной стадии, и были незаменимы для иммунологических исследований. Однако существуют расхождения в методах, используемых для оценки фенотипов трансгенных и диких асексуальных и сексуальных паразитов на стадии крови. Примерами таких расхождений являются выбор внутривенной против интраперитонеальной инфекции грызунов с паразитами на стадии крови и оценка мужского гаметного раздражения. В этом материале мы подробно описываем стандартизированные экспериментальные методы оценки фенотипов асексуальных и половых стадий крови у трансгенных паразитов, выражающих характер репортера-гена или диких видов малярийных паразитов типа. Мы также подробно методы оценки фенотипов малярийных паразитов комаров этапов (гаметы, ookinetes, ооцисты, и sporozoites) внутри Anopheles комаров переносчиков. Эти методы подробно и упрощены здесь для смертоносных и нелетальных штаммов P. berghei и P. yoelii, но также могут быть применены с некоторыми корректировками на P. chabaudi и P. vinckei грызунов видов малярии.

Введение

Малярийные паразиты вызывают сотни миллионов случаев инфицирования малярией среди людей вовсем мире, при этом ежегодно происходит более 600 000 случаев смерти. Инфекции человека вызваны пятью видами малярийных паразитов, а именно: P. falciparum, P. vivax, P. ovale, P. malariaeи P. knowlesi. Большинство клинических случаев смерти от малярии вызваны P. falciparum в странах Африки к югу от Сахары1. Другой вид паразитов малярии человека, который вызывает обширные заболевания во всем мире за пределами Африки к югу от Сахары является P. vivax2. Остальные три вида все более географически ограничены и вызывают доброкачественные инфекции малярии, за исключением смертельных P. knowlesi3. Отсутствие соответствующих и практических нечеловеческих моделей инфекций всегда было и остается препятствием для разработки вакцины против малярии и разработки лекарственных средств. Ранее малярийных наркотиков ориентации и метаболических исследований широко опирались на модели птичьей малярии, как P. gallinaceum и P. lophurae, заражая кур и уток, соответственно4. После этого виды малярии грызунов постепенно внедрялись в различные вакцины и исследования по таргетированию лекарственных средств в качестве моделей in vivo. На протяжении многих лет, доказательства сходства биологии и принимающей паразитов взаимодействия жизненного цикла этапов моделей малярии грызунов с человеческими видами малярии накопились.

В частности, модели малярии грызунов были чрезвычайно важны для изучения и характеристики биологии комаров и доэритроцитных стадий5. Тем не менее, Есть четыре вида малярии грызунов(P. berghei, P. yoelii, P. chabaudi, и P. vinckei), которые имеют различные биологические особенности, наиболее заметные из которых находятся в стадии крови6. Виды малярии грызунов отличаются синхронностью стадий крови, где стадии крови штаммов P. chabaudi и P. vinckei в основном синхронны, в то время как стадии крови P. berghei и P. yoelii не6 , 7. Еще одним заметным отличием является самоочистка стадий крови, которая происходит в некоторых штаммов (например, P. yoelii 17X-NL, P. berghei NK65, и P. vinckei lentum), в то время как инфекция крови других штаммы одного и того же вида могут быть смертельными, если не лечить(P. yoelii 17X-L, P. berghei ANKA, и P. chabaudi AS). Кроме того, P. yoelii 17X-NL штамм и P. berghei ANKA штамм преимущественно вторгнуться ретикулоцитов8,9,10,11, хотя эти особенности П. yoelii и P. berghei штаммы не являются строгим требованием роста12,13,14. Таким образом, мышей лечат фенилгидразином до заражения с стадиями крови этих паразитов для увеличения паразитмии и гаметоцитемии, необходимой для инфекции комаров для штамма P. berghei ANKA и для P. yoelii 17X-NL15,16,17,18,19.

Различия в развитии комаров этапов также существуют среди различных видов малярии грызунов, наиболее заметными являются температура и время, необходимое для оптимального развития комаров этапов и sporozoite длина5,6, 20. В доэрроцитических стадиях видов малярии грызунов, различия включают грызунов видов и штаммов, которые наиболее восприимчивы к инфекционным прививка сопорозоита, количество sporozoites, необходимых для прививки в восприимчивый штамм грызунов, типы клеток млекопитающих, необходимые для анализа стадии развития печени in vitro, и время для завершения развития стадии печени5,21,22,23,24,25 ,26,27,28,29,30.

Несмотря на эти изменчивости, грызуны малярии паразитов были благоприятными моделями на раннем этапе для применения обратных генетических подходов, потому что они были менее времени и ресурсоемких с высокой вероятностью успеха31. В самом деле, модели малярии грызунов были лучшими моделями, и во многих случаях только модели, доступные в течение многих лет, чтобы функционально охарактеризовать гены, выраженные в комаров и печени этапов.

В свете популярности и удобства обратных генетических подходов в моделях малярии грызунов, для анализа фенотипов трансгенного цикла жизни паразитов, особенно стадий крови, был использован ряд различных методологий. Однако некоторые из этих методологий несовместимы; например, сравнение инфекций паразитов на стадии крови после инъекции ИС (которые, возможно, осушаются в перитонеальные лимфатические узлы и, оттуда, могут попасть в кровоток; следовательно, инъекционные паразиты не попадают в равной степени в кровоток) , сравнение передачи комаров клонов с различным числом серийных передач крови стадии или G номер (который может повлиять на gametocytogenesis32,33), или сравнение трансгенных паразитов непосредственно наивный дикий тип (WT) паразитов, которые никогда не подвергались электропорации и положительного отбора наркотиков и различных нестандартизированных оценок мужского гамета exflagellation. Поэтому крайне важно стандартизировать протоколы, которые просто следовать для фенотипического анализа любого типа трансгенных или WT грызунов малярии паразитов в крови и в комаров для размещения для биологической изменчивости грызунов малярии видов паразитов.

