Анализ промотора c-KIT-лиганда с использованием иммунопреципитации хроматина

Краткое содержание

Взаимодействия ДНК-белок необходимы для нескольких биологических процессов. Во время оценки клеточных функций анализ взаимодействия ДНК-белка является необходимым для понимания регуляции генов. Хроматиновая иммунопреципитация (ChIP) является мощным инструментом для анализа таких взаимодействий in vivo.

Аннотация

Множественные клеточные процессы, включая репликацию и восстановление ДНК, рекомбинацию ДНК и экспрессию генов, требуют взаимодействия между белками и ДНК. Поэтому взаимодействия ДНК-белок регулируют многочисленные физиологические, патофизиологические и биологические функции, такие как клеточная дифференциация, клеточная пролиферация, контроль клеточного цикла, стабильность хромосом, регуляция эпигенетического гена и трансформация клеток. В эукариотических клетках ДНК взаимодействует с белками гистонов и негистонов и конденсируется в хроматин. Для анализа взаимодействия ДНК-белок можно использовать несколько технических средств, таких как анализ сдвига подвижности электрофореза (гель) (EMSA) и отпечаток ДНКазы I. Однако эти методы анализируют взаимодействие белка и ДНК in vitro , а не внутри клеточного контекста. Хроматиновая иммунопреципитация (ChIP) представляет собой метод, который захватывает белки в их специфических сайтах связывания ДНК, тем самым позволяя идентифицировать взаимодействие ДНК-белкаS в контексте их хроматина. Это делается путем фиксации взаимодействия ДНК-белка с последующей иммунопреципитацией представляющего интерес белка. Впоследствии характерен геномный сайт, связанный с белком. Здесь мы описываем и обсуждаем ChIP и демонстрируем его аналитическое значение для идентификации индуцированного Трансформирующим фактором роста фактора β-β (TGF-β) фактора транскрипции SMAD2 в SMAD-связывающие элементы (SBE) в промоторной области тирозин- Белковая киназа Kit (c-KIT) рецепторный лиганд фактор стволовых клеток (SCF).

Введение

В ядре эукариот ДНК взаимодействует с белками гистонов и белками негистона и конденсируется в хроматин. В физиологическом, патофизиологическом и клеточном биологическом контексте клеточные функции пространственно и временно контролируются с помощью согласованной с хроматином генной экспрессии. ДНК-белковые взаимодействия играют существенную роль в регуляции клеточных процессов, таких как репликация ДНК, рекомбинация и восстановление, а также экспрессия белка. Поэтому анализ взаимодействия ДНК-белок является незаменимым инструментом в оценке экспрессии генов и функции клеток.

Существует несколько методов для оценки взаимодействия ДНК-белка in vitro , такого как анализ сдвига подвижности электрофореза (гель) (EMSA) и отпечаток ^{1 , 2} ДНКазы I. Однако эти методы не анализируют взаимодействие белка и ДНК в хроматинном и клеточном контексте. ChIP iКоторая захватывает белки, связанные с их специфическими сайтами связывания ДНК, и тем самым облегчает идентификацию взаимодействий ДНК-белок в контексте хроматина. Метод был первоначально разработан Gimour и Lis для оценки связывания РНК-полимеразы II с определенными генами в Escherichia coli и Drosophila melanogaster ^{3 , 4} . Это делается путем фиксации ДНК-белковых комплексов с последующим проведением экстракции хроматина и срезанием ДНК в фрагменты пар 200 пар (bp). Впоследствии связанный ДНК-связывающий белок выделяют иммунопреципитацией. После разворота сшивки ДНК-белка ДНК очищают и анализируют. Для анализа сайтов связывания белка могут быть использованы несколько методов и зависят от последовательности нуклеиновой кислоты сайта связывания белка в гена-мишени ⁵ . В случаях, когда последовательность ДНК известна, стандартный PolYermase Chain Reactions (PCR) можно применять, используя определенные пары праймеров, фланкирующие известный сайт связывания. Также можно использовать количественную ПЦР в реальном времени (qRT-PCR) ⁶ . В случаях, когда последовательность неизвестна, ChIP можно комбинировать с микрочипами ДНК (ChIP-on-chip), секвенированием ДНК (ChIP-seq) или методами клонирования ^{7 , 8 , 9} .

