Роман объект признание тест для расследования обучения и памяти у мышей

Summary

Объект признание тест (ОРТ) — простой и эффективный анализ для оценки обучения и памяти у мышей. Методология описана ниже.

Abstract

Объект признание тест (ОРТ) — часто используемые поведенческих assay для расследования различных аспектов обучения и памяти у мышей. ОРТ достаточно прост и может быть завершена в течение 3 дней: день привыкания, учебный день и тестирования день. Во время обучения, мышь может исследовать 2 идентичных объектов. На день тестирования один из объектов, подготовку заменяется Роман объекта. Потому что мышей имеют врожденное предпочтение новизны, если мышь признает знакомый объект, он будет тратить большую часть своего времени на объекте роман. Вследствие этого врожденного предпочтения нет необходимости для положительного или отрицательного подкрепления или долго график обучения. Кроме того ОРТ, также могут быть изменены для многочисленных приложений. Интервал хранения может быть сокращен до изучения краткосрочной памяти или удлинен до зонд долговременной памяти. Фармакологическое вмешательство может использоваться в разное время до обучения, после тренировки, или до отзыва для расследования различных этапов обучения (т.е., приобретение, рано или поздно консолидации или отзыве). В целом ОРТ является относительно низким уровнем стресса, эффективный тест памяти у мышей и подходит для обнаружения нейропсихологических изменений после фармакологических, биологических или генетических манипуляций.

Introduction

Объект признание испытание (ОРТ), также известный как Роман объект признание (NOR), является относительно быстрым и эффективным средством для тестирования различных этапов обучения и памяти у мышей. Он был первоначально описано Эннасëр и Delacour в 1988 году и используется главным образом в крыс¹; Однако, с тех пор, он был успешно адаптирован для использования в мышей^2,3,4,5,6,7. Тест основан на всего лишь трех сессий: один привыкания сессии, одной учебной сессии и сессии один тест. Обучение просто включает в себя визуальные исследования двух идентичных объектов, в то время как сеанс теста включает в себя замену одного из ранее разведанных объектов с объектом роман. Потому что грызуны имеют врожденное предпочтение новизны, грызунов, что помнит знакомый объект будет тратить больше времени, изучение Роман объект^7,8,9.

Основным преимуществом ОРТ над другими грызунов памяти испытаний является, что он опирается на природные склонности грызунов для изучения новизна⁸. Таким образом нет необходимости для многочисленных учебных занятий или любое положительное или отрицательное подкрепление мотивировать поведение. Это означает, что ОРТ является гораздо менее напряженный, относительно других тестов^{10,11,12,13,14,15}и требует значительно меньше времени для выполнения, чем другие часто используемые памяти испытаний, например Моррис воды лабиринт или Барнс лабиринт, который может занять до недели или больше. Следовательно условия ОРТ больше напоминают те, которые используются в изучении человеческого познания, увеличивая экологические действия теста на многих других грызунов памяти испытаний. Аналогичным образом потому что ОРТ является простой визуальный отзыв, он был успешно адаптирована для использования в многочисленных видов, включая человека и нечеловеческих приматов, для оценки различных аспектов межвидовой декларативная память ^{2,16 ,17}. Наконец ОРТ может быть легко модифицирована для изучения различных этапов обучения и памяти (то есть, приобретение, консолидации или отзыве), для оценки различных видов памяти (например, пространственной памяти), или для оценки различных удержания интервалы (т.е., краткосрочных против долговременной памяти).

Универсальность ОРТ обеспечивает платформу для бесчисленных исследований приложений. Исследования можно сделать использование фармакологических агентов либо нарушить или расширения памяти. Меняя время введения препарата до или после тренировки или до начала испытаний может намек на основе нейронных механизмов, которые приводят к нарушается или расширение памяти^{6,18,19, 20}. Аналогичным образом, optogenetic технологии могут быть использованы в этих же различные моменты времени взглянуть на нейронных активации/торможение, которое вносит свой вклад на различных этапах обучения и памяти. ОРТ подходит также для оценки различий в трансгенных животных, в исследованиях поражения, нейродегенеративных модели или старение исследования^{21,,2223,24, 25 , 26 , 27 , 28}. времени между обучения и тестирования, известный как интервал хранения, могут быть изменены для оценки любого из этих изменений на краткосрочной и долгосрочной перспективе памяти²⁶. В конечном счете ОРТ может использоваться как инструмент для исследования фармакологических, генетические и неврологические изменения в учить и память, или эти инструменты могут использоваться для изучения на основе обучения и памяти в ОРТ.

