Method Article

Метод проверки влияния экологических сигналов на поведение спаривания в Drosophila melanogaster

DOI:

10.3791/55690

⸱

July 17th, 2017

 , 
1Groningen Institute for Evolutionary Life Sciences, University of Groningen

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы демонстрируем анализ для анализа экологических и генетических сигналов, влияющих на поведение спаривания в плодовой мушке Drosophila melanogaster .

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

На сексуальную активность человека влияет генотип, опыт и условия окружающей среды. Как эти факторы взаимодействуют для модуляции сексуального поведения, остается слабо понимаемым. В Drosophila melanogaster экологические сигналы, такие как доступность продуктов питания, влияют на спаривающую активность, предлагая приемлемую систему для исследования механизмов, модулирующих сексуальное поведение. В D. melanogaster , экологические сигналы часто ощущаются через хемосенсорные вкусовые и обонятельные системы. Здесь мы представляем метод проверки влияния экологических химических сигналов на поведение спаривания. Анализ состоит из небольшой спаривающей арены, содержащей пищевую среду и пару спаривания. Частота спаривания для каждой пары непрерывно контролируется в течение 24 часов. Здесь мы представляем применимость этого анализа для проверки соединений окружающей среды от внешнего источника через систему сжатого воздуха, а также манипуляции с компонентами окружающей среды непосредственно на арене спаривания. УSe системы сжатого воздуха особенно полезна для проверки влияния очень летучих соединений, в то время как манипулирование компонентами непосредственно на арене сопряжения может иметь значение для определения присутствия соединения. Этот анализ может быть адаптирован для ответа на вопросы о влиянии генетических и экологических сигналов на поведение спаривания и плодовитость, а также на другие репродуктивные поведения мужчин и женщин.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Репродуктивное поведение обычно имеет высокие затраты на энергию, особенно для женщин, которые производят большие гаметы, чем мужчины, и должны тщательно выбирать условия для воспитания своего развивающегося потомства. Из-за стоимости энергии неудивительно, что воспроизведение связано с питательными условиями. Это справедливо для большинства, если не для всех, животных, включая млекопитающих, чье половое созревание может быть отсрочено вследствие недоедания, а на сексуальный всадник которого может отрицательно сказаться ограничение на питание 1 .

Репродукция генетического модельного организма Drosophila melanogaster также зависит от условий питания. Самцы суда на более высоком уровне в присутствии летучих продуктов 2 , а самки более восприимчивы к сексуальному влечению в присутствии дрожжей, основного питательного вещества для производства яиц и выживаемости потомства 3 , 4 , 5 . ЭтаЭволюционно-консервативная репродуктивная реакция на питание дает возможность изучить механизмы, которые связывают экологическую доступность продуктов питания с половым размножением в генетически приемлемом и экономически эффективном организме. В самом деле, работа в дрозофиле была вовлечена в пути к инсулину в качестве важного регулятора соединения между пищевой и сопрягаемым поведением 6. Он также показал, что сам акт спаривания меняет предпочтение пищи женщин, а также ассоциированные хемосенсорные нейроны 7 , 8 , 9 .

Понятно, что пищевые сигналы влияют на репродуктивное поведение в D. melanogaster . Эти эффекты, по-видимому, в основном затрагивают женщин, особенно тех, кто уже спал 5 . Однако для проверки этих острых последствий условий окружающей среды анализ, классически используемый для женского спаривания, можетНе очень подходят из-за длительных перерывов между эпизодами спаривания. В классическом репарационном анализе девственная женщина впервые встречается с мужчиной и сразу же изолирована и представлена ​​новым мужчиной через 24-48 часов. Этот классический анализ был использован с большим успехом для идентификации компонентов мужского эякулята, которые изменяют поведение женщины и женский отклик 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 . Таким образом, описанный здесь непрерывный анализ спаривания является дополнением к классическим анализам спаривания, которые могут быть использованы для изучения острого влияния условий окружающей среды на репродуктивное поведение.

Используя непрерывный анализ спаривания, описанный здесь, мы ранее показали, что пара мух, подвергнутых воздействию дрожжей, будет восстанавливатьсяeveral раз в течение 24 - часового периода наблюдения 5, 19, 20, 21, в то время как мухи , не подвергается воздействию пищи будет только один раз Remate 5. Это открытие может быть озадачивающим в свете большой части литературы D. melanogaster, свидетельствующей о том, что самки не рематуются в течение нескольких дней после первоначального спаривания (см. Рекомендации 10 , 11 ). Однако это расхождение легко объясняется условиями анализа, когда женщина изолирована на один-несколько дней, прежде чем будет предоставлена ​​новая возможность спаривания. Если пара не сопряжена в этом часовом периоде наблюдения, самка характеризуется как нечувствительная. Более того, высокая частота спаривания не должна удивлять, учитывая, что данные от пойманных мух мух показывают, что женщины содержат сперму от 4 до 6 мужчин в своих органах хранения; Таким образом, вЧто женщины, естественно, репараты несколько раз 22 , 23 .