При этом мы сообщаем о стандартизированном, детальном экспериментальном протоколе для фенотипического анализа стадий жизненного цикла крови и комаров трансгенных или диких паразитов P. yoelii и P. berghei. Эти протоколы также применимы к паразитам P. chabaudi и P. vinckei.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все описанные здесь эксперименты на животных проводились в соответствии с утвержденными протоколами Институционального комитета по уходу и использованию животных (IACUC) Тулейнского университета и комитета по этике животных Университета Безмиалем аклиф. Все остальные экспериментальные протоколы и использование рекомбинантной ДНК проводились в соответствии с утвержденными протоколами Институционального комитета по биобезопасности (IBC) Тулейнского университета.

1. Инфекция мышей с кровяными паразитами для анализа паразитии и анализов инфекции комаров

  1. День -3: факультативная инъекция фенилгидразина в мышей-реципиентов
    1. Инъекционные выведенные мыши-реципиенты SW или CD1 (мыши, которые будут использоваться для инфекции комаров и анализов инфекции комаров) интраперитонеально (IP) с 100 зл иглы (50 мг фенилгидразина в 5 мл 1x фосфат-буферный солей (PBS)) с использованием 26 G иглы Шприц.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для надежных комаров инфекций P. berghei и P. yoelii, фенилгидразин используется для индуцирования ретикулоцитоз у мышей-реципиентов, что увеличивает паразитмии и, впоследствии, процент гаметоцитов, и значительно увеличивает exflagellation мужчин гаметы(Рисунок 5), что приведет к лучшей инфекции комаров этапов инфекции как Для P. berghei и P. yoelii штаммов15,16,17, 18.
  2. День -2: инъекция замороженных запасов паразитов в донорских мышей
    1. Быстро оттаивать криоконсервированные замороженные запасы и немедленно вводить каждую донорскую мышь (обычно две мыши на генотип) IP с 200 евро акций с помощью шприца 26 G иглы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не более пяти мышей размещаются на клетку в контролируемых условиях виварии.
    2. Начните проверять паразитмию под 100x целью микроскопа на Giemsa-окрашенных тонкий мазок крови после 24 h послеинфекции. Следуйте разделу 2.1 протокола для giemsa окрашенных тонких мазков крови.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за невозможности точно подсчитать выжившие жизнеспособные стадии крови после быстрого оттаивания и инъекций криоконсервированной инфицированной крови, мыши-доноры получают криоконсервированную кровь в первую очередь. Зараженные эритроциты донорской мыши можно точно количественно и использовать впоследствии.
  3. День 0: кровотечение мышей-доноров
    1. Кровотечение мышей-доноров (см. раздел 3.1), когда их паразитмия составляет от 0,1% до 1%, что обычно получается через 2-3 дня после замороженного запаса инфекции в случае штаммов P. yoelii 17X-NL и P. berghei ANKA.
    2. Используйте прокол лицевой вены (чтобы получить от 200 до 500 л), или неизлечимо кровоточить животных на прокол сердца (чтобы получить между 600 мл и 1,2 мл) инфицированной крови. Неизлечимо кровоточить мышей на прокол сердца, как описано подробно в разделе 3.1.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Кровотечение в венах для лица не является обычным методом получения крови, так как его гораздо труднее применять и очень тяжело для мышей, по сравнению с терминальным кровотечением. Оптимальная паразитмия для кровотечения донорских мышей составляет от 0,1%-1%, потому что, в этом диапазоне паразитии, Есть очень мало гаметоцитов (которые не могут воспроизвести для производства асексуальных стадий крови) и Есть менее двойной или тройной инфицированных эритроцитов (которые делает количественную оценку менее точной).
  4. День 0: количественная оценка инфицированной крови для подготовки доз инфицированных эритроцитов путем серийного разбавления
    1. Подготовка серийных разбавлений донорской крови путем добавления 100 л крови в микроцентрифугую трубку (пробащенная трубка 1). Добавьте 900 кЛ RPMI средних до трубки 1 и хорошо перемешать, трубя вверх и вниз с той же кончик пипетки, создавая 1:10 разбавления.
    2. Возьмите 100 л разбавленной крови из трубки 1 и добавьте ее в новую микроцентрифуговую трубку (пробащенная трубка 2). Добавьте 900 кЛ RPMI среднего к трубе 2 и хорошо перемешать, трубя вверх и вниз с той же кончик пипетки, создавая 1:100 разбавления.
    3. Повторите шаги 1.4.1 и 1.4.2, чтобы сделать еще два серийных разбавления, создавая 1:1,000 (проражаемый трубка 3) и 1:10 000 разбавлений (разбавляемый трубка 4).
    4. Добавьте 12 л разбавленной крови из трубки 3 и 12 л разбавленной крови из трубки 4 в разные стороны гемоцитометра и определите среднее количество эритроцитов с каждой стороны гемоцитометра. Умножьте эти числа на 10. Умножьте эти цифры на коэффициент разбавления, 1000 или 10000, соответственно, чтобы определить количество эритроцитов в 1 Зл каждого разбавления.
    5. Разделите желаемое количество инфицированных эритроцитов, которые необходимо вводить по количеству эритроцитов в 1 зл и 1 л каждого разбавления, чтобы определить объем разбавленной донорской крови, необходимый для инъекции. Выберите разбавление с наиболее подходящим объемом для инъекций, добавьте громкость в новую микроцентрифуговую трубку и завершите его до 120 кЛ с помощью RPMI-среды.
  5. День 0: внутривенная инъекция мышей-реципиентов
    1. Поместите мышей-получателя под тепловую красную лампу, чтобы разрять их вены для инъекций. Загрузите дозы паразита в 27 G инсулина шприц и поместите получателя мыши в удерживатель.
    2. Введите 1 миллион или 10000 инфицированных эритроцитов внутривенно (IV) с использованием 27 G инсулина шприц в каждой мыши реципиента для анализа инфекции комаров или для бесполых и сексуальных анализов крови стадии роста, соответственно. Продолжайте поддерживать мышей в стандартных жилищных условиях.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Инъекция IP является косвенным методом введения паразитов в кровоток, как паразитированные эритроциты должны пройти через осушение лимфатических узлов перитонеальной полости, чтобы достичь крови. Это делает инъекцию IP косвенным маршрутом доставки для впрыскивания точного количества паразитов в кровоток. Таким образом, IV маршрут является предпочтительным, так как он обеспечивает точные дозы паразитов непосредственно в кровоток, как показано на рисунке 3 и описано в представитель результаты.

