Дифференцирование хондроцитов из периферических кроветворных человеческих индуцированных плюрипотентных стволовых клеток

Краткое содержание

Мы представляем протокол для получения хондрогенной линии из периферической крови человека (PB) через индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSCs) с использованием метода без интеграции, который включает образование эмбриоидного тела (EB), расширение фибробластических клеток и хондрогенную индукцию.

Аннотация

В этом исследовании мы использовали клетки периферической крови (PBC) в качестве семенных клеток для получения хондроцитов через индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSC) в методе без интеграции. После образования эмбриоидного тела (EB) и расширения фибробластических клеток iPSCs индуцируются для хондрогенной дифференцировки в течение 21 дня в условиях без сыворотки и без ксенонов. После индукции хондроцитов фенотипы клеток оценивают с помощью морфологических, иммуногистохимических и биохимических анализов, а также путем количественного анализа ПЦР в реальном времени маркеров хондрогенной дифференцировки. Хондрогенные гранулы показывают положительное синее голубое и толуидиновое окрашивание синим. Иммуногистохимия окрашивания коллагена II и X также положительна. Содержание сульфатированного гликозаминогликана (sGAG) и маркеры хондрогенной дифференцировки COLLAGEN 2 ( COL2 ), COLLAGEN 10 ( COL10 ), SOX9 и AGGRECAN значительно повышены в хондРогенных гранул по сравнению с hiPSCs и фибробластическими клетками. Эти результаты показывают, что PBC могут использоваться в качестве семенных клеток для создания iPSC для восстановления хряща, который является специфичным для пациента и экономически эффективным.

Введение

Хрящевая ткань обладает очень низкой способностью к самовосстановлению и регенерации. Различные хирургические вмешательства и биологические методы лечения используются для восстановления функции хряща и суставов с неудовлетворительными результатами. Недавняя разработка технологии стволовых клеток может изменить всю область восстановления хряща ¹ . Различные стволовые клетки изучались как семенные клетки, но человеческие индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (hiPSCs), по-видимому, являются наиболее перспективным выбором, поскольку они могут обеспечить многие типы специфичных для пациента клеток, не вызывая реакции отторжения ² . Кроме того, они могут преодолеть ограниченную пролиферативную природу взрослых клеток и сохранить свои способности к самообновлению и плюрипотентности. Более того, генный нацеливание может использоваться для изменения генотипа для получения конкретных типов хондроцитов.

Фибробласты широко используются для создания iPSC, потому что их перепрограммирующие потенциалы также хорошо изучены.Тем не менее, все еще есть некоторые ограничения, которые необходимо преодолеть, такие как болезненная биопсия у пациентов и необходимость расширения фибробластов in vitro , что может привести к мутациям гена ³ . Недавно было обнаружено, что PBCs выгодны для перепрограммирования ⁴ ; Кроме того, они обычно использовались и содержались в большом количестве. Возможно, они могут перенаправить фокус исследования с кожи. Однако, насколько нам известно, имеется несколько сообщений о перепрограммировании PBC с последующей дифференциацией на хондроциты.

В текущем исследовании мы используем PBC как альтернативный источник, перепрограммируя их в iPSC, а затем дифференцируя iPSCs в хондрогенную линию через систему культивирования гранул, чтобы имитировать образование хондроцитов.

Протокол

Протокол генерации hiPSCs из PBC можно найти в нашем предыдущем исследовании ⁵ . Исследование было одобрено Советом по институциональному обзору нашего учреждения.

1. Образование эмбриоидного тела (EB)

