В этом протоколе описаны способы очистки, количественного определения и характеризации внеклеточных везикул (EV) / экзосомы из неадгезивных / мезенхимальных эпителиальных клеток молочной железы и для их использования для передачи способности формирования молочной железы к эпителиальным клеткам просвета молочной железы. EVs / экзосомы, полученные из стволовых эпителиальных клеток молочной железы, могут передавать это свойство клеток клеткам, которые поглощают EV / экзосомы.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Перенос способности формирования молочной железы между базальными эпителиальными клетками молочной железы и люминальными клетками молочной железы через внеклеточные везикулы / экзосомы
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Клетки могут взаимодействовать через экзосомы, внеклеточные везикулы (ЭП) ~ 100 нм, содержащие белки, липиды и нуклеиновые кислоты. Внеклеточные везикулы из неадгезивных / мезенхимальных эпителиальных клеток молочной железы (NAMEC) могут быть выделены из среды NAMEC с помощью дифференциального ультрацентрифугирования. Основываясь на их плотности, EVs можно очистить ультрацентрифугированием при 110 000 x g. Препарат EV из ультрацентрифугирования может быть дополнительно отделен с использованием непрерывного градиента плотности для предотвращения загрязнения растворимыми белками. Затем очищенные EV могут быть дополнительно оценены с использованием анализа отслеживания наночастиц, который измеряет размер и количество везикул в препарате. Внеклеточные везикулы размером от 50 до 150 нм являются экзосомами. Выведенные NAMEC EVs / экзосомы могут проникать в эпителиальные клетки молочной железы, которые могут быть измерены с помощью проточной цитометрии и конфокальной микроскопии. Некоторые свойства стволовых клеток молочной железы ( например, способность к образованию молочной железы) могутПереносится из стеблеподобных NAMEC в клетки эпителия молочной железы через EVs / экзосомы, полученные из NAMEC. Отдельные первичные эпикатеральные эпителиальные клетки эритроцитарного эпителия EpCAM hi / CD49f не могут образовывать молочные железы после трансплантации в жировые подушки мыши, тогда как EpcAM lo / CD49f hi базальные эпителиальные клетки молочной железы образуют молочные железы после трансплантации. Приобретение EVM / экзосомы, полученных из NAMEC, EpcAM hi / CD49f lo, эпителиальные клетки просвета молочной железы позволяют им генерировать молочные железы после трансплантации в жировые подушки. EVs / экзосомы, полученные из стволовых эпителиальных клеток молочной железы, переносят способность образования молочной железы к EpCAM hi / CD49f ломовым эпителиальным клеткам молочной железы.
Введение
Экзосомы могут опосредовать клеточную связь путем переноса мембранных и цитозольных белков, липидов и РНК между клетками 1 . Было показано, что опосредованная экзосомами связь связана со многими физиологическими и патологическими процессами ( т. Е. С представлением антигена, развитием толерантности 2 и прогрессированием опухоли 3 ). Экзосомы часто имеют содержание, сходное с содержимым исходных клеток, высвобождающих их. Таким образом, экзосомы могут переносить определенные клеточные свойства из исходных клеток и переносить эти свойства на клетки, поглощающие их 4....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все исследования, связанные с животными, соответствовали протоколам, утвержденным Институциональным комитетом по уходу за животными.
1. Внеклеточное везикул / экзосомальная изоляция и валидация
- Культуральные эпителиальные базальные клетки молочной железы, NAMECs 4 , со свежей, бессывороточной средой, состоящей из 500 мл MCDB 170, pH 7,4 + 500 мл DMEM / F12 с бикарбонатом натрия (0,2438%); EGF (5 нг / мл); Гидрокортизон (0,5 мкг / мл); Инсулин (5 мкг / мл); Экстракт крупного рогатого скота (BPE, 35 мкг / мл); И GW627368X (1 мкг / мл) в чашках по 15 см.