Здесь мы демонстрируем использование этого метода непрерывного спаривания, чтобы разгадать, как мухи собираются и объединяют информацию об условиях окружающей среды для модуляции частоты спаривания. Этот анализ позволяет тестировать относительно большое количество спаривающих пар для генетических исследований и проверять влияние летучих и нелетучих экологических сигналов. Анализ обычно проходит в течение 24 часов, но может быть увеличен до 48 часов, что позволяет тестировать циклические экологические сигналы, такие как светло-темный (LD) цикл. Мы демонстрируем этот анализ, проверяя влияние летучих сигналов от культуры дрожжей в воздушной системе под давлением в сочетании с наличием нелетучего питательного вещества дрожжей в пищевом субстрате.

Система сжатого воздуха непрерывно подает волатильные сигналы на сопрягаемую арену, которая содержитСа пищевой субстрат и тестовую пару (чье поведение при поведении контролируется). Чтобы дополнительно определить особенности, с которыми дрожжи влияют на спаривание, мы тестируем основное летучее соединение дрожжей, а именно уксусную кислоту 24 , в сочетании с содержанием аминокислоты, которое соответствует количеству дрожжей в пищевом субстрате, в форме пептона (амино Кислоты, полученные из ферментативного переваривания животных белков). Вместе эти эксперименты демонстрируют, как эффект экологического сигнала на поведение спаривания D. melanogaster можно проверить с помощью этого анализа.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Экологически контролируемая соединительная коробка

  1. Чтобы обеспечить контролируемую и легко очищаемую зону тестирования, установите кухонный шкаф из нержавеющей стали размером 120 см х 64 см х 85 см, как показано на рисунке 1А.
    1. Просверлите одно отверстие в задней части шкафа чуть ниже потолка и четыре комплекта из четырех отверстий в стороны, каждый с диаметром 2 см. Просверлите первые два набора из четырех отверстий на каждой стороне коробки на высоте 7 см от нижней части коробки и 12,5 см между отверстиями. Просверлите два других набора на каждой стороне коробки на высоте 35 см от дна.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Четыре набора из четырех отверстий используются для кабелей питания камеры и насосно-компрессорных труб для входа и выхода из шкафа. Отверстие сзади используется для силовых кабелей световой доски.
    2. Постройте световую доску с восемью рядами из 40 чередующихся белых и красных светодиодов (LED) с пространством 2,5 см между каждым светом. Установите белый и красный светодиоды в циркеT с источником питания. Подключите каждый светодиод последовательно с резистором 560 Ом, 0,25 Вт и 5% -ным допуском.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Длины волн излучения красного света, отслоенного от 590-661 нм с резким пиком при 627 нм. Результирующая интенсивность света в экспериментальной зоне составляет приблизительно 900 люкс с включенным освещением и 90 люкс с включенным только красным светом; Это было измерено с помощью приложения для измерения яркости смартфона.
    3. Прикрепите световую панель к верхней части шкафа из нержавеющей стали и пропустите силовые кабели через отверстие сзади.
    4. Подключите адаптер белых светодиодов к таймеру управления мощностью, чтобы можно было отключить белый светодиод во время темной фазы эксперимента. Подключите адаптер красного света, который летает слепой до 25 , к обычным источникам питания, чтобы держать их на всю продолжительность эксперимента.
    5. Закрепите один металлический кронштейн длиной 110 см и два 54 см, каждый с шириной 0,5 см, с внутренней стороны коробки на высоте 50См от нижней части коробки. Поместите в эти скобки пластину диффузии из матового стекла (размеры 119,0 см х 54,5 см х 0,5 см).
    6. Добавьте три слоя фильтровальной бумаги (120 см x 50 см) между световой доской и стеклянной пластиной, чтобы рассеять свет и ограничить блики на поверхности сопрягаемых аренов (описано в разделе 4). Вставьте два листа бумаги для фильтров вместе на их длинном крае на деревянных стержнях длиной 120 см, используя магниты (сбоку), чтобы приклеить их к внутренностям металлического шкафа; Выполните это действие 3 раза.
    7. Прикрепите четыре вентилятора по бокам коробки, чтобы создать воздушный поток, который непрерывно разъединяет спаренную коробку. Прикрепите первый комплект вентиляторов 8 см между световой доской и стеклянной пластиной, с входом воздуха с левой стороны и выхлопом в правой части коробки, чтобы свести к минимуму нарастание тепла, создаваемого световой доской.
    8. Прикрепите второй комплект вентиляторов 12 см на 25 см выше нижней части шкафа, чтобы создать наружный поток воздуха, который выделяет iNside шкафа и охлаждает его до стабильного 26 ° C. Прикрепите вентиляторы со стороны выхлопных газов к всасывающему шлангу и выведите воздушный поток из помещения, чтобы предотвратить повторное движение воздуха в шкафу.
  2. Настройте две стойки (приблизительно 48 см в высоту), установленные с двумя хомутами, один на 28 см и один на 30 см от основания подставки. Закрепите веб-камеру на каждом зажиме. Подключите 4 камеры к компьютеру, на котором запущено программное обеспечение для мониторинга.
  3. Разместите листы A4 под каждой веб-камерой. Используйте незапечатанные белые листы или листы с предварительно пронумерованной сеткой 7 на 5 квадратов с осями 4 см для размещения спаривающих арен (описанных в разделе 4).
    ПРИМЕЧАНИЕ. Камера веб-камеры HD с широкоугольным углом обзора 78 ° и разрешением 5 миллионов пикселей может охватывать площадь 21 см х 30 см, соответствующую листу формата A4, и монитор от 20 до 35 спаривающих арен.

