Методическая статья

Перезапуск нейронных цепей: новый метод быстрого наращивания нейритов и функционального нейронного соединения

DOI:

10.3791/55697

⸱

13 июня 2017 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Physics, McGill University, 2Department of Neurology and Neurosurgery, Montreal Neurological Institute, 3Ananda Devices

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта процедура описывает, как быстро инициировать, расширять и связывать нейриты, организованные в микрожидкостных камерах, с использованием покрытых поли-D-лизином гранул, закрепленных на микропипетках, которые направляют удлинение нейритов.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мозг и повреждение спинного мозга могут привести к постоянной нетрудоспособности и смерти, поскольку еще невозможно восстановить нейроны на большие расстояния и точно восстановить их с подходящей целью. Здесь описывается процедура быстрого инициирования, удлинения и точного соединения новых функциональных нейронных цепей на большие расстояния. Достигнутые скорости распространения достигают более 1,2 мм / ч, в 30-60 раз быстрее, чем скорости in vivo наиболее быстро растущих аксонов из периферической нервной системы (0,02-0,04 мм / ч) 28 и в 10 раз быстрее, чем сообщалось ранее для того же Нейронного типа на ранней стадии развития 4 . Во-первых, выделенные популяции нейронов гиппокампа крысы выращиваются в течение 2-3 недель в микрожидкостных устройствах для точного позиционирования клеток, что позволяет легко микроманипулировать и экспериментальную воспроизводимость. Затем бисер, покрытый поли-D-лизином (PDL), помещают на нейриты для образования адгезивного продолженияАкты и микроманипуляция пипеткой используются для перемещения полученного в результате комплекса шариков-нейритов. Когда шарик перемещается, он вытягивает новый нейрит, который может быть увеличен на сотни микрометров и функционально связан с клеткой-мишенью менее чем за 1 час. Этот процесс позволяет экспериментальную воспроизводимость и легкость манипулирования, минуя более медленные химические стратегии для индуцирования роста нейритов. Предварительные измерения, представленные здесь, демонстрируют темпы роста нейронов, значительно превышающие физиологические. Объединение этих нововведений позволяет точно установить нейронные сети в культуре с беспрецедентной степенью контроля. Это новый метод, который открывает дверь для множества информации и информации о передаче сигналов и коммуникации в нейронной сети, а также является игровой площадкой, в которой можно исследовать пределы роста нейронов. Потенциальные применения и эксперименты широко распространены с прямыми последствиями для терапии, целью которой является воссоединение нейроныЛ после травмы или при нейродегенеративных заболеваниях.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Повреждения центральной центральной нервной системы (ЦНС) взрослых могут привести к постоянной нетрудоспособности из-за множественных механизмов, которые ограничивают рост аксонов 1 . После травмы многие аксоны ЦНС не образуют новый конус роста и не могут установить эффективный регенеративный ответ 2 . Кроме того, повреждение и рубцовая ткань, окружающие поражения ЦНС, значительно ингибируют рост аксонов 1 , 2 , 3 . Современные методы лечения регенерации ЦНС после травмы были сосредоточены на усилении собственного потенциала роста поврежденного нейрона и на маскировке ингибиторов аксонального расширения, связанных с мусором миелина и глиальным рубцом 1 , 3 . Несмотря на это, способность регенерировать длинные аксоны к отдаленным объектам и формировать соответствующие функциональные синапсы по-прежнему сильно ограничена 4 , 5 , 6 , 7 .

В настоящей работе микробазы, микроманипуляция пипеткой и микрожидкостные устройства используются для быстрого инициирования, удлинения и точного соединения новых функциональных нейронных цепей на большие расстояния. Предыдущие работы показали, что гранулы с поли-D-лизином (PDL-шарики) индуцируют мембранную адгезию, за которыми следует кластеризация комплексов синаптических везикул и образование функциональных пресинаптических бутонов 8 . Было также показано, что когда PDL-шарик механически оттягивается после пресинаптической дифференциации, синаптический белковый кластер следует за бортом, инициируя новый нейрит 9 . Следующая процедура использует этот факт наряду с возможностью культивирования эмбриональных нейронов гиппокампа крыс в организованные области на покровное стекло с использованием микрожидкостных устройств с использованием полидиметилсилоксана (PDMS) для точной перемотки нейронацепи.

