Получение везикул плазматических мембран из мезенхимальных стволовых клеток костного мозга для потенциальной заместительной терапии цитоплазмы

Краткое содержание

Возрастные заболевания связаны с множественными дефектами в компонентах цитоплазмы. Здесь мы представляем протокол для подготовки везикул плазматической мембраны из мезенхимальных стволовых клеток костного мозга. Этот метод потенциально может быть использован в качестве средства заместительной терапии цитоплазмы для улучшения или даже отмены возрастных фенотипов.

Аннотация

Ранее мы сообщали о генерации везикул плазматической мембраны (ПМВ) посредством механической экструзии клеток млекопитающих. Слияние PMV с митохондриально дефицитными Rho0 клетками восстанавливало митотическую активность в нормальных условиях культивирования. Атеросклероз, диабет типа 2, болезнь Альцгеймера и рак - это связанные с возрастом заболевания, которые, как сообщается, связаны с множественными механическими и функциональными дефектами в цитозоле и органеллах различных типов клеток. Мезенхимальные стволовые клетки костного мозга (BMSCs) представляют уникальную популяцию клеток из костного мозга, которые обладают способностями к самообновлению, сохраняя при этом свою мультипотентность. Дополнение клеток старения молодой цитоплазмой из аутологичных BMSC посредством слияния PMVs обеспечивает перспективный подход для улучшения или даже отмены обратных возрастных фенотипов. Этот протокол описывает, как готовить PMV из BMSC посредством экструзии через поликарбонатную мембрану с 31 мкм, определяют существование митохондрий и исследуют поддержание мембранного потенциала в пределах PMV с помощью конфокального микроскопа, концентрируют PMV центрифугированием и осуществляют in vivo инъекцию PMV в икроножную мышцу мышей.

Введение

Огромные усилия были направлены на разработку подходов к терапии генной, ферментной и клеточной заместительной терапии. Это привело к большим прорывам и даже клиническим применениям ^{1 , 2 , 3} . В последнее время спорная митохондриальная заместительная терапия, основанная на технологии переноса ядра, была применена для экстракорпорального оплодотворения у женщин пожилого возраста или с летальной мутацией митохондриальной ДНК ⁴ . Дефекты, обнаруженные в возрастных заболеваниях, включая атеросклероз, диабет типа 2, болезнь Альцгеймера и рак, обычно многогранны. Было зарегистрировано, что накопление капель липидов; Отложение амилоидного белка; Сохранение нераскрытых белков в эндоплазматическом ретикулуме; И дефектная протеасома, аутофагосома и митохондрии способствуют развитию или обострению этих заболеваний"Xref"> 5 ^{, 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11} . В настоящее время нет доступного механизма, направленного на непосредственное устранение неисправности в цитозоле и органеллах, что вызывает фенотипы старения и старения.

Ранее мы сообщали о генерации везикул плазматической мембраны (ПМВ) посредством механической экструзии клеток млекопитающих ¹² . За исключением ядра, в PMV были обнаружены компоненты в мембране или цитозоле, включая белки и РНК, а также органеллы, такие как митохондрии. По существу, PMV можно рассматривать как миниатюрно-энуклеированную клетку. Более важно то, что слияние PMV с клетками Rho0, дефицитными по митохондриям, восстанавливало митотическую активность в нормальных условиях культивирования. Это первый отчет обПотенциально эффективный подход для заместительной терапии цитоплазмы.

Мезенхимальные стволовые клетки костного мозга (BMSC) являются мультипотентными клетками-предшественниками, которые обычно получают из костного мозга и легко расширяются в культуре. Маркеры эмбриональных стволовых клеток Oct4, Nanog и SOX2 были обнаружены на низких уровнях в MSC ¹³ . Активность теломеразы также поддается измерению. Кроме того, отсутствие ко-стимулирующих молекул и молекул человеческого лейкоцитарного антигена (HLA) класса II, а также низкая экспрессия HLA класса I в MSCs делают их идеальными клетками для аллогенного или «готового к использованию» применения в Как регенеративной медицины, так и иммуномодулирующих применений ¹⁴ .

Здесь мы описываем, как готовить PMV из мышей BMSC через экструзию через поликарбонатную мембрану с порами 3 мкм, определять существование митохондрий и исследовать поддержание мембранного потенциала в PMV с помощью confocМикроскопии, получают концентрированные, но не агрегированные PMV центрифугированием, и осуществляют in vivo инъекцию PMV в икроножную мышцу мышей.

Протокол

Мышей от BALB / c в возрасте от 8 до 12 недель закупали у Шанхайского экспериментального животного центра (Шанхай, Китай) и выращивали в специальном животноводческом объекте, свободном от патогенов. Уход за животными и экспериментальные процедуры соответствовали руководящим принципам использования и ухода за лабораторными животными, созданными Университетом Шаньтоу.

