Этот протокол описывает метод выделения и культивирования метанефрических зачатков из эмбрионов мыши.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Диссекция и культура мышей эмбриональной почки
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Цель этого протокола - описать метод вскрытия, выделения и культивирования метанефрических рудиментов мыши.
Во время развития почки млекопитающих две ткани-предшественники, уретеровая почка и метанефрическая мезенхима, общаются и взаимно индуцируют клеточные механизмы, чтобы в конечном итоге сформировать систему сбора и нефроны почки. Поскольку эмбрионы млекопитающих растут внутриутробно и поэтому недоступны для наблюдателя, была разработана культура органов. С помощью этого метода можно изучать эпителиально-мезенхимальные взаимодействия и клеточное поведение во время органогенеза почек. Кроме того, можно исследовать происхождение врожденных пороков развития почек и урогенитального тракта. После тщательного вскрытия метанефрические рудименты переносятся на фильтр, который плавает на питательной среде и может храниться в инкубаторе для культивирования клеток в течение нескольких дней. Однако необходимо знать, что условияИскусственно и может влиять на обмен веществ в ткани. Кроме того, проникновение испытываемых веществ может быть ограничено из-за внеклеточного матрикса и базальной мембраны, присутствующих в эксплантате.
Одним из главных преимуществ органной культуры является то, что экспериментатор может получить прямой доступ к органу. Эта технология дешевая, простая и допускает большое количество модификаций, таких как добавление биологически активных веществ, изучение генетических вариантов и применение передовых методов визуализации.
Введение
Почка млекопитающего происходит от двух первичных структур мезодермального происхождения: трубчатой эпителиальной мочеточниковой почки и метанефрической мезенхимы. Во время нефрогенеза мочеточниковая почка проникает в метанефрическую мезенхиму и разветвляется, образуя систему сбора. Метанефрическая мезенхима дает начало эпителиальным элементам нефронов. Эти процессы происходят точно по времени и пространственно координируются и инициируются взаимными индуктивными механизмами. Оба компонента ткани взаимодействуют друг с другом и влияют на морфогенез клеток.
В 1920-х годах именно Бойден выполнил in vivo обструкцию мезонефрического ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Мышей поддерживали в соответствии с законодательством Швеции и законодательством Европейского Союза (2010/63 / ЕС). Все процедуры были выполнены в соответствии с указаниями Шведского комитета по этике (разрешения C79 / 9, C248 / 11 и C135 / 14). Процедуры в Гейдельбергском университете по животным предметам были одобрены Regierungspräsidium Karlsruhe и сотрудниками отдела охраны животных в Гейдельбергском университете.
1. Подготовка реагентов и материалов для культуры
ПРИМЕЧАНИЕ. Используйте ламинарный вытяжной колпак, чтобы свести к минимуму загрязнение.