2. Определение кроваво-этапной паразитной нагрузки для сексуальных и асексуальных стадий

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе перечислены стандартизированные фенотипические методы оценки стадий крови малярийных паразитов. Эти методы полезны при оценке новых противомалярийных или вакцинных кандидатов или даже генного нокаута на половых и бесполых стадиях развития у одних и тех же экспериментальных мышей. Следует отметить, P. chabaudi и P. vinckei также очень рациональные и важные альтернативные варианты для этих типов анализов, особенно в скрининге наркотиков.

  1. Определение паразитмии асексуальных стадий и мужчин против женщин гаметоцитов giemsa окрашенных тонких мазков крови для анализа роста паразитов
    1. Используя 26 G или 27-G иглы, колоть хвост мыши и собирать капли крови на микроскоп слайд. Используйте короткий край другого слайда микроскопа, чтобы быстро размазать кровь по всему слайду.
    2. Закрепите горку 100% метанолом не менее 1 мин, только после того, как кровь полностью высохнет на горке. Пятно в 10% Giemsa в течение 10-15 мин. Вымойте горку с одно- или двойной дистиллированной воды и дайте ему высохнуть.
    3. Прочитайте слайд, используя 100-x цель и погружение масла под легким микроскопом. Для точного измерения паразитмии, проверьте в общей сложности 6000 эритроцитов, которые могут быть получены путем подсчета по крайней мере 30 или 40 микроскопических сеток со средним числом 200 или 150 эритроцитов (RBCs) на сетку, соответственно. Подсчитайте общее количество РБК в первой и последней сетках, чтобы определить среднее количество красных кровяных телец для всех сеток.
    4. Подсчитайте общее количество инфицированных эритроцитов на сетку. Мужчины и женщины gametocytes могут быть подсчитаны отдельно, чтобы определить gametocytemia, но также должны быть включены в общий подсчет паразитарных.
    5. Определить общий процент тунеядства путем деления общего числа паразитизированных эритроцитов на общее количество наблюдаемых РБК. Умножьте это число на 100, чтобы определить процент тунеядцев.
    6. Определите gametocytemia путем деления общего количества гаметоцитов, подсчитанных по общему количеству наблюдаемых РБК. Умножьте это число на 100, чтобы определить процент гаметоцитемии на мышь.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Единственным надежным методом дифференциации между различными асексуальными и сексуальными стадиями крови является использование микроскопа для оценки окрашенных гимсой тонких мазков крови, так как каждая из стадий имеет различную морфологию, за исключением незрелых гамгетито, которые в основном неотличимы от асексуальных стадий крови.
  2. Определение паразитмии стадии крови путем цитометрии потока для флуоресцентного репортера белка-выражения WT-подобных штаммов паразитов
    1. Этикетка две микроцентрифуги трубки для каждого образца мыши, обозначая одну трубку для 1:1,000 разбавления, а другой для 1:2,000 разбавления. Добавьте 1,5 л 1x гепарина в трубку 1:1,000 разбавления.
    2. Используя 26 G или 27 G иглы, колоть хвост мыши и передать 1,5 л крови в трубку, содержащую 1,5 зл 1x гепарина (1:1,000 разбавления трубки). Смешайте кровь и 1x гепарин осторожно вместе, пайпеты вверх и вниз.
    3. Добавьте 1,497 Л rpMI среды к микроцентрифуге трубки, и осторожно пипетка вверх и вниз, чтобы хорошо перемешать.
    4. Перенесите 500 л смеси из 1:1,000 разбавленной трубки в 1:2,000 разбавления трубки. Добавьте 500 кЛ среды RPMI к трубке 1:2,000 и аккуратно перемешайте, прокладывая вверх и вниз.
    5. Следуйте соответствующему протоколу запуска производителя для цитометра потока. Запустите образцы с медленным истоем частоты потока и установите обнаружение по крайней мере 20 000 событий.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Существует альтернативный практический анализ для измерения паразитмии с помощью трехцветной сортировки FACS, независимо от того, паразиты выражают флуоресцентные маркеры или нет34. Тем не менее, анализ, описанный здесь предлагает точную меру паразитии в живых паразитов без добавления каких-либо ДНК-обязательных красителей и использования Сортировки FACS.
  3. Определение частоты отчуждения мужских гамет на микролитр зараженной крови мыши
    1. Подготовьте 1:10 микроцентрифуговой трубки с 40 зл и неполной средой ookinete (RPMI и бикарбонат натрия, гипоксантин и ксантуреновая кислота) и 5 ЗЛ 1x гепарина.
    2. Используя 26 G или 27 G иглы, колоть хвост мыши и передачи 5 qL крови (с помощью микропипетта) быстро трубки, содержащей неполные ookinete средств массовой информации и гепарина. Смешайте осторожно и загрузите 12 qL из 1:10 крови разбавления трубки на гемоцитометр и оставить его при комнатной температуре (20-24 градусов по Цельсию).
    3. Начните считать события отчуждения 9-10 мин после подготовки 1:10 разбавления. Используйте фазовый контрастный световой микроскоп с 40-x увеличением.
    4. Умножьте среднее количество событий exflagellation, подсчитанных на 10, а затем умножайте на коэффициент разбавления (10), чтобы определить среднее количество exflagellation на микролитр инфицированной крови.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот анализ измеряет количество мужских событий, заявляющих об источении гамет в объеме крови в 1 л, который можно количественно очислить с помощью гемоцитометра. Неполный ookinete средний18 смешивается с кровью, чтобы тесно имитировать условия, в которых exflagellation происходит внутри маминого комара вскоре после еды крови.