2. Подъем и сбор мух

  1. Место 20 мужчин и 20 женщин дикого типа Кантон-СВылетает в летающие бутылки для выращивания, содержащие 45 мл богатой мучной пищевой среды (см. Раздел 3) в течение трех-четырех дней. Перенесите тех же взрослых три раза, сначала нажав их вниз, а затем в свежие бутылки.
    1. Поместите бутылки в инкубатор при 25 ° C и 12 часов: 12 часов светло-темного цикла с включенным освещением в 09:00 (время Zeitgeber (ZT) 0). Новое поколение появится примерно через 10 дней.
  2. Анестезируйте полученные недавно закрытые мухи на подушечки для углекислого газа не более 5 минут и соберите их в флаконы для мух с помощью кисти.
    1. Соберите девственных (недавно закрытых) самок и девственных самцов из бутылок из дикого типа Canton-S в 2,5 мл х 9,5 см летающих флаконов с 6,5 мл богатой мучной пищевой среды.
  3. Возраст мух в тех же половых группах по 20 мух каждый в летающих флаконах для выдержки в течение 5-8 дней при 25 ° C и 12 часов: 12 часов светло-темного цикла и загорается в 09:00 (ZT 0).
  4. TransfВылетают на свежие флаконы для выпечки на день перед экспериментом.

3. Подготовка пищевой среды

  1. Подготовьте 1 л богатой среды для мух следующим образом.
    1. Налейте 1 л водопроводной воды в стеклянный стакан емкостью 2 л с магнитной мешалкой и установите стакан на магнитную горячую плиту. Продолжайте перемешивание и включите нагрев до 300 ° C до достижения температуры кипения.
      ПРИМЕЧАНИЕ. В течение длительного времени кипения на следующих этапах доля воды будет испаряться, но вместе с добавленными ингредиентами в этом протоколе получается 1 л богатой среды для мух при приготовлении при комнатной температуре приблизительно 22 ° C.
    2. Включить перемешивание до 500 об. / Мин (об / мин) и добавить следующие ингредиенты в кипящую воду: 10 г агара, 30 г глюкозы, 15 г сахарозы, 15 г кукурузной муки, 10 г зародышей пшеницы, 10 г соевой муки, 30 г Мелассы, 35 г активных сухих дрожжей. Подождите, пока дрожжи будут пены энергично, затем отпустите температуру горячей плитыДо 120 ° C.
    3. Через 10 мин нагревают до 30 ° С и перемешивают до охлаждения до 48 ° С. Контролируйте температуру, вставив термометр непосредственно в пищу.
    4. Растворяют 2 г метилового эфира п-гидроксибензойной кислоты (тегосепт, 100%) в 10 мл 96% этанола. Добавьте это и 5 мл 1 М пропионовой кислоты в смесь. Перемешать в течение 3 мин.
    5. Налейте питательную среду мухи на арены (описанные в разделе 4), чтобы создать слой толщиной 0,3 см на дне арены.
      1. Используйте 200 мл стеклянный стакан для заливки. Когда точные количества важны, используйте 10 мл серологической пипетки.
  2. Подготовьте мутную среду минус дрожжи точно так, как описано на этапе 3.1.1, до 3.1.5, но не оставляйте дрожжи на этапе 3.1.2.
  3. Подготовьте среду с агаром с пептином или без него, смешав 10 г агара и 35 г пептона в 1 л кипящей воды и выполните шаги с 3.1.4 до 3.1.5.

