Методическая статья

Перфузия DiI как метод сосудистой визуализации в Разное

DOI:

10.3791/55740

⸱

16 июня 2017 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Orthopedic Surgery, Harvard Medical School and Brigham and Women's Hospital, 2Division of Graduate Medical Sciences, Boston University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Используя липофильную методику окрашивания перхлоратом 1,1'-диоктадеци-3,3,3 ', 3'-тетраметилиндокарбоцианин (DiI), Ambystoma mexicanum может подвергаться сосудистой перфузии, что позволяет легко визуализировать сосудистую систему.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Методы перфузии использовались на протяжении веков для визуализации циркуляции тканей. Axolotl (Ambystoma mexicanum) - это вид саламандры, который стал важной моделью исследований регенерации. Мало что известно о том, как реваскуляризация возникает в контексте регенерации у этих животных. Здесь мы сообщаем простой способ визуализации сосудистой сети в аксолотле посредством перфузии перхлората 1,1'-диоктидаци-3,3,3 ', 3'-тетраметилиндокарбоцианина (DiI). DiI - липофильный карбоцианиновый краситель, который мгновенно встраивается в плазматическую мембрану эндотелиальных клеток. Перфузия осуществляется с использованием перистальтического насоса, так что DiI входит в циркуляцию через аорту. Во время перфузии краситель течет через кровеносные сосуды аксолотля и включается в липидный бислой сосудистых эндотелиальных клеток при контакте. Процедура перфузии занимает приблизительно один час для восьмидюймового аксолотля. Сразу после перфузии wiTh DiI, аксолотль можно визуализировать с помощью конфокального флуоресцентного микроскопа. DiI излучает свет в красно-оранжевом диапазоне при возбуждении зеленым флуоресцентным фильтром. Эта процедура перфузии DiI может быть использована для визуализации сосудистой структуры аксолотлей или для демонстрации моделей реваскуляризации в регенерирующих тканях.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Визуализация сосудистой сети играет важную роль в понимании структуры и функции организмов у многих видов. Изучены модели и графические представления об обращении с 16 -го века с Леонардо да Винчи 1 . Используя воски и резиновые формы, ткани были перфузированы для создания трехмерных моделей сосудистой сети, что позволило изучить органогенез и патогенез 1 , 2 . Смолы и воски окрашивались красителями , такими как индийские чернила или карминовые красные, чтобы обеспечить их легкую визуализацию 1 , 2 . Однако эти методы вызвали множество проблем, поскольку их высокая вязкость препятствовала полной перфузии интересующей ткани 1 . По мере того, как поле становилось все более изощренным, в него входило использование конфокальных и электронных микроскопов, перемещающих перфузионную технику От литейных форм и от жидких перфузий сосудистой сети, некоторые из которых допускают перфузию и визуализацию кровеносных сосудов без разрушения исходной ткани. 3 . DiI, флуоресцентный карбоцианиновый краситель, является одним из таких пятен, который позволяет перфузию животных без повреждения сосудистой ткани.

Карбоцианиновые красители представляют собой липофильные красители, которые вступают в клеточные мембраны при контакте. Эти красители позволяют легко и мгновенно окрашивать сосудистые эндотелиальные клетки, которые затем можно рассматривать под флуоресцентным конфокальным микроскопом. DiI движется через боковую диффузию в липидной мембране клеток, как показано в маркировке и отслеживании нейронов 4 . Химически две алкильные цепи DiI дают красителю его высокое сродство к клеточной мембране, тогда как два конъюгированных кольца из флуорохрома, который отвечает за излучение красной длины волны при возбуждении зелеными флуоресцентными светофильтрами> 4. DiI был использован во многих емкостях, включая успешную маркировку плазматической мембраны и антероградную и ретроградную маркировку в нейронах 5 , 6 . DiI ранее использовался в протоколах перфузии при визуализации сосудистой сети мышей 7 .