3. Изоляция и обработка паразитов на стадии крови от инфицированных эритроцитов и замороженных запасов

  1. Терминал кровотечения инфицированных грызунов путем прокола сердца
    1. Подготовьте шприц с иглой 26 G, содержащий примерно 20 евро 1x гепарина (200 единиц/мл) для сбора крови донорской мыши путем прокола сердца.
    2. Используйте медленный поток CO 2, чтобы усылать мышь перед кровотечением. Кроме того, анестезируют мышь изофлюраном (который должен поддерживаться до и во время разреза кожи, чтобы разоблачить сердце).
    3. Положите мышь на спину и прикрепите ее придатки. Сделайте небольшой разрез в коже у основания грудины, потянув вверх кожу с щипками и резки его ножницами. Потяните кожу друг от друга в месте разреза, чтобы разоблачить диафрагму и верхнюю часть брюшной полости.
    4. Держите основание грудной клетки с щипками и прорезать диафрагму, чтобы войти в грудную полость; будьте осторожны, чтобы не повредить сердце или легкие. Прикрепите грудную клетку, чтобы разоблачить сердце.
    5. Аккуратно проколите сердце и медленно подтяните на шприц поршень, чтобы собрать 1 мл крови и перенести его в микроцентрифугую трубку.
  2. Приготовление замороженных запасов из зараженной крови
    1. Кровотечение мышей (см. раздел 3.1) с паразитами крови, которые находятся между 2% и 5%, со значительным количеством кольцевых этапов и не так много гаметоцитов.
    2. Смешайте желаемую часть крови с замораживанием раствора (10% глицерола в растворе Alsever) в соотношении 1:2 и храните в криогенных флаконах. Заморозить в жидком азоте.
  3. Изоляция и очистка паразитов на стадии крови для извлечения ДНК, РНК и белков
    1. Кровотечение мышей (см. раздел 3.1) с паразитами крови, которые выше 0,5%.
    2. Подготовьте шприц 10 мл, сняв поршень и вставив небольшой ватный тампон. Упакуйте хлопок на дно шприца. Заполните его целлюлозой до тех пор, пока уровень целлюлозы не достигнет отметки 3 мл, но не превысит отметку 4 мл на шприце.
    3. Закрепите шприц в клип на кольцевой подставке и поместите трубку для сбора отходов под ним. Добавьте 5 мл PBS в шприц и дайте ему пропуститься в мусорную трубку.
    4. При необходимости приготовьте замороженные запасы, используя только 100-300 л крови. Добавьте остальную часть инфицированной крови (400-700 л) к столбце. Сбор потока через с отходами трубки, пока капли начинают краснеть. Как только капли начинают покраснеть, поместите новую 14-мл трубку сбора под шприц, чтобы собрать поток через.
    5. Как только поток начинает замедляться, добавьте PBS в шприц и соберите поток через трубку 15 мл до тех пор, пока не будет достигнут общий объем 14 мл. Соберите оставшийся поток через с отходами трубки.
    6. Centrifuge 14 мл трубки с кровью / PBS смеси в течение 8 мин при 250 х г без тормозов. Удалить супернатант и добавить 14 мл охлажденный сапонин (50 мг сапонина в 50 мл PBS). Чтобы выбить гранулы, инвертировать трубку несколько раз и вихрь, если это необходимо.
    7. Центрифуги трубки в течение 8 мин на 1217 х г без тормозов. Удалите супернатант, оставив около 0,5 мл раствора над гранулами.
    8. Приостановите гранулы в растворе с помощью микропипетта и перенесите его в микроцентрифугную трубку. Добавьте 500 л PBS в трубку 14 мл, чтобы вымыть остаточные паразиты, которые остаются в трубке. Добавьте это к той же микроцентрифуге трубки.
    9. Центрифуга трубки в течение 2 мин на 6010 х г. Удалите супернатант и повторно 1 мл PBS. Центрифуга в течение 2 мин при 9,391 х г.
    10. Приступить к извлечению геномной ДНК, общей РНК, и белка.
      1. Для экстракции геномнойДНК, удалить супернатант и resuspend гранулы в 200 Зл Л PBS, а затем следовать любой подходящий протокол извлечения гДНК.
      2. Для полной добычи РНК,удалить супернатант, resuspend и вихрь гранулы в 1 мл любого фенола- и гуанидина изотиоцианат основе решения или любого другого подходящего реагента, а затем следовать любой подходящий протокол общего извлечения РНК.
      3. Для полной экстракциибелка, удалить супернатант, resuspend гранулы в соответствующем объеме 6x натрия dodecyl сульфат (SDS)-загрузка красителя или любого другого подходящего реагента, а затем следовать любой подходящий протокол общей обработки белка.