4. MatinG Подготовка к аренде

  1. Проденьте отверстие диаметром приблизительно 0,3 см на верхней стороне пластиковой чашки Петри размером 3,5 см х 1,0 см с использованием нагретой иглы для подготовки (нагретой до покраснения в горелке Бунзена). В качестве альтернативы используйте паяльник.
  2. При приготовлении питательной среды с запахами для приготовления первой пипетки 30 мкл (1% конечной пищевой среды, например, 100% ледяной уксусной кислоты) желаемого соединения в чашку для половины экспериментальных блюд. Оставьте другую половину посуды пустой для сравнения.
    ПРИМЕЧАНИЕ. При настройке, описанной здесь, можно одновременно протестировать максимум 140 арен.
  3. Используя 10 мл серологическую пипетку, залейте 3 мл пищевой среды на дно блюда сверху желаемого соединения. Накройте его сырной тканью, чтобы предотвратить загрязнение, и оставьте среду затвердеть приблизительно на 1 час при комнатной температуре.
  4. Поместите крышку на посуду и заклеивайте каждую пленку с двух сторон. Подготовьте небольшие пробки из парафиновой пленки, чтобы покрыть отверстияЧашки путем прокатки кусков парафиновой пленки в рулоны толщиной 0,2 см, а затем разрезают их на 0,5 см сегментов.

5. Дрожжевая культура для запаха

  1. Выращивают сухие активные дрожжи на дрожжевом экстракте пептон-декстрозу (YPD) агар в чашке Петри 14,0 см х 2,06 см. Наденьте перчатки, чтобы предотвратить загрязнение на этом этапе.
    1. Приготовление агаровых пластинок YPD путем добавления 10 г дрожжевого экстракта, 20 г пептона, 22 г глюкозы (0 (+) - глюкозы моногидрата) и 15 г агара (чистый) до 1 л кипящей сверхчистой воды. Нанесите нижнюю часть чашки Петри, когда все растворится и храните вверх дном в холодильнике при 4 ° C на срок до 2 месяцев.
    2. Посыпьте несколько зерен сушеных дрожжей на среднюю пластину YPD, позвольте им раствориться. Затем протрите среднюю пластину, используя стерильную петлю. Храните тарелку в инкубаторе 30 ° C в течение ночи. Затем храните культуру в холодильнике не более 1 недели.
  2. Подготовьте жидкую среду YPD iN 1 л, добавив 10 г дрожжевого экстракта, 20 г пептона, 22 г глюкозы (0 (+) - моногидрат глюкозы) и перемешивающий бар до 1 л сверхчистой воды.
    1. Автоклав в течение 25 мин при 120 ° С и давлении 1 бар. Затем храните бутылки при температуре 4 ° C в течение 2 месяцев до использования.
  3. Установите открытые колпачки (4,5 см) с силиконовой перегородкой толщиной 0,32 см.
    1. Вырежьте два небольших отверстия в перегородке, чтобы плотно прилегать к колючей арматуре. Прикрепите небольшую трубу из поливинила хлорида (ПВХ) (диаметр: внешний 0,8 см и внутренний 0,5 см) к обоим выходам, выходящим из бутылки, и к одному из впускных отверстий, входящих в бутылку. См. Рисунок 1B для иллюстрации.
    2. Оберните установленные колпачки и трубки в алюминиевой фольге и автоклаве в течение 25 минут при 120 ° C и давлении 1 бар.
  4. Наденьте перчатки для защиты от загрязнения на этом этапе. Окуните стерильный наконечник пипетки 100 мкл в одну из колоний дрожжей с пластины агара YPD (dОписанной в 5.1) и отбрасывают в автоклавную бутылку жидкой среды YPD.
    1. Закройте эту бутылку с жидкостной средой YPD с привитой дрожжей, а также контрольную бутылку YPD (дрожжи, не добавленные) с автоклавированными колпачками, установленными с входом и выходом (описанные на шаге 5.3). Поместите обе бутылки на отдельные магнитные пластины и перемешайте со скоростью 100 об / мин при комнатной температуре в течение 24 часов до начала эксперимента, чтобы культура дрожжей увеличивалась.
    2. Соедините входы обеих бутылок, чтобы отделить аквариумные насосы для подачи воздуха в культуру дрожжей. Обязательно подключите выход экспериментальной дрожжевой бутылки к трубе, выпускающей запах дрожжей из экспериментальной комнаты, чтобы предотвратить помехи в эксперименте.