Axolotls ( Ambystoma mexicanum ) являются саламандрами, которые живут исключительно в солоноватых озерах вблизи Мехико, Мексика. Эти животные стали важной моделью для понимания процессов регенерации, поскольку они могут восстанавливать полные конечности, хвост (включая нервный шнур), части сердца и другие внутренние органы и части глаз, как взрослые 8 , 9 . Кроме того, с недавним применением генетических инструментов в аксолотлях стало возможным беспрецедентное проникновение в молекулы и клетки, управляющие этими процессами. Успешное возвращениеРадиус целой конечности требует обширного процесса реваскуляризации, который может играть значительную роль в регенерации за пределами просто традиционных функций кровеносных сосудов в обеспечении кислорода и питательных веществ. Понимание реваскуляризации в контексте регенерации тканей обязательно. Ранее сосуды Axolotl визуализировались с использованием индийских чернил, и хотя результаты были интригующими, этот процесс не был повторно рассмотрен в последующие десятилетия 10 . Мы стремились адаптировать протокол перфузии DiI, разработанный для использования у млекопитающих, чтобы обеспечить полную перфузию и визуализацию аксолотлевой сосудистой системы 7 . Этот протокол описывает шаги, предпринятые для успешной перфузии и последующего визуализации циркуляции аксолотля с использованием метода окрашивания DiI. Эта процедура позволит точно визуализировать патентные кровеносные сосуды в гомеостатических тканях, а также в регенерирующих тканях и обеспечивает новый метод визуализацииN и анализ процесса реваскуляризации в аксолотле.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все эксперименты с аксолотом проводились в соответствии с Комитетом по уходу за больными и их использованием в Бригаме и Женской больнице (BWH).

1. Настройте эксперимент по перфузии

  1. Поместите взрослый аксолотль в пластиковый контейнер, заполненный 0,1% раствором трикаина (MS222) в течение 15-20 минут или до полного обезболивания. Убедитесь, что контейнер заполнен достаточным количеством раствора трикаина, так что аксолотль полностью погружен в воду.
    Примечание. Все процедуры должны выполняться в соответствии с руководящими принципами ухода за животными. При BWH аксолотль считается полностью анестезированным, когда он не проходит тест на ногу, что означает, что рефлекторное движение отсутствует, когда нога мягко сжимается.
    Осторожно: хотя трикаин - это анестетик, специально используемый для водных организмов, следует избегать прямого контакта с кожей с раствором трикаина.
  2. Настройте перфузионную станцию ​​аксолотля.
    1. ПоместитеАбсорбирующей прокладки на плоской ровной поверхности с абсорбирующей стороной вверх.
    2. Отрежьте отверстие в каркасе из пенополистирола, соответствующее размеру и форме, чтобы обезболенный аксолотль лежал в положении лежа на спине. Поместите рамку на абсорбирующую подушку.
      Примечание. Некоторые дополнительные бумажные полотенца могут быть размещены сразу под рамой для дополнительной впитывающей способности.
    3. Загрузите перистальтический насос перфузионной трубкой. Установите насос на скорость потока 0,7 мл / мин, протекая по часовой стрелке.
    4. Сделайте разбавленный раствор 0,7x PBS и 5% глюкозы в смеси 1: 4.
    5. Смешайте 10 мл раствора разбавителя с 200 мкл исходного раствора DiI в конической трубке 50 мл. Крышка и смесь путем инверсии. Накройте эту трубку алюминиевой фольгой для защиты рабочего раствора от воздействия света.
      Примечание: Объемы должны меняться в зависимости от размера аксолотля пропорционально. Эти значения приведены для приблизительно 15 см аксолотля (длина рыла до хвоста).Нималы такого размера, возможно, не достигли полной половой зрелости, поэтому животный секс не может быть определен в это время.
    6. Заполните 50 мл коническую трубку 0,7x PBS.
      Примечание: PBS будет использоваться для заливки цикла и подгонки аксолотля.
    7. Прикрепите иглу бабочки 27-го калибра к выходному концу перфузионной трубки. Сложите крылья бабочки друг на друга и поместите в стойку для зажима.
    8. Поместите свободный конец перфузионной трубки в 50-миллилитровую коническую трубку, заполненную 0,7x PBS, и запустите перфузионный насос, пока вся трубка не будет заполнена раствором. Остановите насос, как только вся трубка заполнена PBS.
      Примечание. Обязательно убедитесь, что в трубке всегда есть пузырьки воздуха, так как это вызовет эмболии воздуха в аксолотле и предотвратит полную перфузию.
    9. Поместите бумажное полотенце в форме аксолотля в рамке из пенополистирола. Используя переносную пипетку, промойте полотенце раствором трикаина.
      Примечание. Отрежьте небольшой квадрат посередине бумажного буксираEl, чтобы обеспечить дренаж жидкостей во время процедуры перфузии.
    10. Поместите анестезированный аксолотль на спине на бумажное полотенце внутри рамки из пенополистирола.