- После подсчета клеток с гемоцитометром высе....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Поскольку было показано, что блокирование передачи сигналов PGE 2 / EP 4 инициирует высвобождение EV / экзосомы из базальноподобных стволовых клеток 4 молочной железы, эта работа представляет собой метод выделения индуцированных EVs / экзосом из культуры базальных клеток (NAMEC) молочной эпителии. Поскольку NAMEC культивируют в бессывороточной среде, ранее не существовало EVs / экзосомы, полученных из сыворотки 13 . Дл.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Экзосомы часто несут характеристики клеток, которые их высвобождают, а количество высвобожденных экзосом может индуцироваться стимулами 4 . Культуральную среду клеток можно собирать и подвергать дифференциальному ультрацентрифугированию для сбора EV / экзосомы ( рисунок 1 ). В настоящее время нет общего соглашения об идеальном методе выделения EVs / экзосом. Оптимальный способ, используемый здесь, был определен приложением 14 ниже по потоку. У.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Эта работа была поддержана грантами Национальных научно-исследовательских институтов здравоохранения (05A1-CSPP16-014, HJL) и Министерства науки и технологий (MOST 103-2320-B-400-015-MY3, HJL).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| MCDB 170 | USBiological | M2162 | |
| DMEM/F12 | Thermo | 1250062 | |
| ультрацентрифуга Optima L-100K | Beckman | 393253 | |
| ротор SW28 Ti | Beckman | 342204 | |
| ротор SW41 Beckman | 331306 | ||
| NANOSIGHT LM10 | Malvern | NANOSIGHT LM10 | для анализа отслеживания наночастиц (NTA) |
| Optiprep | Sigma-Aldrich | D1556 | 60% (w/v) раствор йодиксанола в воде (стерильный). |
| Антитело к CD81 | GeneTex | GTX101766 | 1:1,000 в 5% по объему обезжиренного сухого молока, 1x TBS, 0,1% Tween 20 при 4 ° C, ночевка |
| Антитела к CD9 | GeneTex | GTX100912 | 1:1,000 в 5% обезжиренного сухого молока, 1x TBS, 0,1% Tween 20 при 4 ° C, ночевка |
| Антитело к CD63 | Abcam | Ab59479 | 1:1,000 в 5% по сравнению с обезжиренным сухим молоком, 1x TBS, 0,1% Tween 20 при 4 ° C, ночевка |
| Антитело TSG101 | GeneTex | GTX118736 | 1:1,000 в 5% против обезжиренного сухого молока, 1x TBS, 0,1% Tween 20 при 4 ° C, ночевка |
| GAPDH | GeneTex | GTX100118 | 1:6,000 в 5% обезжиренного сухого молока, 1x TBS, 0,1% Tween 20 при 4 ° C, ночевка |
| CFSE (эфир карбоксифлуоресцеина сукцинимидилдиацетата) | Thermo | V12883 | |
| FACSCalibur | BD Biosciences | флуоресцентный клеточный анализатор | |
| коллагеназа типа IV | Термо | 17104019 | |
| трипсин | Термо | 27250018 | |
| ИТС | Сигма-Олдрич | I3146 | смесь рекомбинантного человеческого инсулина, человеческого трансферрина и селенита натрия |
| аккутазы | ebioscience | 00-4555-56 | натуральная смесь ферментов с протеолитической и коллагенолитической активностью |
| STEMCELL | 7913 | 5 мг/мл = 5 Ед/мл | |
| антитело против CD49f | Biolegend | 313611 | 1:50 |
| антитело против EpCAM | Biolegend | 118213 | 1:200 |
| FACSAria | BD Biosciences | сортировщик клеток | |
| кармин квасцы | Sigma-Aldrich | C1022 | |
| эпителиальные клетки молочной железы человека (клетки HMLE, NAMECs) | подарки от доктора Роберта Вайнберга | ||
| permount Thermo Fisher Scientific | SP15-500 | ||
| гидрокарбонат натрия | Zymeset | BSB101 | |
| EGF | Peprotech | AF-100-015 | |
| Гидрокоритон | Sigma-Aldrich | SI-H0888 | |
| Инсулин | Sigma-Aldrich | SI-I9278 | |
| BPE (экстракт гипофиза крупного рогатого скота) | Hammod Cell Tech | 1078-NZ | |
| GW627368X | Кайман | 10009162 | |
| 15 см блюдо для культуры | Falcon | ||
| настольная центрифуга | Eppendrof | 3415R | |
| пробирка | Beckman | 344058 | |
| PBS (фосфатно-солевой буфер) | Corning | 46-013-CM | |
| Анализ белка BCA | Thermo Fisher Scientific | 23228 | |
| Просвечивающая электронная микроскопия | Hitachi | HT7700 | |
| желатин | STEMCELL | 7903 | |
| 10 см чашка для культур | Falcon | ||
| 6-луночная чашка для культивирования | Corning | 3516 | |
| самка C57BL/6 мышей | NLAC (Национальный центр | ||
| FBS (сыворотка плода крупного рогатого скота) | BioWest | S01520 | |
| гентамицин | Thermo Fisher Scientific | ||
| Pen/Strep | Corning | 30-002-Cl | |
| DNase I | 5PRIMER | 2500120 | |
| изофторана | Галокарбон | NPC12164-002-25 | |
| формальдегид | MACRON | H121-08 | |
| EtOH (этанол) | J.T. Baker | 800605 | |
| ледяная уксусная кислота | Panreac | 131008.1611 | |
| сульфат алюминия | калия Sigma-Aldrich | 12625 | |
| ксилол | Leica | 3803665 | |
| 0.22 m мембраны | Merck Millipore | Millex-GP | |
| AUTOCLIP Wound Clips, 9 мм | BD Biosciences | 427631 | |
| AUTOCLIP Wound Clip Applier | BD Biosciences | 427630 | |
| CellMask™ Темно-красный | Thermo Fisher Scientific | C10046 | краска для плазматической мембраны |
Ссылки
- Simons, M., Raposo, G. Exosomes--vesicular carriers for intercellular communication. Curr Opin Cell Biol. 21 (4), 575-581 (2009).
- Théry, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nat Rev Immunol. 9 (8), 581-593 (2009).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