6. Настройка пневматического насоса

  1. Прикрепите большую трубку из ПВХ (диаметр: внешний 1,2 см и внутренний 0,9 см) к источнику сжатого воздуха и проведите его через две 1 л стеклянные колбы Эрленмейера, заполненные активированным углем, до 800 млЧтобы очистить воздух. Используйте либо сжатый воздух, обычно поставляемый в лабораториях в качестве подачи воздуха, либо подсоединяйте трубки к воздушному насосу (здесь использовался сжатый воздух).
    ПРИМЕЧАНИЕ. Материал трубы следует выбирать на основе химических свойств летучих веществ и проверять на предмет предотвращения прилипания летучих веществ к прокладке трубки (например, политетрафторэтилена, нейлона или нержавеющей стали).
  2. Сделайте два воздушных разделителя из 15 мл пробирки и три 1000 мкл пипетки каждый.
    1. Сделайте три отверстия диаметром ~ 1 см. Сначала сжечь два отверстия, используя нагретую иглу для подготовки (нагретую красным светом в горелке Бунзена), рядом друг с другом чуть ниже крышки трубки 15 мл. Затем сделайте третье отверстие, удалив нижнюю часть трубки.
    2. Приклейте наконечники пипетки 1000 мкл в отверстия с узким концом, направленным наружу. Отрежьте конец наконечников пипетки, чтобы обеспечить больший поток воздуха.
  3. Соедините большую трубку из ПВХ с выходом cЗаполненную углем колбу Эрленмейера до наконечника пипетки в нижней части трубки 15 мл. Добавьте небольшие отверстия для труб из ПВХ в два горизонтальных наконечника пипетки и подведите их к контрольной и экспериментальной бутылке.
  4. Чтобы предотвратить загрязнение среды YPD микроорганизмами, прикрепите небольшую трубу к стерильному фильтру шприца (размер пор 0,45 мкм) с пластмассовым нажимным штекером для перемычки трубки, идущим к фильтру, и винт на пластиковой переборке, выходящий из фильтра. Затем присоедините трубку к входу в бутылку культуры YPD (см. Рисунок 1B ).
  5. Чтобы предотвратить перемещение дрожжей, перемещаемых в воздухе, из культуральной колбы на экспериментальную арену, прикрепите стеклянную трубку (длиной 6,5 см, наружный диаметр = 0,5 см и внутренний диаметр = 0,3 см) к выпускному отверстию каждой бутылки с культурой YPD с использованием небольших трубок. Прикрепите ПВХ-трубку к другой стороне стеклянной трубки и проведите ее по направлению к нижним отверстиям (просверленным с каждой стороны) блока эксперимента.
    1. Заполните трубу стекловолокном и автоклавируйте его перед использованием.
  6. Добавьте еще один 15-миллилитровый трубчатый сплиттер (описанный в разделе 6.2) к маленькой трубе из ПВХ на каждой стороне экспериментальной коробки, чтобы получить две трубки, которые попадают в коробку на обеих сторонах эксперимента (ближе всего к выхлопному потоку воздуха вентилятора, справа) И контрольной стороной (ближе всего к входу воздушного потока вентилятора, слева).
  7. Подготовьте 8x 25 мл серологических пипеток, каждый из которых имеет 10 выходов для одновременного тестирования 80 спаривающих пар, т.е. 40 для каждого состояния воздуха.
    1. Сжечь 10 отверстий диаметром ~ 0,8 см, 2 см друг от друга в пипетке.
    2. Отрежьте внешнюю часть 1 мл шприца в один маленький (2,5 см) и один большой (5 см) выход.
    3. Приклейте эти отверстия в отверстия с помощью горячего клея.
    4. Оберните небольшую полосу пластиковой парафиновой пленки вокруг конца выходов и прикрепите наконечник пипетки объемом 1000 мкл. Диаметр отверстия наконечника составляет 0,1 см. Используйте чистые советы для каждого эксперимента.
    5. Прикрепите две серологические пипетки, используя Т-сплиттер с наружным диаметром ≥ 0,5 см и короткие кусочки небольших труб из ПВХ, к каждому из двух выходов с обеих сторон. Наденьте пипетки на лист белой бумаги (под камерами в стальной коробке).
    6. Используя монитор потока воздуха, установите поток воздуха так, чтобы скорость воздуха на выходе из наконечника пипетки 1000 мкл составляла 0,5 м / с. Это соответствует потоку воздуха 0,0017 л / с на наконечник.