Эти микрофлюидные устройства PDMS нетоксичны, оптически прозрачны и состоят из двух камер, соединенных системой микроканалов. После сборки на покровное стекло каждое устройство служит в качестве формы для направления роста нейронов и поддержания здоровых нейронных культур на точных рисунках более 4 недель in vitro .

Здесь представлена ​​структура, в которой исследуются пределы расширения и функциональности нового нейрита. Новые, функциональные нейриты создаются и позиционируются для управления (re) проволочными нейронными сетями. Достигнутые скорости расширения превышают 20 мкм / мин на расстояниях в миллиметрах и устанавливаются функциональные соединения. Эти результаты неожиданно показывают, что внутренняя способность этих нейритов к удлинению намного быстрее, чем считалось ранее. Этот предлагаемый механический подход обходит медленные химические стратегии и обеспечивает контролируемое соединение с конкретной мишенью. ThЭто технология открывает новые возможности для исследования in vitro новых методов лечения для восстановления связи нейронов после травмы. Он также позволяет манипулировать и перестраивать нейронные сети для исследования фундаментальных аспектов обработки сигналов нейронов и нейронной функции in vitro .

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все процедуры, описанные ниже, были одобрены Комитетом по уходу за животными Университета Макгилла и соответствовали руководящим принципам Канадского совета по уходу за животными.

1. Стандартизация нейронных культур с использованием микрожидкостных устройств: сборка устройства

  1. Выберите подходящее микрожидкостное устройство для желаемого эксперимента. Чтобы подключить нейроны к одной и той же популяции, используйте Neuro Devices ( рис. 1 ), и для подключения нейронов в разных популяциях используйте Co-Culture Devices ( рис. 6 ).
  2. Очистите и подготовьте необходимое количество стерильных покровных или стеклянных донных блюд. Для достижения наилучших результатов на пластиковых поверхностях используйте 35-миллиметровые блюда, на стекле можно использовать покровные по 25 мм или 35-миллиметровые стеклянные донные блюда. Выберите толщину стекла на основе системы формирования изображения, например 0,15 мм.
  3. Покройте посуду или покровные стекла 0,5-1 мл 100 мкг / мл PDL в течение 2 ч или в течение ночи при комнатной температуреature.
    Примечание. Протокол можно приостановить здесь и при необходимости возобновить на следующий день. Кроме того, посуда может быть покрыта боратным буферным разбавленным PDL, поли-L-лизином (PLL), ламинином или любой другой молекулой адгезии клеток.
  4. Вымойте посуду дважды водой (не используйте фосфатно-буферный солевой раствор (PBS), так как кристаллы соли могут блокировать каналы), удалите всю жидкость и дайте ей высохнуть в стерильной среде, такой как шкаф для биобезопасности, в течение 5-10 мин или до Поверхность полностью сухая.
    Примечание. Будьте осторожны, чтобы покровные стекла были абсолютно сухими, так как любая оставшаяся жидкость будет мешать прилипанию микрожидкостных систем.
  5. Поместите микрожидкостные устройства с рисунками, направленными вверх под УФ-светом, в стерильную среду (шкаф для биобезопасности) в течение 10 мин. Обязательно соблюдайте стерильные процедуры при работе в шкафу 10 биобезопасности.
  6. Используя пинцеты, поместите микрожидкостное устройство с рисунком, направленным вниз, в контакт с чистой крышкойф / блюдо. Используйте пинцет, чтобы мягко нажать на устройство так, чтобы оно прилипало к стеклу.
    Примечание: прозрачность прилипшей области будет видна при взгляде на свет. Убедитесь, что все углы контактируют с стеклом. Сделайте это на всех микрожидкостных устройствах. См . Рис. 1a .
  7. Чтобы заполнить однополярное устройство средой, наведите пипетку на каналы и добавьте 50 мкл полной клеточной среды, дополненной бессывороточной В-27 (объемное соотношение 1:50) и 500 мкг / мл пенициллина / стрептомицина / глутамина (в совокупности Называемый НБМ) в правую верхнюю лунку, а затем добавить еще 50 мкл в лунку, расположенную по диагонали к ней. Сделайте это для всех устройств, убедившись, что среда течет между скважинами. Затем добавьте 50 мкл среды к оставшимся 2 лункам. См . Рисунок 2a .
    1. Чтобы заполнить множественное популяционное устройство со средой, наведите пипетку на каналы и добавьте 30 мклОт полного NBM до нужных скважин, см . Рис. 6a . Сделайте это для всех устройств, убедившись, что среда течет между скважинами. Затем добавьте 50 мкл среды в остальные 4 лунки.
  8. Поместите устройства в большую пластину с открытой посудой с автоклавной водой (влажная камера) и поместите в инкубатор (37 ° C, 5% CO 2 и 95% влажность) в течение 1-2 часов при приготовлении культуры клеток. См . Рисунок 2b .