4. Анализы инфекции комаров

ПРИМЕЧАНИЕ: Комар является основным хозяином малярийных паразитов, где происходит половое размножение. Инфекция мышей для передачи малярийных паразитов комарам проводится путем инъекции IV не менее 1 миллиона стадий крови, а затем кормления инфицированной мыши (от каждого генотипа, который отображает самый высокий уровень мужской гаметы exflagellation) Anopheles комаров в клетке на 3 день после мыши-инфекции. Инъекция IV с 1 миллионом паразитов на стадии крови у обработанных фенилгидразином мышей обеспечит развитие мужского и женского гаметоцитов более быстрыми темпами. Комары, инфицированные P. yoelii и P. berghei инкубируются при 24 градусах и 20-21 градусах Цельсия, соответственно, для обеспечения наилучших возможных стадий развития комаров6.

  1. Кормление комаров и определение количества ookinetes на комаров
    1. Голодать взрослых самки Anopheles stephensi или A. gambiae комаров (4-7 дней) для 8-12 ч до кормления. Разрешить взрослым комарам питаться в течение не менее 15 мин инфицированных анестезируемых мышей (вводят соответствующую дозу кетамина/ксилазина) с самой высокой частотой exflagellation (измеряется в разделе 2.3).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Кетамин/ксилазин рабочий раствор готовится путем разбавления стокового раствора в сольнике и IP-инъекциях 100 л на мышь. Для бульонного раствора объемом 10 мл к 9 мл/мл добавляется 1 мл ксилезаина (100 мг/мл).
    2. Удалить некормленных самок комаров и самцов комаров с аспиратором рот.
    3. На 18-20 h postfeeding, собрать 20-30 комаров и поместить их в морозильную камеру не менее 10 минут, чтобы обеспечить смерть. Используя бинокулярный рассечение сферы, вскрыть 20-30 заполненных кровью мидгутов с двумя 26 G или 27 G иглы или иглы и щипцы в RPMI или PBS вскрытия среды и передать midguts микроцентрифуг трубки, содержащие 200 зл. RPMI или PBS (Для метода разборки пожалуйста, смотрите раздел 4.3).
    4. Центрифуга сбора трубки в течение 1 мин на 700 х г. Измельчить гранулы midguts с помощью пестика. Повторите этот шаг.
    5. Передача 50 зл от трубки молотых мидгутов в новую микроцентрифуговую трубку. Добавьте 200 л RPMI или PBS для создания 1:5 разбавления.
    6. Перенесите 12 л на гемоцитометр и инкубировать его при комнатной температуре в течение 5 минут, чтобы содержимое оседали.
    7. Определите среднее количество ookinetes с помощью светового микроскопа с фазовой контрастносткой и 40-x увеличением.
    8. Умножьте среднее количество зрелых ookinetes на 10, а затем на коэффициент разбавления 5, чтобы определить среднее общее количество ookinetes.
    9. Разделите среднее количество ookinetes на количество вскрытых в крови комаров, чтобы определить количество ookinetes на комаров, питаемых кровью.
  2. Определение количества ранних яйцеклеток для флуоресцентных репортер белка-выражения WT-подобных штаммов паразитов
    ПРИМЕЧАНИЕ: Целью этого ассеа является определение количества живых паразитов, выражающих зеленый флуоресцентный белок (GFP), которые установили полную инфекцию москитных мидгутов и сформировали ранние сферические ооцисты. Этот обзор определяет, если ookinetes (их развитие оценивается в предыдущем обзоре) завершили свои функции по обходу через комаров мидгут эпителиальных клеток и преобразования в начале ооцизтов на базальной стороне ламина midgut эпителия или нет. Это еще один анализ, который делает большое использование паразитов, выражающих GFP, как подсчет ранних яйцеклеток на данном этапе будет почти невозможно без утомительного иммуносохранения.
    1. Вскрыть мидгуты (см. раздел 4.1) 20-30 кровопролитных комаров, в день 3 или 4 пост-комаров кормления (pmf) для P. yoelii 17X-NL, и в день 6 или 7 pmf для P. berghei ANKA, с двумя 26 G или 27 G иглы или иглы и force RPPS в edium (Для метода вскрытия, пожалуйста, см. раздел 4.3).
    2. Распространение 40-50 л вскрытия среды на горизонтальной средней линии более длинного края стеклянной горки. Передача midguts к этой линии, по одному, во время вскрытия, и добавить больше средних для midguts, если это необходимо, чтобы избежать высыхания.
    3. Поместите крышку осторожно на расчлененных midguts, и запечатать его с лаком для ногтей.
    4. Используя 10x или 20x цель флуоресцентного микроскопа с зеленым флуоресценционным фильтром, подсчитайте количество ранних ооцизтов на каждом мидгуте, по крайней мере, в 20 мидгутах.
  3. Определение количества сопозоитов яйцеклеток на комаров
    1. Рассекать мидгуты по крайней мере 20-30 комаров с двумя 26-G или 27-G иглы или иглы и щипцы в RPMI или PBS вскрытия среды и собирать вскрытых мидгутов в 200 зл RPMI.
    2. Держите нижней части живота сегменты твердо на месте с одной иглой (или щипцы) и слегка нажмите грудной клетки в направлении вверх с другой иглой на стыке между грудной клетки и живота. Делайте тщательно короткие толчки, пока грудная клетка отделяется от живота. Как только разделение начинается белый midgut появится растягивается, а затем midgut будет вырезать из пищевода конца с помощью той же иглы, которая была использована для разделения грудной клетки. Если все еще прикреплены к животу, та же игла может быть использована, чтобы вытащить midgut от живота. Перенесите мидгуты всех комаров в трубку сбора, собирая их из среды с помощью иглы, по одному.
    3. Centrifuge трубки сбора в течение 1 мин на 700x г, чтобы поселить midguts на дно трубки сбора и измельчить их с пестиком. Повторите этот шаг.
    4. Перенесите 12 л на гемоцитометр и инкубировать его при комнатной температуре в течение 5 минут, чтобы его содержимое оседали.
    5. Подсчитайте яйцеклетки спорозоиты, используя 40X цель светового микроскопа. Используйте 1:5 и/или 1:10 разбавления, если комары предотвращают точное подсчет спорозоитов или если количество спорозоитов слишком высоко, чтобы точно подсчитать.
    6. Рассчитайте среднее общее количество сопозоитов яйцеклетки, умножая среднее количество спорозоитов на 10, а затем умножая это число на коэффициент разбавления, если таковые имеется, и на общий объем (200 л).