    7. Мониторинг поведения спаривания

    1. Используйте пипетку для рта (как описано в ссылке 26 ), чтобы помещать одну экспериментальную женщину в маленькую чашку Петри (описанную в разделе 4) в 15:00 (ZT 6) и дать ей 1 час для акклиматизации на спаривающую арену.
    2. Настройте экспериментальный блок (описанный в разделе 1) следующим образом:
      1. Включите свет, то есть светодиоды белого света в 12-часовом 12-часовом светло-темном цикле, подключенные к таймеру, который включаетСвет в 09:00 (ZT0) и непрерывные светодиоды красного света, позволяющие контролировать мухи во время темной фазы эксперимента. Включите вентиляторы, чтобы ограничить нагрев шкафа источником света и обеспечить, чтобы избыточные запахи вентилировались вне испытательной зоны.
      2. Подключите камеры веб-камеры к компьютеру и запустите их с помощью программного обеспечения для мониторинга изображения.
      3. Для каждой камеры задайте фокус, яркость и масштабирование программного обеспечения для мониторинга.
        1. Щелкните правой кнопкой мыши на экране камеры, откройте «свойства камеры» и откройте «автоматическую фокусировку». Отрегулируйте «фокус», чтобы уточнить сетку или любые письменные слова на листе бумаги. При необходимости измените «яркость» и «увеличение».
      4. Установите программу программного обеспечения для мониторинга, чтобы захватить 1 изображение каждые 2 минуты. Щелкните правой кнопкой мыши на каждом экране камеры и выберите «изменить камеру», а затем «Действия». Нажмите, чтобы начать действия «При регулярном intErvals "и измените время на« 2 минуты ». Выберите« Take Photo »для выполнения выбранных действий и, наконец, нажмите« ok ».
      5. Щелкните правой кнопкой мыши на каждом экране камеры и выберите «начать мониторинг».
    3. Через 1 ч (при ZT 7) переведите самеца дикого типа в чашку Петри с помощью пипетки для рта, поместите блюдо на листы бумаги формата A4 под камерами веб-камеры и нажмите «начать мониторинг» в течение 24 часов. Для эксперимента с воздушным насосом поместите блюдо таким образом, чтобы выход пипетки был подключен к входному отверстию спаривающейся арены.
    4. Чтобы проанализировать поведение спаривания пары, сделайте следующее.
      1. Выберите и откройте все изображения в программном обеспечении для просмотра изображений и просмотрите их в хронологическом порядке.
      2. Запишите дату, номер эксперимента, номер блюда и время начала в таблицу в той же строке. Возьмите время начала каждой арены с момента ее размещения под веб-сайтомМ камерой. Запишите метку времени с изображений.
      3. Отметьте время начала каждой совокупности в одной строке в таблице. Подсчитайте спаривание как инцидент, когда самец установил самку, а пара остается умеренно неподвижной и в той же позе, по крайней мере, для пяти последовательных кадров (10 мин).
        ПРИМЕЧАНИЕ. Этот критерий основан на сообщенной длине спаривания, от 12 до 27 минут в D. melanogaster , и наблюдении, что совокупление 10 минут и более плодородное 27 , 28 .
      4. Подсчитайте количество совокупностей для каждой строки в электронной таблице, чтобы определить частоту спаривания. В качестве альтернативы, вычесть время начала эксперимента с момента первого спаривания для каждой строки в качестве меры спаривания или вычесть время первого спаривания с момента второго спаривания как мера восстановления латентности.
        1. Чтобы вычислить латентность восстановления, убедитесь, чтоОпределить даты первого и второго спаривания как последовательные дни в программном обеспечении для работы с электронными таблицами.
      5. Проанализируйте данные с помощью моделей смешанных эффектов, предполагая нормальное распределение данных и включая дату эксперимента как случайный фактор, используя статистическое программное обеспечение (см. Таблицу материалов) для определения статистической значимости независимых переменных - пищевой среды, Тип воздуха и взаимодействие - как описано выше 5 .