1. Сделайте 50 мл среды hiPSC: нокаут Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) с добавлением 15% нокаутной сыворотки (KSR), 5% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 1 × несущественных аминокислот, 55 мкМ 2-меркаптоэтанола, 2 мМ L -глутамина и 8 нг / мл основного фактора роста фибробластов (bFGF).
2. Сделайте 50 мл среды образования ЕВ: DMEM с добавлением 15% KSR, 5% FBS, 1x несущественных аминокислот, 55 мкМ 2-меркаптоэтанола и 2 мМ L-глутамина.
3. Получают 50 мл основной питательной среды: DMEM с добавлением 20% FBS, 1 × несущественных аминокислот, 55 мкМ 2-меркаптоэтанола и 2 мМ L-глутамина.
4. Подготовьте 10 мл раствора для дозирования, 1 мг / мл в нокаут DMEM.
5. CultuRe hiPSCs на 60-миллиметровые чашки для культивирования ткани с питающими клетками ( т.е. монослоем облученных клеток эмбриональных фибробластов мыши). Когда клетки сходятся на 80-90%, отключите клетки, чтобы распределить и пропустить hiPSC 1: 3 каждые 4-5 дней. Поместите клетки в 37 ° C и 5% CO ₂ инкубатора.
6. Рассеивайте недифференцированные колонии hiPSC на более мелкие кусочки (диаметром около 50-100 мкм), используя иглу из огнеупорного стекла, когда iPSCs сливаются на 80-90%. Как правило, используйте колонии hiPSC в 60-миллиметровой чашке для генерирования EB в чашке Петри 100 мм.
   1. Культура менее 100 небольших кусочков колоний в 100-миллиметровой не-придерживающейся чашке Петри, содержащей 10 мл среды образования ЕВ. Поместите посуду в инкубатор 37 ° C и 5% CO ₂ .
7. Заменяйте приблизительно 25% исходной среды равным количеством базальной культуральной среды каждые 2 дня. Наклоните блюдо, чтобы позволить EBs успокоиться. Тщательно удалите 3 млВерхней среды и добавить 4 мл свежей базальной культуральной среды. Не мешайте EB.
   ПРИМЕЧАНИЕ. EBs морфологически характеризуются кусками колоний, которые имеют округлый вид с плавными границами под микроскопом.
8. После 10 дней культивирования в неадгезивной чашке Петри нанесите новую 100-миллиметровую чашку для культивирования ткани с 4 мл 0,1% желатина в течение 30 мин при 37 ° С перед использованием.
9. Перенесите среду плюс ЭБ из 100-миллиметровой, не придерживающейся чашки Петри в 15-мл коническую трубку. Дайте осадкам ЭБ в течение 4-5 мин. Аспирируйте супернатант осторожно и оставьте менее 0,5 мл среды плюс EBs
10. Высевают менее 100 ЕВ на 100-миллиметровую чашку для культивирования ткани с желатином с 10 мл основной питательной среды. Поместите посуду в инкубатор 37 ° C и 5% CO ₂ .

2. Формирование клеточного гранулята и дифференциация хондроцитов

1. Сделайте 10 мл 0,25% трипсина / этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА). Сделайте 80 млКультуральную среду: DMEM с добавлением 20% FBS, 1x несущественных аминокислот, 55 мкМ 2-меркаптоэтанола и 2 мМ L-глутамина.
2. Сделайте 10 мл среды хондрогенной дифференцировки: DMEM (высокая глюкоза), дополненная 10% раствором инсулина-трансферрина-селена (ITS), 0,1 мкМ дексаметазона, 1 мМ аскорбиновой кислоты, 1% пирувата натрия и 10 нг / мл трансформирующего фактора роста - Beta 1 (TGF-β1).
3. Обновите среду 10 мл базальной культуральной среды через 48 часов. После этого обновляйте среду каждые три дня с помощью 10 мл основной питательной среды.
   ПРИМЕЧАНИЕ. Через 10 дней в культуре фибробластические клеточные выросты должны были расшириться от EB.
   1. Перед использованием наносите 100 мм посуду с 4 мл 0,1% желатина в течение 30 мин при 37 ° С. Удалите клеточный супернатант и промойте клетки с помощью фосфат-буферного солевого раствора Дульбекко (DPBS) один раз.
   2. Дай дайджест клеткам 3 мл 0,25% трипсина / ЭДТА при 37 ° С в течение 5 мин и нейтрализуйте 4 мL основной питательной среды.
4. Диссоциировать клетки в отдельные клетки путем пипетирования вверх и вниз в 5-10 раз и пропускания их через нейлоновую сетку 70 мкм. Центрифугируют клеточную суспензию при 200 мкг в течение 5 мин. Повторно засеивают клетки на новой 100-миллиметровой, покрытой желатином чашке для культивирования ткани с 10 мл основной питательной среды.
5. Обновите среду 10 мл базальной культуральной среды через 48 часов. После этого обновляйте среду каждые три дня с помощью 10 мл основной питательной среды.
   ПРИМЕЧАНИЕ. Клетки приобретают гомогенную, фибробластоподобную морфологию.
6. Когда достигается слияние ~ 90-100% ( т. Е. Около 5-7 дней), собирайте клетки с 3 мл 0,25% трипсина / ЭДТА при 37 ° С в течение 5 мин. Нейтрализуйте с помощью 4 мл основной питательной среды. Диссоциировать клетки в отдельные клетки путем пипетирования вверх и вниз 5 раз. Для подсчета количества клеток используйте гемоцитометр.
   1. Поместите 3 × 10 ⁵ клеток в 15-миллилитровую полипропиленовую трубку. Центрифуга при 200 мкгВ течение 5 мин при комнатной температуре (RT). Повторно суспендируйте клетки в 1 мл среды хондрогенной дифференцировки.
7. Повторно центрифугируйте клетки при 300 × g в течение 3 минут и поддерживайте клетки в форме мелких гранул. Поместите трубку в термостат 37 ° C и 5% CO _{2 в} течение 21 дня. Не плотно прикручивайте крышку и не дайте газообмену.
8. Заменяйте 3/4 культуральной среды каждые три дня свежей средой хондрогенной дифференциации.
   ПРИМЕЧАНИЕ. Через 21 день в культуре должны образовываться hiPSC-хондрогенные гранулы (hiPSC-Chon). Мезенхимальные стволовые клетки человека (MSC), как положительный контроль, также собирают и культивируют в среде хондрогенной дифференцировки в течение 21 дня с образованием хондрогенных гранул (hMSC-Chon).