1. Сборка аппарата

1. Чтобы обеспечить стерильность, включите УФ-излучение капота для тканевой культуры в течение 30 минут перед использованием.
2. Отвинтите одноразовый фильтр на 25 мм и погрузите колпачок и нижнюю часть устройства в стеклянную чашку объемом 200 мл, заполненную 75% -ным этанолом в течение 30 мин. Аппарат изготовлен из полипропилена медицинского назначения.
3. Возьмите крышку и нижнюю часть устройства с помощью щипцов, отряхните оставшийся этанол вручную и дайте частицам высохнуть на воздухе в течение 10 минут в вытяжном шкафу.
4. Смочите 19-миллиметровую поликарбонатную мембрану в PBS и аккуратно положите ее на верхнюю часть поддерживающей матрицы BottoМ от установки. Полимерная пленка имеет гладкую, плоскую поверхность и протравленные треки толщиной 3 мкм.
5. Соберите блок, плотно привинтив крышку к нижней части. Убедитесь, что мембрана не смещена от центра.
6. Удалить иглу 1 мл инсулина шприц и привлечь 1 мл PBS. Прикрепите шприц к фильтрующему блоку, а затем нажмите PBS через устройство, чтобы намочить узел и проверить, есть ли утечка.

2. Генерация плазматических мембранных везикул (ПМВ)

1. Создание культуры BMSC, как сообщается Nemeth et al. ¹⁵ , в культуральной среде DMEM, содержащей 15% FBS и 1% пенициллина / стрептомицина. Культивируйте клетки в 6-луночном планшете в увлажненном инкубаторе, содержащем 5% CO ₂ при 37 ° C.
2. Для размножения клеток удаляют культуральную среду и промывают лунку 0,5 мл свободного от кальция PBS.
3. Добавить 0,5 мл 0,25% трипсина-ЭДТУ и инкубировать клетки при 37 ° СВ течение 3 минут. Нажмите пластину на ладонь руки пару раз, чтобы облегчить отделение клетки. Остановить пищеварение, добавив 1 мл культуральной среды.
4. Соберите клетки в конической пробирке на 15 мл и вращайте при 200 мкг в течение 2 мин в настольной центрифуге. Ресуспендируют клетки в 4 мл культуральной среды и аликвотируют клетки в две лунки 6-луночного планшета.
   ПРИМЕЧАНИЕ. Клетки обычно достигают слияния приблизительно в течение 24 часов.
5. Для получения PMVs собирают клетки из одной лунки (около 5 × 10 ⁵ клеток) 6-луночного планшета путем расщепления трипсином и монодиспергируют клетки в 0,5 мл культуральной среды.
6. Загрузите клетки в инсулиновый шприц, присоедините его к фильтрующему блоку и быстро надавите на плунжер, чтобы выжать клетки через фильтр. Откажитесь от экструдированного носителя, поскольку в нем должно быть только несколько PMV.
7. Загрузите в шприц еще 0,5 мл среды и быстро пропустите ее через фильтр. Собрали среду второй экструзии, которая содержитS PMV различного размера.
8. Загрузите 150 мкл собранной среды в 35-мм стеклянную донную чашку и позвольте PMV оседать на дно в течение приблизительно 10 мин. Изучите PMV под инвертированным фазовым контрастным микроскопом, оснащенным CCD-камерой, используя объектив 20X.

3. Исследование содержания в рамках PMV с использованием конфокальной микроскопии