      6. Выберите лучшую объясняющую модель, выполнив обратное устранение несущественных независимых переменных с использованием тестов отношения правдоподобия и связанной с ними информации Akaike. После запуска модели визуально проверьте остатки данных, чтобы подтвердить нормальность. Подтвердите однородность дисперсий, используя тест Levene. В случае неравной однородности, квадрат-корень преобразует данные.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Используя этот непрерывный анализ, поведение спаривания и частоту спаривания в конкретных условиях, можно определить в экспериментальных условиях окружающей среды. Чтобы контролировать условия окружающей среды, мы превратили кухонный шкаф из нержавеющей стали в испытательную зону с собственным источником света и диффузией, что обеспечивает высокий уровень света и минимальное количество бликов с верхушки спаривающих арен ( рис. 1А ) , Внутренняя испытательная площадка пол...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает анализ для проверки поведения спаривания в течение 24 часов, непрерывно контролируя экологические сигналы, которые гипотетическая пара предполагает использовать для определения частоты спаривания. Можно увеличить частоту спаривания в ответ на воздух дрожжей, подаваемый через систему сжатого воздуха, когда среда содержит дрожжи ( рис. 2B ). Кроме того, аналогичный ответ на частоту спаривания можно наблюдать с помощью упрощенной пищевой среды, содержащей только агар, пептон и уксус...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет конкурирующих интересов для раскрытия.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим Bloomington Drosophila Stock Center за запасы мух; C. Gahr, JT Alkema и S. van Hasselt за их раннюю попытку разработать анализ сжатого воздуха; Джаспер Босман за советом по выращиванию дрожжей; И Rezza Azanchi и Joel Levine для первоначального развития временного мониторинга поведения спаривания Drosophila . JA Gorter поддерживалась грантом программы выпускников BCN / NWO по исследованиям Neuroscience Research School. Эта работа была частично поддержана голландской организацией по научным исследованиям (NWO) (ссылка: 821.02.020) JC Billeter.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
<прочный>Шкаф
Кухонный шкаф из нержавеющей сталиHorecaworld7412.0105
Белые светодиодыLucky Lightll-583wc2c-001Холодный белый, 20 мА и 2 В
Красные светодиодыLucky Ligtll-583vc2c-v1-4daДлина волны от 625 нм, 20 мА до 6 В
РезисторRoyal OhmCFR0W4J0561A50560 Ом, 0,25 Вт, 250 В и допуск 5 %
Приложение для смартфона ЭкспонометрPatrick GiudicelliИзмеритель света/люкса FREE, версия 1.1.1
Таймер питанияAlectoTS-121
Металлические кронштейныОстрый угол 5 на 5 мм,   2 x 5450 и 1 x 1100 мм длиной
Пластина1190 x 545 x 5 мм
Фильтровальная бумага листыLEE фильтры220Белый иней
Малый вентиляторNanoxia Глубокая тишина426028529282880 мм Сверхтихий вентилятор для ПК, 1200 об/мин
Большой вентиляторNanoxia Глубокая тишина4260285292910120 мм Сверхтихий вентилятор для ПК, 650-1500 об/мин
Веб-камера для веб-камерыLogitech950270B910 HD OEM, Угол: 78 градусов, разрешение: 5 миллионов пикселей;  
Программное обеспечение для камерыDeskShareОхранный монитор pro
Название<strong>CompanyНомер в каталоге>Комментарии
Выращивание мух
Бутылки для выращивания мухFlystuff32-1306 унций Дрозофила сток флакон
FlypadFlystuff59-114
МухиCanton-S
Флаконы для выращивания мухDominique Dutscher789008Drosophila tubes узкие 25x95 мм
ИнкубаторSanyoMIR-154
Магнитная горячая пластинаHeidolph505-20000-00MR Hei-Standard
AgarCaldic Ингредиенты B.V.010001.26.0
ГлюкозаГезонд wel1019155Dextrose/Druivensuiker
SucroseVan GilseСахарный песок
Кукурузная мукаFlystuff62-100
Зародыши пшеницыGezond& wel1017683
Соевая мукаFlystuff62-115
ПатокаFlystuff62-117
Активные сухие дрожжиRed Star
TegoseptFlystuff20-258100%
Пептон (bacto)BD211677
уксусная кислота Merck1000631000ледяная, 100%
Маленькая петридинаGreiner bio-one62710235 x 10 мм с вентиляционными отверстиями
Парафиновая пленкаBemis NAParafilm
Название<strong>Company<strong>Каталожный номерКомментарии
Установка дрожжей и сжатого воздуха
Большой петридинГосселинBP140-01140 x 20,6 мм
Ультрачистая водаMillipore corporationMiliQ
Дрожжевой экстрактBD212750
Агар (чистый)BD214530bacto
Глюкоза (0(+)-глюкоза моногидрат)  Merck18270000004
Открытые кепкиSchott29 240 28 ГЛ45
Силиконовая перегородкаVWR548-0662
Фитинги для колючей переборкиNalgene6149-0002
Большой диаметр трубки: внешний 1,2 см и внутренний 0,9 см
Малый диаметр трубки: внешний 0,8 см и внутренний 0,5 см
Трубка 15 млНасос Falcon
AquariumSera precisionSera air 110 plus, AC 220-240 В, 50/60 Гц, 3 Вт и давление >100 мбар
Активированный угольSuperfishA8040400Norit активированный уголь
Одноразовый фильтрующий блокWhatman10462100
Серологические пипеткиVWR612-1600
ШприцBD Plastipak300013
Горячий клейPattex
Шприцевой фильтрWhatmanFP 30/размер пор 0,45 мм CA-S
Название<strong>CompanyНомер в каталоге<strong>Комментарии
>Analysis
Statistics softwareRlme4 package
1190 x 1100 мм из матового стекла дикого типа из ПВХ из ПВХ