2. Открытие сустава Axolotl

  1. Используйте хирургические щипцы, чтобы ущипнуть кожу вдоль центральной оси сундука аксолотля, чуть ниже линии плеч. Поднимитесь.
  2. Используйте скальпель, чтобы сделать небольшой разрез, когда кожа была вытащена.
  3. Удалите квадратный слой кожи над сундуком, чтобы выявить две пластины хряща.
    1. Удалите кожу, чтобы открыть окно над грудной полостью, достаточно большой, чтобы четко видеть сердце и примерно 5 мм аорты, отделяющейся от сердца.
  4. Тщательно раздирайте соединительную ткань с помощью щипцов или закрытых ножниц, чтобы избежать резки крупных кровеносных сосудов.
  5. Поднимайте каждую пластину хряща индивидуально с помощью щипцов и вырезайте ихС хирургическими ножницами.
  6. Аккуратно зажмите перикард щипцами, подтяните и проколоте его хирургическими ножницами; Этот разрез должен быть достаточно глубоким, чтобы проколоть очень тонкий перикард и должен быть достаточно большим, чтобы можно было удалить перикард. Старайтесь не резать сердце.
  7. Деликатно удалите перикард, чтобы разоблачить сердце и аорту.
    Примечание. Используя переносную пипетку, периодически промывайте полость грудной клетки и жабры раствором трикаина, чтобы очистить область и сохранить аксолотль под наркозом.

3. Перфузия Axolotl

  1. Поместите зажимную подставку с загруженной иглой бабочки рядом с каркасом из пенополистирола, чтобы можно было легко манипулировать рукояткой зажима, чтобы вставить иглу в асколотную аорту. Направьте наконечник иглы на ростральный аспект животного во время вставки и удерживайте иглу параллельно аорте, чтобы избежать прокола ее через опПозитивная сторона.
  2. Включите перистальтический насос. 0.7x PBS должен продолжать течь через трубку.
  3. Вставьте иглу в аорту.
    1. Сдвиньте щипцы под дугу аорты и слегка подтяните, чтобы обеспечить легкий доступ.
    2. Маневрируйте комбинацию игл-зажим таким образом, чтобы игла проходила вдоль длины аорты, направленной вверх к голове. Вставьте иглу, используя пинцет для поддержки аорты.
      Примечание: иглу следует вставить достаточно глубоко в аорту, чтобы она не выскользнула во время перфузии. Это может составлять около 5 мм для аксолотля 15 см. Убедитесь, что игла идеально соответствует аорте, чтобы избежать полного прокола сосуда. Проникающие проколы могут вызвать массовое кровоизлияние и снизить уровень успешности перфузии. Успешное введение может быть подтверждено видимым увеличением предсердий сердца.
  4. Быстро разорвать один атриум с помощью sciSsors и позволяют сливать кровь.
    1. Промойте раствором трикаина, чтобы предотвратить накопление крови и образование сгустка в грудной полости.
  5. Перфузируйте аксолотль примерно с 20-30 мл PBS. Животное должно измениться от светло-розового цвета до белого в успешной перфузии.
  6. Остановите перистальтический насос и переместите свободный конец трубки в 15-миллилитровую трубку раствора DiI. Перезапустите насос, следите за тем, чтобы не создавать пузырьки воздуха в трубе.
  7. Перфузируйте аксолотль со всем рабочим слоем DiI.
    Примечание: при успешной перфузии аксолотль меняет цвет на ярко-розовый цвет DiI. Это будет наиболее заметно в жабрах.
  8. Остановите насос после перфузии с помощью DiI и поместите свободный конец трубки в раствор 4% Paraformaldehyde (PFA) для фиксации ткани. Перезапустите насос и перфузируйте не менее 10 мл PFA.
    Осторожно: PFA токсичен, и его следует обрабатывать и отбрасыватьНадлежащим образом. Необходимо носить перчатки и защитные очки, а растворы следует делать внутри вытяжного шкафа. Перфузия аксолотля с PFA для фиксации ткани приводит к гибели животного.