2. Нейроны покрытия в микрофлюидных системах

  1. Следуя протоколу, указанному в [ 8 , получают диссоциированные гиппокампы или корковые нейроны из эмбрионов крыс Sprague Dawley (по полу).
  2. Ресуспендируют эмбриональные нейроны в НБМ при концентрации 1-2 млн. Нейронов / мл. Проверьте концентрации клеток в микроскопе с помощью гемоцитометра и следующей ссылки 8 . Отрегулируйте концентрацию клетокГ до желаемой плотности клеток. Чтобы увеличить шансы получения одного аксона аксонов гиппокампа на канал, пластина 10 000 нейронов на устройство. Чтобы иметь несколько аксонов в одном и том же канале, наберите 60 000 нейронов на устройство.
    Примечание. Эти цифры варьируются в зависимости от используемого типа нейронов.
  3. Удалите среду из микрожидкостных устройств без опорожнения колодцев. Оставьте примерно по 5 мкл в каждом.
  4. Для пластинчатых клеток в едином популяционном устройстве добавьте 50 мкл NBM в нижнюю правую лунку. В этот момент среда течет сама по себе, чтобы заполнить другую нижнюю яму. Добавьте 20 мкл раствора ячейки концентрата в верхнюю правую лунку микрожидкостного устройства, как показано на рисунке 1b .
    1. Для пластинчатых клеток в множественном популяционном устройстве добавьте 20 мкл раствора раствора концентрата в каждую из правых лунок на фиг. 6а .
  5. Проверьте микроскоп, если ячейкиНаходятся внутри камер и помещают устройства в инкубатор в течение 15-30 минут для содействия прикреплению клеток к подложке.
  6. Проверьте микроскоп, если в камерах достаточно клеток. Если требуется больше, повторите шаги 2.4 и 2.5.
  7. Добавьте 50 мкл NBM в 2 верхние лунки одного попутного устройства и 20 мкл NBM в ту же самую лунку, в которую клетки были введены в устройство множественного населения. Средства массовой информации слегка выступают, образуя положительный мениск, придавая лункам верхний аспект булочки. Опять же, см . Рисунок 2a .
  8. Поддерживайте ячейки при 37 ° C, влажности 5% CO 2 и 95%.

3. Сохранение нейронных культур

  1. Удалите из ячеек NBM (примерно 30 мкл с пипеткой) и нанесите новый предварительно нагретый NBM на следующий день после их введения в устройства (то есть через 1 д после шага 2).
  2. Проверяйте каждые 2 дня, если в каждом канале достаточно среды. Если булочка tOp - это просто добавьте больше среды в верхние лунки.
  3. Культуральные клетки в течение по меньшей мере 7 дней перед удалением микрожидкостных устройств. Клетки могут выживать в этих устройствах в течение нескольких недель. Удалите устройства за 1-2 дня до проведения экспериментов на образцах.

4. Удаление микрожидкостных устройств

  1. 1 - 2 d перед удалением микрожидкостных устройств, добавьте 2 мл NBM, предварительно нагретого до 37 ° C, к каждой чашке для образца, затоплению камер и обслуживанию устройств в инкубаторе.
  2. Используйте стерильные пинцеты и один наконечник, чтобы удалить микрожидкостные устройства из покровных листьев, оставляя узорную конфигурацию нейронов. Используйте наконечник для удержания покровного на месте и пинцета, чтобы закрепить край устройства в нижнем левом углу колодца. Деликатно применяйте торсион, поднимая устройство с помощью пинцета, чтобы он отслаивался от покровного стекла. См . Рис. 2c - 2d .
  3. Каждые 2-3 дня замените гаВ НБМ до тех пор, пока образец не будет использован для экспериментов.
  4. Перед выполнением повторных экспериментов на образце убедитесь, что нейриты в каналах одного популяционного устройства и популяции нейронов в множественном популяционном устройстве изолированы, исследуя промежутки между ними в микроскопе, чтобы гарантировать отсутствие нитей, связывающих популяции нейронов.