Путь TGF-β обладает мощными функциями подавления опухолей и является ключевым путем дифференциации клеток. Он активируется посредством связывания лиганда TGF-β1 с его рецепторным комплексом, что приводит к серинфосфорилированию SMAD2 / 3 транскрипционных факторов. После их ассоциации с общим медиатором SMAD4 SMAD-комплекс транслоцирует ядро ​​и связывается с SBE в промоторной области генов-мишеней, где он регулирует гены, контролирующие клеточный цикл, апоптоз и клеточный дифференциална. Транскрипционный ответ на стимуляцию TGF-β является клеточным типом и контекстом ¹⁰ . Недавно мы описали цикл положительной обратной связи между TGF-β и c-KIT-каналом ¹¹ . В этой модели активированный TGF-β1 SMAD2 связывается с промотором лиганда c-KIT и индуцирует его экспрессию и секрецию. Впоследствии лиганд c-KIT активирует рецептор c-KIT авто- и паракриническим способом. Активация рецептора c-KIT приводит к STAT3 Tyr ⁷⁰⁵ -фосфорилированию через JAK1 / 2. После STAT3-активации и ядерной транслокации STAT3 связывается с геном TGF-β1-лиганда и регулирует его экспрессию.

Здесь мы демонстрируем существенную роль анализа ChIP для идентификации связывания SMAD2 с промотором лиганда c-KIT-рецептора и для идентификации активатора (и) активатора сигнала (of) транскрипции 3 (связывание STAT3 с TGF-β1- ген).

Протокол

1. Подготовка решений

1. Приготовьте следующие свежие решения для каждого эксперимента.
   1. Для раствора для фиксации подготовьте 37% формальдегида и сохраните его при комнатной температуре. Разбавьте его в 1х фосфат-буферном солевом растворе (PBS) до конечной концентрации 1,42%.
      ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: Формальдегид классифицируется как раздражающий, коррозионный, мутагенный, тератогенный и канцерогенный. Не глотать. Не вдыхать газ / пары / пар / спрей. При недостаточной вентиляции надевайте соответствующее респираторное оборудование. Избегать попадания на кожу и глаза. Хранить вдали от несовместимых веществ, таких как окислители, восстановители, кислоты, щелочи и влажность.
   2. Для раствора для остановки глицина подготовьте 0,125 М глицин в 1x растворе PBS и сохраните его при комнатной температуре.
   3. Для раствора для очистки клеток подготовьте 1x раствор PBS в dH ₂ O и храните его на льду. Непосредственно перед использованием добавьте ингибитор протеиназы фенилметилсульфонилфторид (PMSF) tКонечная концентрация 0,5 мМ.
      ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: PMSF классифицируется как коррозионный и токсичный; Надевайте защитную одежду и используйте ее в вентилируемом помещении.
   4. Непосредственно перед использованием буфера для лизиса клеток (20 мМ Трис-HCl, pH 8,0, 85 мМ KCl и 0,5% NP40) добавляют 1X коктейль ингибитора протеазы (PIC, 100% исходный раствор в диметилсульфоксиде (ДМСО): 104 мМ 4- ( 2-аминоэтил) бензолсульфонилфторида (AEBSF), 80 мкМ апротинина, 4 мМ-наилучтина, 1,4 мМ E-64, 2 мМ лейпептина и 1,5 мМ пепстатина А) и 0,5 мМ PMSF.
   5. Непосредственно перед использованием буфера для лизиса ядер (50 мМ Tris-Cl, pH 8,0, 10 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (EDTA) и 1% SDS) добавляют 1X PIC и 0,5 мМ PMSF.