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hileman, S. M., Pierroz, D. D., Flier, J. S. Leptin nutrition, and reproduction: timing is everything. J. Clin. Endocrinol. Metab. 85 (2), 804-807 (2000).
  2. Grosjean, Y., et al. An olfactory receptor for food-derived odours promotes male courtship in Drosophila. Nature. 478 (7368), 236-240 (2011).
  3. Harshman, L. G., Hoffman, A. A., Prout, T. Environmental effects on remating in Drosophila melanogaster. Evolution. 42 (2), 312-321 (1988).
  4. Fricke, C., Bretman, A., Chapman, T. Female nutritional status determines the magnitude and sign of responses to a male ejaculate signal in Drosophila melanogaster. J. Evol. Biol. 23 (1), 157-165 (2010).
  5. Gorter, J. A., Jagadeesh, S., Gahr, C., Boonekamp, J. J., Levine, J. D., Billeter, J. -C. The nutritional and hedonic value of food modulate sexual receptivity in Drosophila melanogaster females. Sci. Rep. , 1-10 (2016).
  6. Wigby, S., et al. Insulin signalling regulates remating in female Drosophila. Proc. Biol. Sci. 278 (1704), 424-431 (2011).
  7. Ribeiro, C. The dilemmas of the gourmet fly: the molecular and neuronal mechanisms of feeding and nutrient decision making in Drosophila. Front. Neurosci. 7, 1-13 (2013).
  8. Walker, S. J., Corrales-Carvajal, V. M., Ribeiro, C. Postmating circuitry modulates salt taste processing to increase reproductive output in Drosophila. Curr. Biol. 25 (20), 2621-2630 (2015).
  9. Hussain, A., Üçpunar, H. K., Zhang, M., Loschek, L. F., Grunwald Kadow, I. C. Neuropeptides modulate female chemosensory processing upon mating in Drosophila. PLoS Biol. 14 (5), e1002455-e1002428 (2016).
  10. Avila, F. W., Sirot, L. K., LaFlamme, B. A., Rubinstein, C. D., Wolfner, M. F. Insect seminal fluid proteins: identification and function. Annu. Rev. Entomol. 56 (1), 21-40 (2011).
  11. Laturney, M., Billeter, J. C. Neurogenetics of female reproductive behaviors in Drosophila melanogaster. BS:ADGEN. 85, Elsevier. 1-108 (2014).
  12. Liu, H., Kubli, E. Sex-peptide is the molecular basis of the sperm effect in Drosophila melanogaster. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 100 (17), 9929-9933 (2003).
  13. Ram, K. R., Wolfner, M. F. Sustained post-mating response in Drosophila melanogaster requires multiple seminal fluid Proteins. PLoS gen. 3 (12), 2428-2438 (2007).
  14. Yapici, N., Kim, Y. -J., Ribeiro, C., Dickson, B. J. A receptor that mediates the post-mating switch in Drosophila reproductive behaviour. Nature. 451 (7174), 33-37 (2008).
  15. Yang, C. -H., et al. Control of the postmating behavioral switch in Drosophila females by internal sensory neurons. Neuron. 61 (4), 519-526 (2009).
  16. Häsemeyer, M., Yapici, N., Heberlein, U., Dickson, B. J. Sensory neurons in the Drosophila genital tract regulate female reproductive behavior. Neuron. 61 (4), 511-518 (2009).
  17. Rezával, C., Pavlou, H. J., Dornan, A. J., Chan, Y. -B., Kravitz, E. A., Goodwin, S. F. Neural circuitry underlying Drosophila female postmating behavioral responses. Curr. Biol. , 1-11 (2012).
  18. Haussmann, I. U., Hemani, Y., Wijesekera, T., Dauwalder, B., Soller, M. Multiple pathways mediate the sex-peptide-regulated switch in female Drosophila reproductive behaviours. Proc. Biol. Sci. 280 (1771), 20131938-20131938 (2015).
  19. Krupp, J. J., et al. Social experience modifies pheromone expression and mating behavior in male Drosophila melanogaster. Curr. Biol. 18 (18), 1373-1383 (2008).
  20. Billeter, J. C., Jagadeesh, S., Stepek, N., Azanchi, R., Levine, J. D. Drosophila melanogaster females change mating behaviour and offspring production based on social context. Proc. Biol.l Sci. 279 (1737), 2417-2425 (2012).
  21. Krupp, J. J., Billeter, J. -C., Wong, A., Choi, C., Nitabach, M. N., Levine, J. D. Pigment-dispersing factor modulates pheromone production in clock cells that influence mating in Drosophila. Neuron. 79 (1), 54-68 (2013).
  22. Imhof, M., Harr, B., Brem, G., Schlötterer, C. Multiple mating in wild Drosophila melanogaster revisited by microsatellite analysis. Mol. Ecol. , 915-917 (1998).
  23. Ochando, M. D., Reyes, A., Ayala, F. J. Multiple paternity in two natural populations (orchard and vineyard) of Drosophila. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 93 (21), 11769-11773 (1996).
  24. Becher, P. G., et al. Yeast, not fruit volatiles mediate Drosophila melanogaster attraction, oviposition and development. Func. Ecol. 26 (4), 822-828 (2012).
  25. Montell, C. Drosophila visual transduction. Trends Neurosci. 35 (6), 356-363 (2012).
  26. Ejima, A., Griffith, L. C. Assay for courtship suppression in Drosophila. Cold Spring Harbor Prot. 2011 (2), 5575(2011).
  27. Crickmore, M. A., Vosshall, L. B. Opposing Dopaminergic and GABAergic Neurons Control the Duration and Persistence of Copulation in Drosophila. Cell. 155 (4), 881-893 (2013).
  28. Bretman, A., Fricke, C., Chapman, T. Plastic responses of male Drosophila melanogaster to the level of sperm competition increase male reproductive fitness. Proc. Biol. Sci. 276 (1662), 1705-1711 (2009).
  29. Dukas, R., Jongsma, K. Costs to females and benefits to males from forced copulations in fruit flies. Anim. Behav. 84 (5), 1177-1182 (2012).
  30. Yorozu, S., et al. Distinct sensory representations of wind and near-field sound in the Drosophila brain. Nature. 457 (7235), 201-205 (2009).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Drosophila Mating BehaviorEnvironmental CuesReproductive BehaviorsBehavioral AssayFood Medium PreparationChemosensory SystemsMating FrequencyPressurized Air SystemVolatile CompoundsFemale Receptivity

Related Articles