5. Подготовка шариков с покрытием PDL

  1. Добавьте 2 x 50 мкл капли из 4, 10 или 20 мкм гранул полистирола, разбавленных в воде (1: 500), до 1 мл PDL (100 мкг / мл). Оставьте в течение не менее 2 часов при комнатной температуре.
    Примечание. Протокол можно приостановить здесь и возобновить на следующий день.
  2. Центрифугируют раствор при 8,820 мкг в течение 1 мин. Осторожно удалите супернатант, не нарушая бусины, накопленные на дне контейнера.
  3. Промойте бусины дважды 1 мл стерильного раствора 10 мМ HEPES pH 8,4.
  4. Ресуспендируют гранулы, покрытые PDL, в 200 мл 10 мМ HEPES pH 8,4решение.

6. Подготовка микропипетки

  1. Подготовьте пипетки из стеклянных капиллярных труб (внутренний диаметр 1 мм, внешний диаметр 1,5 мм) с помощью горизонтального съемника электродов. Отрегулируйте настройки, чтобы внешний наконечник вытащил микропипетку ~ 2-5 мкм. Перед вытягиванием убедитесь, что стеклянные трубки чистые.
  2. Фиксируйте пипетки на стеклянные слайды для хранения и убедитесь, что наконечник не контактирует с поверхностью слайда, так как наконечник является хрупким. Хранить при комнатной температуре в закрытом контейнере для защиты от пыли. Используйте пипетки в тот же день, когда их вытаскивают.

7. Адгезия PDL-шариков к нейронам

  1. Добавьте 40-60 мкл шариков с PDL-покрытием, полученных на стадии 5, в культуру клеток, приготовленную на стадии 4. Центрируйте наконечник пипетки над нейронами, которые слабо видны на покровном стекле, и добавьте шарики (см . Рисунок 3 ).
  2. Верните образец в инкубатор в течение 1 часа, чтобы способствовать образованию syНаптические контакты 8 , 9 .
  3. После инкубации удалите любые несвязанные бусины, осторожно промойте культуру предварительно нагретым NBM.

8. Подготовка физиологического раствора соли (для экспериментов с комнатной температурой)

  1. Подготовьте физиологический солевой раствор, объединив ингредиенты, перечисленные в ссылках 7 , 8 . Это должно регулировать клеточную среду вне инкубатора.
  2. Проверьте осмолярность и уровень рН, как указано в ссылках 7 , 8 .
  3. Непрерывно вводить раствор с O 2, чтобы минимизировать флуктуации рН при проведении экспериментов.
  4. Нагрейте до комнатной температуры.
  5. Настройте перфузионную систему, вставив один конец пластиковой трубки (необязательные размеры) в O 2 -инфузированное физиологическое решение и зафиксировав другое eИ иглу, вставленную в держатель образца. Поместите трубку и раствор выше образца (см . Рис. 4 ).
    1. Отсоедините трубку от иглы и подсоедините ее к шприцу. Используйте шприц, чтобы нанести давление и налить жидкость, заполнив трубку. Уплотните с помощью ролика и заново закрепите иглу.

9. Микроманипуляция бисером

  1. Установите образец в экспериментальной установке таким образом, чтобы к клеткам можно было получить доступ с помощью двух микропипеток, установленных в микроманипуляторах, и получить оптическое изображение ниже, например, с объективом 40X-фазы (числовая апертура 0,6) инвертированного оптического микроскопа. В этой конфигурации установите ПЗС-камеру для захвата изображения на боковой порт микроскопа. Подключите каждую пипетку к 1 мл шприцам через пластиковую трубку. На этом этапе замените НБМ физиологическим солевым раствором (1-2 мл) (см . Рисунок 4 ).
  2. Во время экспериментаНепрерывно продуцируют клетки физиологическим солевым раствором, приготовленным на стадии 8, со скоростью 0,5-1 мл / мин.
  3. Выберите PDL-шарик, не прикрепленный к нейрону в поле зрения. Совместите шарик с наконечником микропипетки, сфокусировавшись на шарике, затем до микропипетки. Принесите наконечник как можно ближе к шарику, проверив его через микроскоп.
  4. Примените отрицательное давление, используя 1 мл шприц, подключенный к пипетке, чтобы поднять шарик. Поддерживайте отрицательное давление в течение всего эксперимента.