2. Фиксация и резка клеток

1. Выращивайте клетки до 70-80% слияния на пластинах для культивирования тканей 10 см. Стимулируйте клетки в экспериментальных целях.
2. Удалите среду для культивирования ткани, добавьте 5 мл фиксирующего раствора и инкубируйтеКлетки в течение 10 мин при комнатной температуре на трясущейся платформе.
3. Удалите раствор для фиксации и дважды промойте клетки 10 мл ледяной 1x PBS.
4. Удалите 1x PBS, добавьте 5 мл раствора для остановки глицина и инкубируйте клетки в течение 5 минут при комнатной температуре на трясущейся платформе.
5. Удалите раствор для остановки глицина и дважды промойте клетки 10 мл ледяной 1x PBS.
6. Удалите 1x PBS, добавьте 2 мл раствора для очистки клеток и извлеките ячейки с помощью скребка для клеток. Перенесите собранные клетки в коническую трубку на льду.
7. Центрифугируйте образцы в течение 10 минут при 600 xg и 4 ° C.
8. Удалите надосадочную жидкость, повторно суспендируйте гранулу в 1 мл 1X-литиевого буфера для лизиса и инкубируйте на льду в течение 30 мин. Альтернативно, замораживайте осадок в жидком азоте и храните его при -80 ° C.
9. Как только осадок ресуспендируют в буфере для лизиса клеток, переносите клеточную суспензию в гомогенизатор ледяного дозатора и прокачайте 10 ударов с использованием пестицида типа BE для разрушения ячейки.
10. Перенесите клеточную суспензию в микроцентрифужную пробирку и центрифугируйте образцы в течение 10 минут при 2400 xg и 4 ° C.
11. Удалите супернатант, ресуспендируйте гранулу в 350 мкл буфера для переваривания ядер и инкубируйте образцы в течение 5 мин при 37 ° С.
12. Добавляют микрококковую нуклеазу (1 U / мкл) и перемешивают путем встряхивания. Инкубируйте образцы при 37 ° С в течение 5-20 мин; Смешивать образцы каждые 2 мин путем инверсии.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Время и концентрация ферментов различаются между клеточными линиями и могут потребовать оптимизации в случаях субоптимального ферментативного сдвига.
13. В качестве альтернативы, можно добиться сдвига хроматина с помощью ультразвука с использованием имеющихся в продаже ультразвуков.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Условия ультразвуковой обработки требуют оптимизации. Пример протокола оптимизации приведен ниже, используя объем выборки 300 мкл и мощность обработки образца 25%.
    1. Следуя шагу 2.10, отбрасывают супернатант и ресуспендируют nЯдерный осадок в 1,0 мл коммерческого буфера для сдвига.
    2. Аликвоту 300 мкл ресуспендированного ядерного осадка в три 1,7 мл микроцентрифужных пробирки. Поместите их на лед.
    3. Сдвиньте 3 аликвоты фиксированного хроматина при 25% мощности, используя 3 разных условия для определения оптимальных условий обработки ультразвуком:
       5 импульсов по 20 с каждый с 30 с покоя на льду между каждым импульсом.
       10 импульсов по 20 с каждый, при этом 30 секунд остался на льду между каждым импульсом.
       20 импульсов по 20 с каждый, при этом 30 секунд остался на льду между каждым импульсом.
    4. Перейдите к шагу 2.15, как описано ниже.
14. После инкубации с микрококковой нуклеазой добавьте 7 мкл ледяной 0,5 М ЭДТА, чтобы остановить реакцию.
15. Центрифугируйте образцы с расщепленной ДНК в течение 10 мин при 16200 xg и 4 ° C.
16. Перенесите отрезанный ДНК-содержащий супернатант в свежую микроцентрифужную пробирку. Аликвоту 50 мкл в отдельную микроцентрифужную пробирку для подтверждения suРезкое разрушение ДНК (раздел 3). Используйте оставшийся объем немедленно для иммунопреципитации (раздел 4) или храните его при -80 ° C.