3. Анализ хондрогенной дифференцировки

1. Подготовьте 10 мл 10% нейтрального буферного формалина.
2. Подготовьте 50 мл 0,1% синего голубого реагента и 50 мл 1% толуидинового синего реагента.
3. PrEpare 1 мл первичных антител: кроличьи поликлональные антитела против коллагена II (1:50) или мышиные моноклональные антитела против коллагена X (1:50). Кроме того, готовят антитела против кроликов или мыши.
4. Сделайте 1 мл раствора папаина: 10 ед / мл в PBS с 0,1 М ацетатом натрия, 2,4 мМ EDTA и 5 мМ L-цистеином.
5. Сделайте 100 мл диметилметиленового синего (DMMB) красителя: 100 мкл 16 мг / л 1,9-диметилметиленового синего, 40 мМ глицина, 40 мМ NaCl и 9,5 мМ HCl; PH 3,0.
6. Оценить хондрогенную дифференциацию по голубым синим и толуидиновым синим окраскам гранул.
   1. Закрепите одну таблетку hiPSC-Chon или гранулу hMSC-Chon в 1 мл 10% нейтрализованного буферным раствором формалина в течение 24 часов.
   2. Перенесите гранулу в 1 мл 70% этанола в H ₂ O. Дегидратируйте таблетку с 1 мл градуированной серии этанола ( то есть 25, 50, 75, 90, 95, 100 и 100%, 3 мин каждый).
   3. Уточнить таблетку в 1 мл 100% ксилола три раза. инфильтратE таблетка с парафином в течение 1 часа в печи с температурой 65 ° C. Вставьте гранулу в парафиновые блоки с основанием 7 x 7 x 5 мм ³ , следуя рутинным гистологическим процедурам ⁶ .
   4. Сделайте смежные секции микротомом толщиной около 4 мкм ⁷ . Прикрепите секции к стеклянным слайдам.
   5. Высушите слайды в течение 2 часов при температуре 60 ° C в духовке. Депарафинизировать секции в три цикла (по 3 мин каждый) с использованием 100% ксилола.
   6. Используйте уменьшающуюся спиртовую серию для регидратации ( то есть 100, 100, 95, 95, 70, 50 и 25% в H ₂ O, по 3 минуты каждый), а затем выполните окончательное промывание деионизированной водой в течение 5 минут.
   7. Процедите участки с 0,1% -ным синим жирным реагентом или окрашиванием 1% толуидинового синего в течение 4-5 ч, а затем промойте их дистиллированной водой.
   8. Обезвоживают с помощью градуированной серии этанола ( то есть 25, 50, 75, 90, 95, 100 и 100%, 3 мин каждый), а затем три последовательныхEps осветления в 100% ксилоле. Установите слайды и визуализируйте их под микроскопом.
7. Выполните иммуногистохимию.
   ПРИМЕЧАНИЕ. Дополнительные гранулы дополнительно оценивают с помощью иммуногистохимии.
   1. После депарафинизации и регидратации доведите слайды до кипения в 1 мМ ЭДТА, pH 8,0 (водонепроницаемый в воде, кипящей автоклавом). Дайте им посидеть в течение 8 минут при температуре подкисления, а затем дайте слайдам остыть при комнатной температуре.
   2. Промойте слайды деионизированной водой 3 раза. Инкубируйте секции в 3% растворе H ₂ O ₂ в метаноле при RT в течение 15 мин, чтобы блокировать активность эндогенной пероксидазы.
   3. Промойте слайды деионизированной водой и погрузите их в DPBS в течение 5 мин. Нанесите 50-100 мкл соответственно разбавленного (1:50) первичного антитела на секции на слайдах и затем инкубируйте их в увлажненной камере при комнатной температуре в течение 1 часа.