    7. Разделите среднее общее количество спорозоитов на количество комаров, расчлененных для расчета среднего количества социзоитов на одного комара.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Распространенной ошибкой для измерения успеха или продуктивности комаров стадии инфекции является подсчет числа яйцеклеток на более поздних стадиях развития яйцеклетки. Это связано с некоторыми ооцизтами время vacuolated на более поздние точки времени развития яйцеклетки, а другие не в состоянии развиваться sporozoites, даже на том же midgut. Лучшим и самым надежным методом определения продуктивности инфекции комаров является подсчет среднего количества споцисты хиджтовых сопозоитов в дни 10-12 посткомаровдляной инфекции для P. yoelii и в дни 12-14 пост-инфекция комаров для P. berghei.
  4. Определение количества спорозоитов слюнных желез на одного комара
    Примечание:Окончательная оценка полного завершения развития комаров этапов достигается путем оценки числа sporozoites, которые вторглись слюнной железы, которые являются трансмиссивной и инфекционных этапов позвоночных. Вторжение слюнной железы устанавливается после завершения развития ооцизоита, выход в гемолимф, привязанность к базальной ламиной клеток ацинаров слюнной железы, и обход ацинарных клеток для достижения слюнных желез Воздуховодов5. Таким образом, этот ассс также оценка успеха всех этих процессов или нет. Тем не менее, оценка гемолимфных спорозоитов чисел позволит дифференциации между дефектами в выходе из яйцей к яйцетам и дефектами при вторжении слюнных желез35 лет. Очистка спорозоитов слюнных желез позволяет проводить несколько функциональных анализов на мотоильность спорозоита и фенотипы вторжения. Спорозоиты слюнной железы также могут быть использованы для инфекции in vivo мышей и в исследованиях иммунизации36,37. Кроме того, наиболее воспроизводимых этапов, доступных для создания интро печени стадии вторжения или развития анализа является использование слюнных желез sporozoites.
    1. Вскрыть слюнные железы 50-100 самок комаров, в дни 14-16 pmf для P. yoelii и в дни 17-20 pmf для P. berghei, предпочтительно с двумя 26 G или 27 G иглы, в RPMI или DMEM среды хранится на льду и дополнен5% плода крупной сыворотки (FBS) или/бычья сыворотка альбумина (BSA) для P. yoelii sporozoites или 3% FBS/BSA для P. berghei sporozoites. Если спорозоиты должны быть использованы в гепатоме in vitro анализы, добавить 1% пенициллина / стрептомицина в рассечение среды. Есть, как правило, два метода для вскрытия слюнных желез. Первый метод занимает много времени, но приводит к вскрытию слюнных желез с очень небольшим или вообще без загрязняющих тканей. Второй метод занимает меньше времени, но приводит к сбору значительного количества загрязняющих тканей. Первый метод подробно описан здесь.
    2. Держите верхние сегменты живота на месте с сбитой стороной одной иглы и осторожно нажимайте голову очень легко (очень короткими толчками) на стыке головы и грудной клетки в восходящем направлении, пока голова не будет тщательно отделена от грудной клетки без разрывая стеклянные слюнные железы, открытые слюнные железы затем отделяются от головы той же иглой, которая толкнула голову вверх.
    3. Расчлененные слюнные железы будут подняты из вскрытия среды с помощью короткого стекла Пастер пипетка.
    4. Когда все слюнные железы были расчленены и собраны, талант поместит трубку, содержащую мидгуты, в центрифугу (1мин, 700 х г).
    5. Подсчитайте споросойты с помощью гемоцитометра под легким микроскопом, установленным на контрасте фазы 2 и 40-кратное увеличение. Если количество комаров расчленено 40 евро, разбавьте слюнные железы до 1:5 или 1:10, в зависимости от ожидаемой урожайности инфекционности (определяется в предыдущих анализах).
    6. Умножьте среднее количество спорозоитов на 10 и коэффициент разбавления (если таковые имеется). Умножьте на общий объем, чтобы определить среднее количество сорозоитов слюнной железы. Разделите на количество расчлененных самок комаров, чтобы определить средний слюнных желез sporozoites на комаров.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Проблема с вскрытием слюнных желез заключается в их небольшом размере и стеклянном прозрачном внешнем виде. Таким образом, очень трудно изолировать слюнные железы и, следовательно, они, как правило, расчленяются как единовременная сумма с другими тканями из лобной части грудной клетки, что также важно для защиты слюнных желез от разрыва во время сбора.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Успех применения обратных генетических инструментов и методов для малярии паразитов произвел революцию в области исследований малярии, с возможностью добавить, удалить или изменить конкретные геномные сегменты нескольких видов Plasmodium 39. Важно отметить, что незаменимые геномные локусы были выявлены и успешно использованы для внедрения флуоресценции маркеров белка у грызунов и паразитов малярии человека путем двойной гомологичной рекомбинации, чтобы обе...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Несмотря на сходство в общей биологии их жизненных циклов с моделями малярии человека, модели малярии мыши также имеют много разнородности к видам плазмодия человека, которые ограничили бы их использование в качестве надежных моделей in vivo. Например, за исключением живых паразитов в качестве вакцин, все исследования вакцин с субунитом и ДНК и другими вакцинами дали отличные результаты в модели мыши, но у людей, живущих в эндемичных районах, результаты были далеко не удовлетворительными.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Ахмед Али поддерживается финансированием Университета Безмиалема Вакифа из гранта Министерства развития Турции 2015BSV036, а также финансированием, предоставленным Школой общественного здравоохранения и тропической медицины Тулейнского университета, а также финансированием NIH-NIAID для R21Grant 1R21AI111058-01A1.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
ГепаринSigma375095-100KU
Ксантуреновая кислотаSigmaD120804-5G
ГипоксантинSigmaH9377-25G
раствор АльсевераSigmaA3551-500ML
Бикарбонат натрияSigmaS5761-500G
ФенилгидразинSigmaP26252-5G
ГлицеринSigmaG5516-500ML
GiemsaSigmaGS1L-1L
26 г x 3/8 Прецизионная игла для скольжения, Becton Dickinson305110
1 мл шприца TB, 26 г x 3/8Becton Dickinson309625
1 мл инсулинового шприца, U-100 27 гBecton Dickinson329412
изофлурана, USBPiramal2667- 46- 7
PBS, pH 7,4Gibco10010049
RPMIGibco22400105
DMEMGibco11995065
Карандашлин/СтрептомицинGibco10378016
фетальной сывороткой крупного рогатого скотаGibco10082147
стекловатойCorning3950