3. Подтверждение эффективности сдвига

1. Добавьте 150 мкл нуклеазонного свободного dH ₂ O и 10 мкл 5 М NaCl в 50 мкл аликвоты отрезанного хроматина со стадии 2.16.
2. Инкубируйте образцы при 65 ° C в течение 4 ч для отмены поперечных связей.
3. Добавить 2 мкл РНКазы А (10 мкг / мкл) и инкубировать образцы при 37 ° С в течение 15 мин.
4. Добавьте 10 мкл протеиназы К (0,5 мкг / мкл) и инкубируйте образцы при 42 ° С в течение 90 мин.
5. Для очистки ДНК выполните экстракцию фенолом / хлороформом ¹² .
   1. Добавьте воду без нуклеазы до конечного объема 200 мкл. Добавить 200 мкл фенола: хлороформ: изоамиловый спирт (25: 24: 1) в образец и вихрь в течение 20 с.
   2. Центрифуга при комнатной температуреВ течение 5 мин при 16000 × g. Осторожно удалите верхнюю водную фазу и перенесите ее в свежую трубку. Обязательно не переносите какой-либо фенол во время пипетирования.
   3. Добавьте 0,1 объема 3 М ацетата натрия (NH ₄ OAc), рН 5,2, и перемешайте, несколько раз щелкнув трубкой пальцем. Добавьте 2,5 объема ледяного 100% -ного этанола и перемешайте путем встряхивания в течение 5 с. Инкубируйте образец O / N при -20 ° C или в течение как минимум 1 часа при -80 ° C.
   4. Центрифугируйте образец в течение 30 минут при 4 ° C и 16 000 xg для осаждения кДНК.
   5. Осторожно удалите супернатант, не разрушая гранулу. Добавить 1 мл RT, 70% этанола и перевернуть трубку несколько раз.
   6. Центрифугируйте образец в течение 2 минут при 4 ° C и 16000 x g. Осторожно удалите супернатант.
   7. Высушите осадок в течение 5-10 мин при комнатной температуре. Ресуспендируют гранулу в 30 мкл dH ₂ O.
6. Используйте аликвоту 5 и 10 мкл очищенной ДНК для гель-электрофореза с 1% TAEАгарозном геле.
   ПРИМЕЧАНИЕ. Успешное разрушение хроматина приводит к шаблону ДНК 200-1,55 п.о. Если сдвиг не удался, определите оптимальные условия сдвига для конкретных клеток, изменив время инкубации этапа сдвига (шаг 2.12) до 5, 10 и 15 мин.
7. Используйте оставшийся образец для анализа концентрации ДНК в образце. Обратное вычисление концентрации ДНК в прорезанном образце хроматина (этап 2.16); Используйте те же количества ДНК для каждой группы лечения для иммунопреципитации (раздел 4).

4. Иммунопреципитация

1. Объединить 10-25 мкг срезанного сшитого хроматина (этап 2.16) с 25 мкл магнитных шариков из белков типа CHIP, 10 мкл буфера для разведения иммунопреципитации (исходный раствор: 0,01% SDS, 1,1% Triton X-100, 16,7 мМ Tris-HCl, pH 8,0, 1,2 мМ ЭДТА и 167 мМ NaCl) и 1 мкл ПОС.
2. Через 4 часа инкубации добавьте 1-10 мкг антитела (концентрация антителаЗависит от аффинности антитела; Он должен быть первоначально использован для рекомендаций производителя и экспериментально оптимизирован в случае необходимости) в 1,5 мл микроцентрифужную пробирку и добавить dH ₂ O до конечного объема 100 мкл.
   ПРИМЕЧАНИЕ. Вместо описанного выше метода прямого иммунопреципитации метод косвенного иммунопреципитации можно использовать, сначала комбинируя хроматин с антителами, а затем добавляя магнитные гранулы белка G.
3. Инкубируйте образцы на концевом ротаторе в течение 4-12 часов при 4 ° C.

5. Элюирование

1. Поместите трубки на магнитную подставку. После того, как магнитные бусины собраны на стороне трубки, осторожно удалите и выбросьте супернатант.
2. Три раза промыть бусины 800 мкл промывочного буфера 1 (0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 мМ EDTA, рН 8, 20 мМ Трис-HCl, pH 8 и 150 мМ NaCl); Смешивать, переворачивая трубку несколько раз. Поместите трубку на магнитную подставку aОсторожно удалите и выбросите бункер для стирки, как только магнитные бусины будут собраны сбоку от трубки.
3. Один раз промыть бусины 800 мкл промывочного буфера 2 (0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 мМ EDTA, рН 8, 20 мМ Tris-HCl, pH 8 и 500 мМ NaCl); Смешивать, переворачивая трубку несколько раз. Поместите трубку на магнитную подставку и аккуратно удалите и выбросите бункер для стирки, как только магнитные бусины наполнится сбоку от трубки.
4. Ресуспендируют гранулы в 50 мкл буфера для элюирования (1% SDS и 100 мМ NaHCO ₃ ) и инкубируют образцы на концевом ротаторе в течение 15 мин при комнатной температуре.
5. Поместите трубки на магнитную подставку, и как только магнитные шарики собираются сбоку от трубки, перенесите супернатант в свежую трубку.
6. Добавьте 6 мкл 5 М NaCl, чтобы свернуть сшивку и 2 мкл протеиназы К (0,5 мкг / мкл). После смешивания образцов инкубируйте образцы в течение 2 ч при 65 ° С.
7. Для очистки ДНК выполните pheNol / хлороформ ¹² (этап 3.5) и затем ресуспендируют осадок в 30 мкл dH ₂ O.
   ПРИМЕЧАНИЕ. Образцы могут быть непосредственно проанализированы на сайты связывания белка (раздел 5) или могут храниться при -20 ° C.