   4. Промойте слайды 3 раза (по 5 минут каждый) с DPBS. Инкубируйте саС помощью соответствующих вторичных антител ( т. Е. Против кролика или мыши) в течение 15 мин при комнатной температуре.
   5. Промойте слайды 3 раза (по 5 минут каждый) с DPBS. Выполните обнаружение DAB под микроскопом.
   6. Промойте слайды с DPBS 3 раза (по 2 минуты каждый). Противодействовать ядрам клеток, погружая слайды в гематоксилин в течение 1-2 мин. Обезвоживают с помощью градуированной серии этанола (25, 50, 75, 90, 95, 100 и 100%, 3 мин каждый), а затем три последовательных этапа осветления с помощью ксилола. Наконец, установите слайды и визуализируйте их под микроскопом.
8. Обнаружить содержание sGAG.
   1. Дайджест хондрогенных гранул в растворе папаина при 60 ° С в течение 2 часов.
   2. Определите содержание ДНК с использованием набора для анализа dsDNA и системы флуорометра. Измерьте содержание sGAG путем смешивания его с раствором красителя DMMB при измерении поглощения при 525 нм ⁸ .
   3. Рассчитайте концентрацию sGAG на стандартную кривуюАкула хондроитин сульфат.
9. Проведите ПЦР-анализ в реальном времени маркеров хондрогенной дифференцировки в гранулах hiPSC-Chon.
   1. Убирают 3-4 из тех же хондрогенных гранул путем добавления 500 мкл ледяного реагента для экстракции в одну пробирку. Вихрь тщательно. Инкубируйте образец в течение 5 мин при комнатной температуре.
   2. Добавить 0,1 мл хлороформа. Вверните образец в течение 15 с и инкубируйте его при комнатной температуре в течение 3 мин. Центрифугируйте образец в течение 15 минут при 12000 xg и 4 ° C. Перенесите верхнюю водную фазу (около 250 мкл) в новую 1,5 мл микроцентрифужную пробирку.
   3. Добавьте 25 мкл ацетата натрия и 1 мкл гликогена к образцу. Осаждайте РНК путем смешивания ее с 250 мкл изопропилового спирта. Тщательно перемешайте. Инкубируйте образец при комнатной температуре в течение 10 мин.
   4. Центрифугируют в течение 10 минут при 12000 xg и 4 ° C. Удалите супернатант полностью. Вымойте гранулу РНК дважды 500 мкл 75% этанола.
   5. Центрифуга в течение 5 минПри 7500 x g и 4 ° C. Удалите весь оставшийся этанол и высушите на воздухе гранулу РНК в течение 5-10 мин. Растворите РНК в 10 мкл свободной от нуклеазы воды.
   6. Преобразуйте РНК в кДНК с использованием системы обратной транскриптазы. Представьте образцы кДНК ПЦР в реальном времени с использованием основного набора компонентов qPCR (2x) и системы PCR в реальном времени ⁹ .
      ПРИМЕЧАНИЕ. Последовательности праймеров:
      H AGGRECAN -F: TCGAGGACAGCGAGGCC;
      H AGGRECAN -R: TCGAGGGTGTAGCGTGTAGAGA;
      H β-ACTIN -F: TTTGAATGATGAGCCTTCGTCCCC;
      H β-ACTIN -R: GGTCTCAAGTCAGTGTACAGGTAAGC;
      H COL2 -F: TGGACGATCAGGCGAAACC;
      H COL2 -R: GCTGCGGATGCTCTCAATCT;
      H SOX9 -F: AGCGAACGCACATCAAGAC;
      H SOX9 -R: CTGTAGGCGATCTGTTGGGG;
      H COL10 -F: ATGCTGCCACAAATACCCTTT;
      H COL10 -R: GGTAGTGGGCCTTTTGGTT.