- В день диссекции один только Fc-кластер доко....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Метанефринный почковый анлаген получали из беременных черных-6 инбредных мышей в E11.5 и культивировали. Через 3 дня зачаток мочеточника разветвлялся до 5 раз, что приводило к разрастанию первоначально Т-образного уретрового зачатка. Каждый эксплантов фотографировали, а количество сегментов и конечных точек определяли количественно для определения ветвящихся генераций и для расчета количества конечных точек на ветку ( рисунок 1 ). ImageJ (четвертое поколение, 4 -е
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
В этой рукописи описывается метод выделения развивающегося метанефрического анлагена из эмбриона мыши и культивирования зачатки органа. Этот метод является стандартной методикой, разработанной Grobstein 8 и Saxén 9 , 10 , и был адаптирован и модифицирован многими другими 11 , 12 . Успех метода зависит главным образом от продолжительности диссекции, так как выживаемость эксплантов .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Авторы благодарят Лейфа Оксбурга и Дерека Адамса за щедрое распространение своих знаний, Лейфа Оксбурга за полезные комментарии к рукописи, Стефана Вёльфля и Ульрике Мюллер за их техническую поддержку и Саскию Шмиттекерт, Джулию Гобберт, Сашу Вейер и Виолу Майер за помощь в лаборатория Эта работа была поддержана Отделом Развития, Компанией Биологи (CP).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 21331020 | |
| пенициллин-стрептомицин (10 000 ЕД/мл) | Thermo Fisher Scientific | 15140148 | |
| добавка GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| DPBS, кальций, магний | Thermo Fisher Scientific | 14040117 | применение для диссекции |
| голо-трансферрина человека | Sigma-Aldrich | T0665 | |
| Инсулин-трансферрин-селен (ИТС-G) (100x) | Thermo Fisher Scientific | 41400045 | |
| Параформальдегид | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| раствор амфотерицина B | Sigma-Aldrich | A2942 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Азид натрия | Sigma-Aldrich | S8032 | |
| Тимеросал | Sigma-Aldrich | T5125 | |
| Пропилгаллат | Sigma-Aldrich | 2370 | |
| Mowiol 4-88 | Sigma-Aldrich | 81381 | |
| Глицерин | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Биотинилированный Dolichorus biflorus Agglutinin | Vector Laboratories | B-1035 | |
| Alexa488 конъюгированный стрептавидин | Jackson Immuno Research | 016-540-084 | |
| Рекомбинантный мышиный белок Ephrin-B2 Fc Chimera, CF | R& D Systems | 496-EB | |
| Рекомбинантный человеческий IgG1 Fc, CF | R& D Systems | 110-HG-100 | |
| козий античеловеческий IgG Fc антитела | R& D Systems | G-102-C | |
| Фосфатные буферные таблетки | Sigma-Aldrich | P4417 | использование для фиксации и иммуноокрашивания |
| Dumont #5, наконечники biologie , INOX, 11 см | agnthos.se | 0208-5-PS | 2 пары щипцов необходимы |
| Ножницы радужной оболочки, прямые, 12 см | agnthos.se | 03-320-120 | |
| Перевязочные щипцы, прямые, нежные, 13 см | agnthos.se | 08-032-130 | |
| Чашки Петри Nunclo Delta обработанные | Thermo Fisher Scientific | 150679 | |
| TMTP01300 Isopor Мембранный фильтр, поликарбонат, гидрофильный, 5.0 &; m, 13 мм, белый, простой | MerckMillipore | TMTP01300 | |
| Nunclon Multidish 4 лунки, плоское дно | Sigma-Aldrich | D6789-1CS | |
| Покровное стекло микроскопа толщиной 24 x 50 мм. No.1.5H 0.17+/-0.005 мм | nordicbiolabs | 107222 | |
| Чехлы No1.5, 18 мм x 18 мм | nordicbiolabs | 102032 | |
| Слайды ~76 x 26 x 1, 1/2-w. грунтовые гладкие гладкие | nordicbiolabs | 1030418 | |
| VWR Лезвия для бритвы | VWR | 55411-055 | |
| 50 мл центрифужные пробирки | Sigma-Aldrich | CLS430828 | |
| центрифужные пробирки 15 мл | Sigma-Aldrich | CLS430055 | |
| Whatman качественная качественная фильтровальная бумага, марка 113V, крепированная | Sigma-Aldrich | WHA1213125 | |
| Фиксированная сцена исследовательский микроскоп | Olympus | BX61WI | |
| Black 6 инбредных мышей, самец, C57BL/6NTac | Taconic | B6-M | |
| Black 6 инбредных мышей, самка, C57BL/6NTac | Taconic | B6-F | |
| Стереомикроскоп Leica | Leica | S6 E |
Ссылки
- Saxén, L. Organogenesis of the kidney. Developmental and Cell Biology Series. 19, Cambridge University Press. (1987).
- Lindström, N. O., et al. Integrated β-catenin, BMP, PTEN, and Notch signalling patterns the nephron. eLife. 4, e04000(2015).
- Peuckert, C., ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