10. Вытягивание нейритов

  1. Выберите шарик PDL, прикрепленный к нейрону в поле зрения, и прикрепите его ко второй микропипетке, используя всасывание, как описано в шагах 9.3-9.4.
  2. Потяните комплекс PDL-шарик-нейрон медленно (~ 0,5 мкм / мин), перемещая либо микроманипулятор, либо образец образца на 1 мкм, и паузу в течение 5 минут, чтобы инициировать нейриты.
  3. Повторите шаг 10.2 дважды.
    Примечание: первые 3 &# 181; m нужно тянуть очень медленно, чтобы гарантировать экспериментальный успех, который происходит в 95% случаев.
  4. Потяните комплекс PDL-шарик-нейрон медленно (~ 0,5 мкм / мин), перемещая либо микроманипулятор, либо образец образца на 2 мкм, и паузу в течение 5 минут, чтобы удлинить удлинение нейрита.
  5. После успешного инициирования и расширения нейритов на первые 5 мкм потяните нейрит со скоростью 20 мкм / мин на миллиметровые расстояния.
    Примечание: Тяги могут выполняться непрерывно или поэтапно и с разной скоростью. См . Рисунок 5b -5c .

11. Подключение нейронов

  1. Выберите регион, богатый нейритами, и опустите комплекс PDL-шарик-нейрит, чтобы он физически связался с ним. Используйте другие бусины для измерения высоты наконечника над поверхностью покровного стекла. См . Рис. 5d .
  2. Оставьте комплекс PDL-шарик-нейрит в контакте с целевым нейритом, манипулируя вторым микропомPette. Опустите вторую пипетку со вторым шариком PDL поверх новообразованного нейрита около 20 мкм из первого шарика. Используйте второй PDL-шарик, чтобы подтолкнуть новую нивритную нить к целевой клетке.
  3. Держите оба бусинки на месте в течение как минимум 1 часа. Проверьте отсутствие фокальной опухоли, утолщение нейритов, контактирующих с бортом, с микроскопом 16 .
  4. В течение этого времени используйте перфузию для медленного изменения среды образца от физиологического раствора до предварительно нагретого СО 2 -эквилибрированного NBM.
  5. Отпустите шарик со второй пипетки, высвободив всасывание. Если новый нейрит остается прикрепленным, отпустите также первый шарик. См . Рис. 5е .
  6. Аккуратно удалите солевой раствор и замените NBM (~ 2 мл).
  7. Осторожно поместите образец обратно в инкубатор, чтобы усилить нейронное соединение для будущих экспериментов. Это соединение стабильно в течение> 24 ч 7 .

12. Проверка функциональности нового соединения с помощью цельноклеточных фиксированных зажимных зажима

  1. Следуйте рекомендациям 7 , 18 , 19 . Для сборки электрофизиологической установки.
  2. Следуйте рекомендациям 7 . Для подготовки пред- и постсинаптических электродов.
  3. Соберите данные зажима паттерна, снова следуя ссылкам 18 , 19 .
  4. Сравните результаты с естественными сигналами 7, чтобы определить тип соединения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эмбриональные нейроны гиппокампа крысы культивируют в микрожидкостных устройствах, чтобы обеспечить точное позиционирование клеток, PDL-шариков и микроманипуляторов. Первый шаг - правильно собрать микрожидкостное устройство на стеклянном покровном стекле или блюде. Очень важно, чтобы микрожидкостное устройство было хорошо прикреплено к подложке, чтобы избежать попадания ячеек из камер и перемещения под частями устройства, которые должны быть запечатаны ( рис. 1а