Protocol

здесь все процедуры были представлены и одобрены животное уход и использовать Комитет и были проведены следующие руководящие принципы НИЗ.

1. Выбор объекта и экспериментальной установки

1. выберите объекты, которые отличаются достаточно легко подвергаются мышами, но имеют подобные степени сложности (текстуры, фигуры, патронирования цвета и яркости, и т.д.) для сведения к минимуму любых потенциальных индуцированной предпочтение объект, который может исказить результаты (см. Эннасер 2010 всеобъемлющее описание объекта выбор ⁷).
   1. Тест для врожденной предпочтения и дискриминации (см. шаги 2 & 3).
   2. Использования объектов, которые мыши размера или лишь немного больше для поощрения разведки ( рис. 1). Чтобы уменьшить индуцированных предпочтения, убедитесь, что мышей способны подняться на объекты или ни один объект, хотя способность подниматься на объекте может повысить интерес к исследованию (время, проведенное просто сидя на объекте не засчитывается время разведки.)
   3. Имеют по крайней мере 2 копии каждого объекта. Однако, чтобы свести к минимуму потенциальные сигналы запах во время тестирования, имеют по крайней мере 3 каждого объекта, дубликаты для обучения и один для тестирования.
   4. Использовать объекты, изготовлены из материала не разбиваемого, как потеря объекта из-за повреждения во время экспериментов может мешать непрерывности тестирования и потенциально причинить вред или ущерб животное.
   5. Тщательно очистить объектов до и между использованием (vol/vol 70% этиловом спирте соответствующего).
2. Свести к минимуму стресс яркого освещения, использовать диффузного, низкое освещение, с центром лабиринт освещается около 20 люкс. Используйте, температуры и влажности, аналогичные регулярные жилищных условий. Если мышь перемещаются из помещение для жилья в другой комнате для эксперимента, акклиматизироваться мышей их новую комнату для по крайней мере 1 h до использования каждый день.
3. Ручка мышей хорошо до обучения. Потому что тест опирается на естественную тенденцию грызунов для изучения новизны, уменьшайте любого стресса или тревоги от обработки, которые могут помешать их желание исследовать на арене и впоследствии объекты. В идеале, обрабатывать мышей 1 - 2 раза / день в течение по крайней мере 1 мин, 1-2 недели до начала испытаний ^{29 15 ,}.
4. Для главной арены, используйте камеру квадратный (около 40 cm х 40 cm х 40 cm) из белого или черного, не пористый пластик, контрастирует с цветом мыши. В качестве альтернативы использовать ed. круглой арены специально, при использовании тревожно мышей, которые могут сидеть в углах квадратных Арена, круглой арены может быть предпочтительнее поощрять произвольное поведение ^{18 , 30}.
   1. На учебный день, место 2 идентичных объектов по диагонали (т.е. один в углу NW и один в углу SE). Если объекты слишком легкие и могут быть перемещены с помощью мыши, закрепите их на пол. Съемный, монтаж хорошо зашпаклевать.
   2. Для тестирования день, используйте 3 ^rd копию каждого объекта поставить один знакомый объект и один роман объекта на той же диагонали как учебный день ( рис. 2).
   3. Противовес использование каждого набора объектов так, чтобы каждый объект используется в равной степени как знакомый объект и как объект роман. Кроме того противовес расположение Роман объекта для каждого из 4 углов арены. Не забудьте отметить, какой диагонали используется для которых животное так что Диагональ, используемых на день подготовки является то же самое, что и в день тестирования, для каждой мыши.
   4. Тщательно очистите аппарат и объекты для удаления запаха сигналы до и между использованием (vol/vol 70% этиловом спирте соответствующего).
5. Поместите камеру прямо над головой аппарата для оптимального представления разведки. Используйте программное обеспечение только с носа точка обнаружения для точного анализа. При использовании программного обеспечения, захватить фоновое изображение с объектами на месте до начала. В программном обеспечении, задать область исследования примерно 2-3 см вокруг объекта.
6. Для уменьшения помех экспериментатора, запись судебного разбирательства и оценка его позже. Слепой бомбардиром в экспериментальных условиях. Если вручную скоринга в ходе эксперимента, убедитесь, что экспериментатор более 1 метра от арены и не видны мыши.
   Примечание: Любое время мыши проводит сидя на объекте без активного вибриссов подметать или нюхать не считается время разведки.
Исследование
7. определить, когда мышь ' s шум указал к объекту и в течение 2-3 см объекта, с активной вибриссов подметать или нюхать. Не учитываются в любое время, сидя на объект без указания активной разведки.