Результаты

Хондрогенная дифференциация hiPSCs:

Среда для образования ЕВ и базальная культуральная среда использовались для дифференциации hiPSCs в мезенхимную линию. Использовался многоступенчатый метод культивирования ( рисунок 1 ). Во-первых, hiPSCs спонтанно дифференцировались через образование EB в течение 10 дней (D10; фиг. 2A ). Во-вторых, клетки выросли из EBs еще на 10 дней...

Обсуждение

Здесь мы предоставляем протокол для получения хондроцитов из PBC через iPSC. Поскольку ПБС более распространены и широко используются в клинической области, они представлены в качестве потенциальной альтернативы для перепрограммирования. В этом исследовании эписомальные векторы (EV) использовались для перепрограммирования PBC в iPSC, следуя методу, установленному Zhang et al. ¹¹ . Этот подход, основанный на интеграции, не включает интеграцию связанной с вирусом генотоксичности, которая, ...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Нокаут DMEM	Invitrogen	10829018	Базальная среда, используемая для культивирования иПСК и среды для формирования БЭ
Замена нокаут-сыворотки (KSR)	Инвитроген	10828028	Более определенная, не содержащая ФБС добавка-среда, используемая для культивирования ИПСК и среды для формирования БЭ
Фетальная бычья сыворотка (FBS)	Гиклон	sh30070.03	Используется для культивирования ИПСК и среды для формирования БЭ, обеспечивает отличное соотношение цены и качества для клеток. культура
Заменимые аминокислоты	Chemicon	TMS-001-C	Используется в качестве добавки роста во всех средах клеточных культур, для увеличения роста и жизнеспособности клеток
L-глутамин	Invitrogen	TMS-002-C	Аминокислота, необходимая для клеточной культуры
Основной фактор роста фибробластов (bFGF)	Peprotech	100-18B	Цитокин используется для поддержания плюрипотентности и самообновления ИПСК
Диспаза	Инвитроген	17105041	Используется для диссоциации иПСК в субкультуре
DMEM	Gibco	C11960	Базальная среда используется для культуральной среды МСК
0,1% желатина	Millipore	ES-006-B	Используется для прикрепления клеток к чашкам
0,25% трипсин/ЭДТА	Gibco	25200072	Используется для диссоциации клеток
DPBS	Gibco	14190250	Сбалансированный солевой раствор, используемый для промывки клеток или получения реагента
2-меркаптоэтанол	инвитрогена	21985023	Используется в качестве добавки роста во всех питательных средах клеток.
ИТС	инвитроген	41400045	инсулин, трансферрин, раствор селена.Используется для хондрогенной дифференцировки.
Аскорбиновая кислота	Sigma	4403	известна как витамин С. Он помогает в активном росте и обладает антиоксидантными свойствами.
Пируват натрия	Gibco	11360070	Добавляется в среду для культивирования клеток в качестве источника энергии в дополнение к глюкозе.
Трансформирующий фактор роста-бета-1	Peprotech	AF-100-21C	Цитокин, регулирующий пролиферацию, рост и хондрогенную дифференцировку клеток.
Кроличьи поликлональные антитела против коллагена II	Abcam	ab34712	Это антитело реагирует с коллагенами II типа, который специфичен для хрящевых тканей.
Мышиные моноклональные антитела к коллагену X	Abcam	ab49945	Это антитело реагирует с коллагеном типа X, который является продуктом гипертрофических хондротоцитов.
Permount	Fisher Scientific	SP15-100	Для монтажа и длительного хранения предметных стекол
Толуидин синий	Sigma	89640	Используется для обнаружения протеогликанов.
Альцианский синий	Amresco	#0298	Используется для обнаружения глюкозаминогликанов.
Папаин	Сигма	П4762-25МГ	Используется для переваривания хондрогенных гранул.
Диметилметиленовый синий	Sigma	341088-1G	Используется для количественного определения гликозаминоглян
Хондроитин сульфат натрия соли из акульего хряща	Sigma	C4384-250MG	Используется для построения стандартной кривой для измерения содержания sGAG.
Набор для анализа Qubit dsDNA HS	Invitrogen	Q32851 (100)	Используется для определения содержания ДНК
TRIzol	Invitrogen	15596018	Используется для выделения РНК из клеток
Система обратной транскриптазы	Promega	A3500	Используется для преобразования РНК в кДНК
SYBR FAST набор для количественной ПЦР Master	Mix Kapa	KK4601	Используется для ПЦР в реальном времени