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Используя стандартную микроманипуляцию и инновационные микрожидкостные устройства, был разработан новый метод для быстрого инициирования, удлинения и точного соединения новых функциональных нейронных цепей на больших расстояниях. Микроманипуляция пипеткой является обычным инструментом в большинстве нейронаучных лабораторий 4 , 13 . Реальной задачей достижения воспроизводимых и надежных результатов была стандартизация здоровых, точно позиционированных нейронных к...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Автор Margaret H Magdesian является генеральным директором Ananda Devices, который выпускает инструменты, используемые в этой статье.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы хотели бы поблагодарить Yoichi Miyahara за многие полезные обсуждения и идеи. MA и PG признают финансирование со стороны НСУРК.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Устройства для совместного культивированияAnanda DevicesКоммерчески доступны в http://www.anandadevices.com
Neuro devicesAnanda DevicesКоммерчески доступны в http://www.anandadevices.com
No. 1 Стеклянный покровный лист 25 мм круглыйWarner Instruments64-0705
35 мм Стеклянные донные тарелки #0, без покрытия, гамма-облученныйMatTex IncorporationP35G-0-20-C
Чашка для клеточных культур 35 мм, Непирогенная, СтерильнаяCorning Inc430165
95 мм x 15 мм Чашка Петри, Съемная крышка, Стерильный полистиролFisherbrandFB0875714G
50 мл Центрифужные пробирки с напечатанными градуировками и плоскими колпачкамиVWR89039-656
15 мл Полипропиленовая коническая трубка, 17 x 120 мм, Непирогенный, СтерильныйСокол
Neurobasal MediumLife Technologies21103-049Внеклеточный раствор
Добавка В-27 (50X), бессывороточнаядобавка B-27 (50X), бессывороточная17504044внеклеточный раствор
пенницилин, стрептомиоцин, глутаминThermo Fisher Scientific 11995-065Раствор внеклеточный
200 L ПипеткиVWR89079-458
2 - 20 μ L ДозаторыАэрозольные Устойчивые Наконечники2149P
BD Falcon 3mL Трансферные пипетки [Нестерильные]BD Falcon357524
ГлюкозаGibco15023-021Внеклеточный раствор
HEPESSigma7365-45-9Внеклеточный раствор/шарики
NaClSigma-Aldrich7647-14-5Внеклеточный раствор
KClSigma-Aldrich7447-40-7Внеклеточный раствор
CaCl2Sigma-Aldrich10043-52-4Внеклеточный раствор
MgCl2Sigma-Aldrich7786-30-3Внеклеточный раствор
5 Dumont Dumostar Пинцет 11 смWorld Precision Instruments500233
Инструменты для вскрытияBraun, Aesculap
Poly-D-лизин гидробромидSigma-AldrichP6407
Микрочастицы на основе полистирола, 10 мкм; mSigma-Aldrich72986
Боросиликатные трубкиKing Precision Glass, Inc.14696-2
Горизонтальный съемник пипетокSutter InstrumentsКоричнево-пылающие
, серия PCS-5000InstrumentsMC7600R
1 мл шприцBD Luer-Lok309628
инвертированный микроскопOlympus IX71
ОбъективOlympusUIS2, LUCPLFLN 40X
ПЗС-камераФотометрияКаскад II: 512
Лейбовиц (1x) L-15 MediumLife Technologies11415-064Препарирование крыс
Typsin-EDTA (0,05%), Phenol redLife Technologies25300054Диссекция
крысDMEM (1x) Модифицированная орлиная среда Дульбекко [+4,5 г/л D-глюкозы, + L-глутамина, + 110 мг/л пирувата натрия]Life Technologies11995-065Препарирование крыс
HBSS (1x) Сбалансированный раствор соли Хэнка [- хлорид кальция, - хлорид магния, - сульфат магния]Life Technologies14170-112Вскрытие крыс
352097# микроманипуляторы P-97 SD