2. Необходимые эксперименты пилот

1. тестирование для индуцированного предпочтения
   1. для привыкания, удалите мышь от его дома клетку и поместите его в середине открытой арене. Позволяет мыши, чтобы свободно исследовать на 5 мин
   2. На учебный день (T1), место 2 различных объектов в противоположных квадранта аппарата, (то есть, NW и SE углы). Удалите мышь от его дома клетку и поместите его в середине открытой арене. Разрешить свободное исследование на 10 мин
   3. Расчет индекса дискриминации. Если есть нет искусственных предпочтения, дискриминации индекс должен быть на или вблизи нуля. Любые объекты, которые отдают предпочтение не должны использоваться для ОРТ.
2. Тестирование для дискриминации способности
   1. для привыкания, удалите мышь от его дома клетку и поместите его в середине открытой арене. Позволяет мыши, чтобы свободно исследовать на 5 мин
   2. На тренировку (T1), место 2 идентичных объектов в противоположных квадранта. Поместите указатель мыши в центре арены и позволить мыши, чтобы исследовать на 10 мин
   3. На тестирование сессии (T2), место одного объекта, используемый во время T1 и один роман объект в противоположных квадранта (то есть, NW и SE углов). 60 мин после T1, поместите указатель мыши в центре арены и позволить свободное исследование на 10 мин
   4. Расчет индекса дискриминации. На 60 мин интервал сохранения, индекс дискриминация должна быть выше 0,25.

3. Экспериментальная процедура

1. 1. привыканием удалить мыши из его дома клетку и поместите его в середине открытой, пустая Арена. Позволяют бесплатно разведки арены за 5 мин. После того, как Главная клетка является пустым, сохранить его для использования в качестве клетке Холдинг следующий день.
   2. В конце 5 мин, удалите мышь и место в клетке Холдинг. Не вернуть его оригинальные Кейдж мыши, или это может повлиять на поведение остальных мышей испытываться.
   3. Тщательно промойте аппарат между мышей с использованием этанол 70% vol/vol.
      Примечание: Во время привыкания, тревоги подобное поведение может оцениваться путем расчета времени в центре (см. Прут & Belzung 2003 ³¹). Это полезный показатель, при рассмотрении времени T1. Выше тревога мышей может потребовать 10 мин сессии достичь минимального разведки критерий.
2. Обучение (T1)
   1. место два идентичных объектов в противоположных квадранта арены (т.е., Северный угол и угол SW).
   2. 24 ч после привыкания, удалите мышь от его дома клетку и поместите его в центре арены, равноудаленно от 2 идентичных объектов.
   3. Разрешить свободное исследование как минимум 5 минут. Если с помощью штамм мышей, которые известны своими низкая активность опорно-двигательного аппарата или разведки, (то есть, большинство мышей не достигают минимум 20 s разведки обоих объектов 5 мин, как отмечено в пилотных экспериментов или литературе), продлить испытательный до 10 мин для всех mic e в когорте.
   4. В конце судебного разбирательства, удалите мышь и место в клетке холдинга. После того, как Главная клетка является пустым, сохраните его для использования как клетка проведение испытаний день.
   5. Тщательно очистите аппарат и объекты между мышей с использованием этанол 70% vol/vol.
3. Испытания (T2)
   1. место один объект, используемый во время T1 (то есть, знакомый объект) и один роман объект в противоположных квадранта арены. Используйте тот же адрес используется во время T1 для каждой мыши.
   2. В T1 T2 интервал по выбору, удалите мышь из его дома клетку и поместить его в центр Арена, равноудаленно от знакомых и объект роман.
      Примечание: С интервалом хранения 24 ч, большинство мышей не смогут различать знакомые и Роман объект (обычно – 0,2 < d2 < 0.2, по сравнению с позитивного управления ³²). Если тестирование для ноотропных эффектов, используйте этот момент чтобы зондировать для улучшения памяти. Для проверки наличия дефицита памяти, используйте короткий интервал сохранения в любом месте между 20 мин до 4 ч, в зависимости от штамма мыши.
   3. Позволяют свободное исследование за 10 мин. В конце судебного разбирательства, удалите мышь и место в клетке Холдинг.
4. Для T1 и T2, оценка первые 5 мин. Если мышь не отвечают минимальным разведки время 20 s для обоих объектов, по-прежнему забил за 5 мин до тех пор, пока общая Разведка превышает 20 s.