Ссылки

  1. Who/Unicef Report. Malaria Mdg Target Achieved Amid Sharp Drop in Cases and Mortality, but 3 Billion People Remain at Risk. Neurosciences (Riyadh). 21, 87-88 (2016).
  2. Naing, C., Whittaker, M. A., Nyunt Wai, V., Mak, W. J. Is Plasmodium vivax malaria a severe malaria?: a systematic review and meta-analysis. PLoS Neglected Tropical Diseases. 8, e3071(2014).
  3. Millar, S. B., Cox-Singh, J. Human infections with Plasmodium knowlesi--zoonotic malaria. Clinical Microbiology and Infection: The Official Publication of the European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. 21, 640-648 (2015).
  4. Spry, C., Kirk, K., Saliba, K. J. Coenzyme A biosynthesis: an antimicrobial drug target. FEMS Microbiology Reviews. 32, 56-106 (2008).
  5. Aly, A. S., Vaughan, A. M., Kappe, S. H. Malaria parasite development in the mosquito and infection of the mammalian host. Annual Review of Microbiology. 63, 195-221 (2009).
  6. Stephens, R., Culleton, R. L., Lamb, T. J. The contribution of Plasmodium chabaudi to our understanding of malaria. Trends in Parasitology. 28, 73-82 (2012).
  7. Bagnaresi, P., et al. Unlike the synchronous Plasmodium falciparum and P. chabaudi infection, the P. berghei and P. yoelii asynchronous infections are not affected by melatonin. International Journal of General Medicine. 2, 47-55 (2009).
  8. Cromer, D., Evans, K. J., Schofield, L., Davenport, M. P. Preferential invasion of reticulocytes during late-stage Plasmodium berghei infection accounts for reduced circulating reticulocyte levels. International Journal for Parasitology. 36, 1389-1397 (2006).
  9. Jayawardena, A. N., Mogil, R., Murphy, D. B., Burger, D., Gershon, R. K. Enhanced expression of H-2K and H-2D antigens on reticulocytes infected with Plasmodium yoelii. Nature. 302, 623-626 (1983).
  10. Okada, H., et al. A transient resistance to blood-stage malaria in interferon-gamma-deficient mice through impaired production of the host cells preferred by malaria parasites. Frontiers in Microbiology. 6, 600(2015).
  11. Walliker, D., Sanderson, A., Yoeli, M., Hargreaves, B. J. A genetic investigation of virulence in a rodent malaria parasite. Parasitology. 72, 183-194 (1976).
  12. Deharo, E., Coquelin, F., Chabaud, A. G., Landau, I. The erythrocytic schizogony of two synchronized strains of plasmodium berghei, NK65 and ANKA, in normocytes and reticulocytes. Parasitology Research. 82, 178-182 (1996).
  13. Fahey, J. R., Spitalny, G. L. Virulent and nonvirulent forms of Plasmodium yoelii are not restricted to growth within a single erythrocyte type. Infection and Immunity. 44, 151-156 (1984).
  14. Srivastava, A., et al. Host reticulocytes provide metabolic reservoirs that can be exploited by malaria parasites. PLoS Pathogens. 11, e1004882(2015).
  15. Hart, R. J., et al. Genetic Characterization of Plasmodium Putative Pantothenate Kinase Genes Reveals Their Essential Role in Malaria Parasite Transmission to the Mosquito. Scientific Reports. 6, 33518(2016).
  16. Hart, R. J., Ghaffar, A., Abdalal, S., Perrin, B., Aly, A. S. Plasmodium AdoMetDC/ODC bifunctional enzyme is essential for male sexual stage development and mosquito transmission. Biology Open. 5, 1022-1029 (2016).
  17. Hart, R. J., Lawres, L., Fritzen, E., Ben Mamoun, C., Aly, A. S. Plasmodium yoelii vitamin B5 pantothenate transporter candidate is essential for parasite transmission to the mosquito. Scientific Reports. 4, 5665(2014).
  18. Ramakrishnan, C., et al. Laboratory maintenance of rodent malaria parasites. Methods in Molecular Biology. 923, 51-72 (2013).
  19. Hart, R. J., Abraham, A., Aly, A. S. I. Genetic Characterization of Coenzyme A Biosynthesis Reveals Essential Distinctive Functions during Malaria Parasite Development in Blood and Mosquito. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 260(2017).
  20. Vanderberg, J. P., Yoeli, M. Effects of temperature on sporogonic development of Plasmodium berghei. The Journal of Parasitology. 52, 559-564 (1966).
  21. Vaughan, A. M., Aly, A. S., Kappe, S. H. Malaria parasite pre-erythrocytic stage infection: gliding and hiding. Cell Host & Microbe. 4, 209-218 (2008).
  22. Briones, M. R., Tsuji, M., Nussenzweig, V. The large difference in infectivity for mice of Plasmodium berghei and Plasmodium yoelii sporozoites cannot be correlated with their ability to enter into hepatocytes. Molecular and Biochemical Parasitology. 77, 7-17 (1996).