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chew, D. J., Fawcett, J. W., Andrews, M. R. The challenges of long-distance axon regeneration in the injured CNS. Prog. Brain. Res. 201, 253-294 (2012).
  2. Bradke, F., Fawcett, J. W., Spira, M. E. Assembly of a new growth cone after axotomy: the precursor to axon regeneration. Nat. Rev. Neurosci. 13 (4), 189-193 (2012).
  3. Aguayo, A. J., et al. Synaptic connections made by axons regenerating in the central nervous system of adult mammals. J. Exp. Biol. 153, 199-224 (1990).
  4. Lamoureux, P., Ruthel, G., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. Mechanical tension can specify axonal fate in hippocampal neurons. J Cell Biol. 159 (3), 499-508 (2002).
  5. Goslin, K., Banker, G. Experimental observations on the development of polarity by hippocampal neurons in culture. J Cell Biol. 108 (4), 1507-1516 (1989).
  6. Dotti, C. G., Sullivan, C. A., Banker, G. A. The Establishment of polarity by hippocampal neurons in culture. J. Neurosci. 8 (4), 1454-1468 (1988).
  7. Magdesian, M. H., et al. Rapid mechanically controlled rewiring of neuronal circuits. J. Neurosci. 36 (3), 979-987 (2016).
  8. Lucido, A. L., et al. Rapid assembly of functional presynaptic boutons triggered by adhesive contacts. J. Neurosci. 29 (40), 12449-12466 (2009).
  9. Suarez, F., Thostrup, P., Colman, D., Grutter, P. Dynamics of presynaptic protein recruitment induced by local presentation of artificial adhesive contacts. Dev. Neurobiol. 73, 1123-1133 (2013).
  10. General Laboratory Techniques. An Introduction to Working in the Hood. JoVE Science Education Database. , JoVE. Cambridge, MA. https://www.jove.com/science-education/5036/an-introduction-to-working-in-the-hood (2016).
  11. Strober, W. Monitoring cell growth. Curr Protoc Immunol. A-3A, (2001).
  12. Beaudoin, G. M. 3rd, et al. Culturing pyramidal neurons from the early postnatal mouse hippocampus and cortex. Nat. Protoc. 7 (9), 1741-1754 (2012).
  13. Bray, D. Axonal growth in response to experimentally applied mechanical tension. Dev. Biol. 102, 379-389 (1984).
  14. Lamoureux, P., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. Axonal outgrowth of cultured neurons is not limited by growth cone competition. J. Cell Sci. 111, 3245-3252 (1998).
  15. Pfister, B. J., Bonislawski, D. P., Smith, D. H., Cohen, A. S. Sketch-grown axons retain the ability to transmit active electrical signals. FEBS Lett. 580, 3525-3531 (2006).
  16. Magdesian, M. H., et al. Atomic force microscopy reveals important differences in axonal resistance to injury. Biophys. J. 103 (3), 405-414 (2012).
  17. Polleux, F., Snider, W. Initiating and growing an axon. CSH Persp. Biol. 2 (4), 001925(2010).
  18. Debanne, D., et al. Paired-recordings from synaptically coupled corticol and hippocampal neurons in acute and cultured brain slices. Nat. Protoc. 3, 1559-1568 (2008).
  19. Qi, G., Radnikow, G., Feldmeyer, D. Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings. J. Vis. Exp. (95), e52358(2015).
  20. Harrison, R. G. On the origin and development of the nervous system studied by the methods of experimental embryology. Proc. R. Soc. Lond. B. , 155-196 (1935).
  21. Weiss, P. Nerve patterns: the mechanics of nerve growth. Growth 5 (Suppl. Third Growth Symposium). , 153-203 (1941).
  22. Gray, C., et al. Rapid neural growth: calcitonin gene-related peptide and substance P-containing nerves attain exceptional growth rates in regenerating deer antler. Neurosci. 50 (4), 953-963 (1992).
  23. Heidemann, S. R., Bray, D. Tension-driven axon assembly: a possible mechanism. Front. Cell Neurosci. 9, (2015).
  24. Bray, D. Axonal growth in response to experimentally applied tension. Dev. Biol. 102, 379-389 (1984).
  25. Heidemann, S. R., Buxbaum, R. E. Mechanical tension as a regulator of axonal development. Neurotoxicology. 15, 95-107 (1994).
  26. Heidemann, S. R., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E. Cytomechanics of axonal development. Cell Biochem. Biophys. 27 (3), 135-155 (1995).
  27. Pfister, B. J., Iwata, A., Meaney, D. F., Smith, D. H. Extreme stretch growth of integrated axons. J. Neurosci. 24 (36), 7978-7983 (2004).
  28. Waxman, S. G., Kocsis, J. D. The axon: structure, function and pathophysiology. , Oxford University Press, USA. (1995).
  29. Cho, E. Y., So, K. F. Rate of regrowth of damaged retinal ganglion cell axons regenerating in a peripheral nerve graft in adult hamsters. Brain Res. 419, 369-374 (1987).
  30. Davies, A. M. Intrinsic differences in the growth rate of early nerve fibres related to target distance. Nature. 337, 553-555 (1989).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Dwhole cell patch clamp

Похожие статьи