4. Прекращение подготовки перфузии и визуализации

  1. Остановите перистальтический насос и вытащите иглу из аскотола аксолотта.
  2. Поместите аксолотль на пластиковую пластину.
    Примечание. Использование одной половины большой чашки Петри хорошо работает и позволяет разливать небольшое количество трикаина или PBS на аксолотль, чтобы сохранить влажность кожи и улучшить качество визуализации.
  3. Утилизируйте все использованные материалы в соответствующих мусорных баках. Очистите хирургические инструменты с помощью 70% этанола, продезинфицируйте с помощью стерилизатора стеклянных шариков между животными и стерилизуйте автоклавированием в соответствии с процедурой. Промыть трубки раствором PBS, а затем слить, полностью высушить и хранить для дальнейшего использования.

5. Визуализация перфорированного аксолотля

  • Поместите аксолотль под флуоресцентный конфокальный микроскоп.
  • Выключите свет, так как визуализация поверхностей, покрытых DiI, затруднена светом.
  • Используйте зеленый фильтр флуоресцентного фильтра ( например, ET-CY3) с конфокальным микроскопом для визуализации сосудистой сети аксолотля. Используйте световой поток с длиной волны 545 нм.
    Примечание. Чтобы получить изображение высокого качества, можно использовать следующие параметры: экспозиция на 1,1 с, усиление 1x, насыщенность 1,0, увеличение 2X.

    • Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Результаты

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    При окрашивании DiI сосудистая сеть аксолота может быть легко визуализирована. Кровеносные сосуды животных, перфузируемые липофильным красителем, сразу видны под флуоресцентным конфокальным микроскопом. Рисунок 1 .1-1.5 представляет собой схематическое представление протокола перфузии. После перфузии с ярко-розовым красителем успешно перфорированный аксолотль будет розовым. Используя зеленый флуоресцентный фильтр на конфокальном микроскопе, ...

    Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Обсуждение

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Визуализация сосудистой сети аксолота может быть успешно достигнута путем перфузии с липофильным карбоцианиновым красителем DiI. В этом исследовании мы описываем новый протокол для перфузии аксолотля с DiI с использованием перистальтического насоса. Мы также показываем последующую визуализацию аксолотской сосудистой сети с использованием флуоресцентного конфокального микроскопа. Этот протокол был адаптирован к протоколу перфузии грызунов DiI, наблюдаемому в Li et al. 7 , однако существен...

    Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Раскрытие информации

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Авторам нечего раскрывать.

    Благодарности

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Это исследование было поддержано Brigham & Women's Hospital и March of Dimes. Авторы хотели бы поблагодарить всех членов Whited Lab за их поддержку и советы.

    Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Материалы

    Список материалов, использованных в этой статье
    ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
    Перистальтический насос Маршалл Научный RD-RP1
    Excelon Lab & Вакуумная трубка436901705размер S1A
    27г игла-бабочкаEXELint Medical Products26709
    NaClAmericanBio7647-14-5
    KClAmericanBio7747-40-7
    Na2HPO4 AmericanBio7558-79-4
    2PO4AmericanBio10049-21-5
    Дистиллированная вода
    HClAmericanBio7647-01-0
    Глюкоза ThermoFischerA2494001
    1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′- тетраметилиндокарбоцианин перхлоратSigma Aldrich468495
    этанол (100% об/об.)Sigma Aldrich64-17-5
    Хирургический форцепс MedlineMDG0748741
    пенополистиролалюбая квадратная из пенополистирола с аксолотлем  вырезать
    хирургические ножницыMedlineDYND04025
    Скальпель МедлайнMDS15210
    Впитывающая пеленкаAvacare MedicalPKUFSx
    Бумажные
    Стандартная одноразовая переводная пипеткаFisherbrand50216954
    Зажимная подставкаAdafruit291
    Этил3-аминобензоат метансульфонатSigma AldrichE10521Трикаин
    порошок Взрослый аксолотль
    MgSO4AmericanBio10034-99-8
    CaCl2Sigma AldrichC1016-100G
    NaHCO3Sigma AldrichS5761-500G
    Пластиковые бакиРазличные размеры, подходящие для аксолотля
    ПараформальдегидSigma Aldrich30525-89-4
    Аксолотль
    Микроскоп LeicaLeicaM165 FC
    ET-CY3 Флуоресцентный фильтрLeicaM205FA/M165FC
    MS-222
    Перфузионные трубки Рамка изполотенца

    Ссылки

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
    1. Giuvarasteanu, I. Scanning electron microscopy of vascular corrosion casts - standard method for studying microvessels. Rom J Morphol Embryo. 48 (3), 257-261 (2007).
    2. Hasan, M. R., Herz, J., Hermann, D. M., Doeppner, T. R. Intravascular perfusion of carbon black ink allows reliable visualization of cerebral vessels. J Vis Exp. (71), e4374(2013).
    3. Minnich, B., Lametschwandtner, A. Scanning electron microscopy and vascular corrosion casting for the characterization of microvascular networks in human and animal tissues. Microscopy: Science, Technology, Applications, and Education. 1, 29-39 (2010).
    4. Honig, M., Hume, R. I. DiI and DiO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing. Trends Neurosci. 13, 333-335 (1989).
    5. Honig, M. G., Hume, R. I. Fluorescent carbocyanine dyes allow living neurons of identified origin to be studied in long-term cultures. J Cell Biol. 103 (1), 171-187 (1986).
    6. Schwartz, M., Agranoff, B. W. Outgrowth and maintenance of neurites from cultured goldfish retinal ganglion cells. Brain Res. 206 (2), 331-343 (1981).
    7. Li, Y., Song, Y., Zhao, L., Gaidosh, G., Laties, A. M., Wen, R. Direct labeling and visualization of blood vessels with lipophilic carbocyanine dye DiI. Nat Protoc. 3 (11), 1703-1708 (2008).
    8. Kuo, T. H., Kowalko, J. E., DiTommaso, T., Nyambi, M., Montoro, D. T., Essner, J. J., Whited, J. L. Evidence of TALEN-mediated gene editing of an endogenous locus in axolotl. Regeneration. 2 (1), 37-43 (2015).
    9. Brockes, J. P., Kumar, A. Appendage Regeneration in Adult Vertebrates and Implications for Regenerative Medicine. Science. 310 (5756), 1919-1923 (2005).
    10. Smith, A. R., Wolpert, L. Nerves and angiogenesis in amphibian limb regeneration. Nature. 257 (5523), 224-225 (1975).

    Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

    Перепечатки и разрешения

    Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

    Запросить разрешение

    Теги

    Похожие статьи