6. Анализ связующего сайта

1. Проведите анализ для конкретных сайтов связывания в пределах известной последовательности нуклеиновой кислоты с использованием ПЦР или qRT-ПЦР. Для дизайна грунтовки следуйте обычным протоколам PCR или qRT-PCR. Конструируйте праймеры для синтеза ампликона 150-400 пар оснований, который мостирует интересующий сайт связывания белка ( рис. 1 ).
2. Настройте ПЦР, используя четыре разных шаблона ДНК, чтобы обеспечить определенность: i) ДНК из ChIP, иммунопреципитированной интересующим антителом, ii) ДНК из ChIP, иммунопреципитированной неспецифическим IgG-антителом, iii) входная ДНК и iv) H ₂ O в виде Отрицательный контроль для ПЦР, чтобы исключить загрязнение. В случае стимуляции пути, Выберите пятый шаблон, используя другой набор праймеров, специфичных для известного сайта связывания иммунопреципитированного белка.
   ПРИМЕЧАНИЕ. В случае анализа промотора лиганда c-KIT используют обычную ПЦР для демонстрации связывания SMAD, индуцированного TGF-β, в SBE в области промотора лиганда c-KIT. В качестве положительного контроля выполните ПЦР на ингибитор-активатор плазминогена-1 (PAI-1) в качестве известной мишени связывания с SMAD, индуцированного TGF-β.

Результаты

Связывание лиганда TGF-β1 с его родственным рецепторным комплексом приводит к серинфосфорилированию транскрипционных факторов SMAD2 / 3, за которыми следует их связь с общим медиатором SMAD4. Комплекс SMAD транслоцируется в ядро. TGF-β может регулировать транскрипцию гена либо непосредственно через SMAD-связывание с SBE в регуляторных областях генов-мишеней, либо косвенно через SMAD-регулируемую экспрессию транскрипционных активаторов или репрессоров, которые впоследствии регулируют эксп...

Обсуждение

В этом отчете мы демонстрируем индуцированное TGF-β1 связывание SMAD2 с SBE в промоторе лиганда c-KIT и индуцированное TGF-β-связывание STAT3 с его распознающей последовательностью в гене TGF-β1-лиганда. Мы демонстрируем индуцированное цитокином связывание обоих факторов транскрипции с использованием иммунопреципитации хроматина.

Хроматиновая иммунопреципитация является мощным инструментом для демонстрации прямого связывания белка, представляющего интерес для ДНК, для характеристики стимулов...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
HepG2 клетки	ATCC	HB-8065
Hep3B клетки	ATCC	HB-8064
TGF-β 1	R& D Systems	101-B1	Используется в концентрации 10 нг/мл
антител Anti-SMAD2	Технология клеточной сигнализации	5339	Количество использованных/IP: 3 &м; g
Anti-STAT3	антитело Клеточная сигнальная технология	4904	Количество использованных/IP: 3 &микро; g
ChIP-IT Protein G Магнитные шарики	Активный мотив	53033
Коктейль ингибиторов протеазы	Активный мотив	37490
Технология передачи сигналов клеток	микрококковой нуклеазы	10011
ПЦР Прямой праймер: PAI-1			Последовательность: 5'-GGAAGAGGATAAAGGACAAGCTG-3'
Обратный праймер для ПЦР: PAI-1			Последовательность: 5'-TGCAGCCAGCCACGTGATTC-3'
Прямой праймер ПЦР: SCF			Последовательность: 5'-CACTGATGTTAATGTTCAGC-3'
Обратный праймер для ПЦР: SCF			Sequence: 5'-GCTCTAATTTAAACCTGGAGC-3'
Прямой праймер для ПЦР: TGF-β 1 (STB-1)			Последовательность: 5'-GAGAGAGACGTGAGTGAGTGGCATGTT-3'
Обратный праймер для ПЦР: TGF-β 1 (STB-1)			Последовательность: 5'-TAGCTTTCTCTGCCTTGGTCTCCCC-3'
Прямой праймер для ПЦР: TGF-β 1 (STB-2)			Последовательность: 5'-GTACTGGGGGGGAGGCGGCATC-3'
Обратный праймер для ПЦР: TGF-β 1 (STB-2)			Последовательность: 5'-TGCCACTGTCTGGAGAGAGGTGTC-3'