4. Анализ данных

1. 1. Критерии исключения как во время обучения (T1) и тестирования (T2), рассчитать время общей разведки для обоих объектов для каждой сессии (e1 и e2). Большинство мышей должен достичь минимального разведки, общей для обоих объектов 20 s на 5 минут
   2. Продлить T1 и T2 времени до 10 мин для штаммов мышей, которые имеют низкий разведки и не отвечают этому критерию минимального 5 мин, как отмечалось в ходе пилотного тестирования.
   3. Оценка поведения для 5 минут или за 5 мин до тех пор, пока они достигают 20 минимальный критерий s.
   4. Если мышь не достигают 20 s минимум разведки для обоих объектов T1 или T2 в 10 мин, исключить из анализа, как не может быть подтверждено, они провели достаточно времени изучению различать узнать /.
2. Против абсолютной сравнительный анализ
   Примечание: различные формулы для анализа и их отношения друг с другом можно увидеть в таблице 1.
   1. Расчет e1 как время общей разведки во время обучения 2 идентичных объектов, где А1 и А2 являются идентичными объектами.
      e1 = a1 + a2
   2. Вычислить e2 как время общей разведки во время тестирования для объекта знакомый объект (а) и Роман (b).
      e2 = b +
   Объект
   3. d1 вычислить просто как время, проведенное изучение Роман минус время осмотру знакомый объект. Мера абсолютной дискриминации (d1) не учитывает различия в разведке время между мышей или лечения групп, хотя в определенных обстоятельствах, это может быть более чувствительным меру ².
      d1 = b a
   4. Расчет d2 как время, проведенное изучение объекта Роман минус время осмотру знакомый объект, деленному на время всего исследования. Наиболее часто используемые мера — это значение относительно дискриминации, часто упоминается как индекс дискриминации (d2), который не зависит от различий в разведке время. Это означает, что все значения будут падать от -1 до + 1.
      d2 = d1/e2
   5. Кроме того, рассчитать признание или предпочтения индекс (d3) ³. Это время, проведенное изучение объекта роман, деленное на общее время. Это означает, что будут падать все значения между 0 и 1. Он часто умножается на 100 и используется как значение в процентах.
      d3 = b/e2 * 100
3. Статистический анализ
   1. с использованием средней дискриминации значений для каждой группы, определить производительность памяти, используя односторонний дисперсионный анализ. Для дальнейшего анализа, сделать двусторонний пост Специального сравнения с группами положительный/отрицательный контроль и лечение против состояние.

Results

Общая экспериментальной установки для ОРТ показан на рисунке 2. На привыкание день (T0) мышах размещены на пустой арене для 5 минут двадцать четыре часа позже, мышей помещают обратно в камере с 2 идентичных объектов и позволено свободно исследовать для до 10 мин (T1). На тестирование день (T2), мышей снова помещен в арене, но с одним знакомым и один роман объектов и позволили исследовать для до 10 мин. Интервал хранения, время между T1 и T2, может изменяться,...

Discussion

ОРТ — эффективный и гибкий метод для изучения, обучения и памяти у мышей. При настройке эксперимента, важно рассмотреть ряд переменных, которые могут повлиять на результат. Как обсуждалось в результатах представительных, штамм мыши будут влиять на оба интервал времени и удержания разведки. Сокращение времени Разведка может привести к искажению или маски приводит к абсолютной дискриминации анализ^2,3,5,

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Open Field Box	Panlab/Harvard Apparatus	LE800SC	доступен в сером, белом или черном цвете
ANY-maze	Stoelting Co.	60000	Система слежения за
поведением EthoVisionXT 12	Noldus	Система слежения за
Видеокамера	Любая		видеокамера должна быть установлена непосредственно над аппаратом
70% этанола;	Fisher Scientific	BP2818-4	Перед началом испытаний и в перерывах между испытаниями каждый объект должен быть тщательно очищен. Пол и стены аппарата также должны быть очищены.