  23. Hollingdale, M. R., Leland, P., Leef, J. L., Beaudoin, R. L. The influence of cell type and culture medium on the in vitro cultivation of exoerythrocytic stages of Plasmodium berghei. The Journal of Parasitology. 69, 346-352 (1983).
  24. House, B. L., Hollingdale, M. R., Sacci, J. B. Jr, Richie, T. L. Functional immunoassays using an in vitro malaria liver-stage infection model: where do we go from here? Trends in Parasitology. 25, 525-533 (2009).
  25. Khan, Z. M., Vanderberg, J. P. Role of host cellular response in differential susceptibility of nonimmunized BALB/c mice to Plasmodium berghei and Plasmodium yoelii sporozoites. Infection and Immunity. 59, 2529-2534 (1991).
  26. Most, H., Nussenzweig, R. S., Vanderberg, J., Herman, R., Yoeli, M. Susceptibility of genetically standardized (JAX) mouse strains to sporozoite- and blood-induced Plasmodium berghei infections. Military Medicine. 131 (Suppl), 915-918 (1966).
  27. Nussenzweig, R., Herman, R., Vanderberg, J., Yoeli, M., Most, H. Studies on sporozoite-induced infections of rodent malaria. 3. The course of sporozoite-induced Plasmodium berghei in different hosts. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 15, 684-689 (1966).
  28. Silvie, O., Franetich, J. F., Boucheix, C., Rubinstein, E., Mazier, D. Alternative invasion pathways for Plasmodium berghei sporozoites. International Journal for Parasitology. 37, 173-182 (2007).
  29. Tarun, A. S., et al. Protracted sterile protection with Plasmodium yoelii pre-erythrocytic genetically attenuated parasite malaria vaccines is independent of significant liver-stage persistence and is mediated by CD8+ T cells. The Journal of Infectious Diseases. 196, 608-616 (2007).
  30. Weiss, W. R., Good, M. F., Hollingdale, M. R., Miller, L. H., Berzofsky, J. A. Genetic control of immunity to Plasmodium yoelii sporozoites. The Journal of Immunology. 143, 4263-4266 (1989).
  31. Philip, N., Orr, R., Waters, A. P. Transfection of rodent malaria parasites. Methods in Molecular Biology. 923, 99-125 (2013).
  32. Janse, C. J., Ponzi, M., Sinden, R. E., Waters, A. P. Chromosomes and sexual development of rodent malaria parasites. Memorias do Instituto Oswaldo Cruz. 89 (Suppl), 43-46 (1994).
  33. Sinha, A., et al. A cascade of DNA-binding proteins for sexual commitment and development in Plasmodium. Nature. 507, 253-257 (2014).
  34. Malleret, B., et al. A rapid and robust tri-color flow cytometry assay for monitoring malaria parasite development. Scientific Reports. 1, 118(2011).
  35. Aly, A. S., Matuschewski, K. A malarial cysteine protease is necessary for Plasmodium sporozoite egress from oocysts. The Journal of Experimental Medicine. 202, 225-230 (2005).
  36. Aly, A. S., Lindner, S. E., MacKellar, D. C., Peng, X., Kappe, S. H. SAP1 is a critical post-transcriptional regulator of infectivity in malaria parasite sporozoite stages. Molecular Microbiology. 79, 929-939 (2011).
  37. Aly, A. S., et al. Targeted deletion of SAP1 abolishes the expression of infectivity factors necessary for successful malaria parasite liver infection. Molecular Microbiology. 69, 152-163 (2008).
  38. Ozaki, L. S., Gwadz, R. W., Godson, G. N. Simple centrifugation method for rapid separation of sporozoites from mosquitoes. The Journal of Parasitology. 70, 831-833 (1984).
  39. de Koning-Ward, T. F., Gilson, P. R., Crabb, B. S. Advances in molecular genetic systems in malaria. Nature Reviews. Microbiology. 13, 373-387 (2015).
  40. Janse, C. J., Ramesar, J., Waters, A. P. High-efficiency transfection and drug selection of genetically transformed blood stages of the rodent malaria parasite Plasmodium berghei. Nature Protocols. 1, 346-356 (2006).
  41. Lin, J. W., et al. A novel 'gene insertion/marker out' (GIMO) method for transgene expression and gene complementation in rodent malaria parasites. PLoS One. 6, e29289(2011).
  42. Manzoni, G., et al. A rapid and robust selection procedure for generating drug-selectable marker-free recombinant malaria parasites. Scientific Reports. 4, 4760(2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

паразиты стадии развития в кровиокрашивание по Гимзепроточная цитометриявнутрибрюшинное заражениевнутривенное заражениекомар Anophelesколичественное определение спорозоитов
Фенотипический анализ грызунов малярии паразита асексуальных и сексуальной крови этапов и комаров этапов
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.