1. Для проведения трансфекции в BMSC разведите 2 мкг сверхраздутой плазмидной ДНК и 6 мкл реагента для катионной трансфекции ( например, PolyJet) в 50 мкл бессывороточной DMEM. Вортекс хорошо перемешать и быстро вращать, чтобы собрать всю жидкость с боковых сторон трубки.
2. Добавляют разбавленный раствор (из стадии 3.1) по каплям в разбавленный раствор ДНК, сильно встряхивают в течение 1 мин, быстро центрифугируют и инкубируют при комнатной температуре в течение 10 мин.
3. Замените старую среду на BMSC, которые были посеяны примерно на 30% слиянии в течение ночи, с 2 мл свежей питательной среды и добавьте DNСмесь для трансфекции по каплям.
4. Замените 2 мл свежей среды после 12 ч трансфекции.
5. Для отслеживания цитоплазматически локализованных белков трансфектируйте клетки плазмидой, содержащей кассету экспрессии EGFP (pEGFP-N1), как описано выше. Урожай клеток путем переваривания трипсина через 48 ч после трансфекции для получения PMV, как описано выше.
6. Чтобы проследить митохондрии, окрасьте клетки митохондриальным красителем (1 мкМ, MitoTracker) в свежей культуральной среде в течение 30 минут при 37 ° C.
7. Для определения мембранного потенциала митохондрий окрашивают клетки цианиновым красителем JC-1 (5,5 ', 6,6'-тетрахлор-1,1', 3,3'-тетраэтилбензимидазолилкарбоцианин йодид) (10 мкг / Мл) в свежей культуральной среде в течение 30 мин при 37 ° С.
   1. Промойте клетки с 0,5 мл PBS три раза, а затем собрать клетки путем расщепления трипсином для получения PMV, как описано выше.
   2. Загрузите 150 мкл собранной медиИум в чашку со стеклянным дном толщиной 35 мм и позволять PMV оседать на дно в течение примерно 10 мин. Осмотрите PMV под конфокальным микроскопом, используя объектив с масляной линзой 100X.
8. Чтобы обнаружить EGFP или митохондриальный краситель, включите лазер 488 нм и соберите сигнал при длине волны 505-530 нм. Чтобы обнаружить JC-1, включите лазеры длиной 488 и 543 нм и соберите сигналы при длине волны 505-530 нм и 560-615 нм. Установите значение обскуры около 1,4.

4. Получение концентрированных PMV центрифугированием

1. Собирают клетки путем расщепления трипсином и генерируют PMV, как описано выше, в 0,5 мл культуральной среды.
2. Вращайте PMVs при 1200 xg в настольной центрифуге в течение 5 минут при комнатной температуре. Тщательно аспирируйте супернатант и ресуспендируйте осадок в 100 мкл культуральной среды с нежным завихрением.
3. Загрузите 50 мкл PMVs в чашку со стеклянным дном толщиной 35 мм и дайте им остыть при комнатной температуре в течение примерно 10 минут. Изучите PMVsПод конфокальным микроскопом, используя 40X масляный объектив.
4. Добавить серию разбавленного раствора полиэтиленимина (PEI) в культуру BMSC в течение 1 ч и проверить наличие признаков цитотоксичности.
   ПРИМЕЧАНИЕ. Здесь был выбран PEI на уровне 2 мкг / мл, поскольку никаких признаков токсичности в BMSC обнаружено не было.
5. Собирают клетки путем расщепления трипсином и добавляют PEI в концентрации 2 мкг / мл в течение 1 ч для зарядки клеточной мембраны в качестве средства предотвращения агрегации. Генерировать PMV, как описано выше, в 0,5 мл культуральной среды. Сосредоточьте PMVs и исследуйте их под конфокальным микроскопом, как описано выше.

5. Инъекция PMVs в мышцы Gastrocnemius

1. Чтобы окрасить мембрану, добавьте CM-DiI (хлорметилдиалкил-индокарбоцианин) (10 мкМ) краситель в 1 мл свежей культуральной среды к BMSC в течение 30 мин.
2. Собирают клетки (около 5 × 10 ⁵ ) путем расщепления трипсином и ресуспендируют их в 0,5 мл культуральной среды. Добавить PEI (2 мкг / мл) для 1час Генерировать и концентрировать PMV в 100 мкл культуральной среды, как описано выше.
3. Анестезируйте мышь BALB / c, вводя натрий-барбитал (10 мг / кг) после 12 ч голодания.
4. Очистите снаружи икроножной мышцы 75% -ным этанолом. Медленно вводить PMV (100 мкл) в икроножную мышцу с использованием шприца с инсулином 30 G.
5. После введения анестезии поместите влажную марлю на глаза в течение всего эксперимента и согрейте мышь лампой накаливания до тех пор, пока она не проснется. Поместите мышь в отдельную вентиляционную клетку.
6. Чтобы собрать икроножную мышцу через 12 ч после операции, убейте мышь шейным вывихом.
7. Посыпьте 75% этанола над икроножной мышцей, откройте кожу ножницами и вырежьте всю икроножную мышцу с обоих концов.
8. Промойте мышцу PBS и осмотрите ее под флуоресцентным микроскопом, используя 20X объектив.
9. Обрежьте мышцу с помощьюОструю бритвенную лезвию для удаления деталей без флуоресценции. Разрежьте части с сильной красной флуоресценцией примерно на 9 мм ³ кубика.
10. Вставьте каждый куб в оптимальную среду для резки (OCT), погрузите ее в жидкий азот в течение 5 минут и сохраните в морозильнике -20 ° C до использования.
11. Разрежьте замороженные секции на кусочки толщиной 20 мкм с использованием криостата и прикрепите каждую секцию к предметному стеклу. Промыть секцию один раз PBS.
12. Нарисуйте круг вокруг секции с помощью ручки для окрашивания пятен и добавьте 100 мкл DAPI (1 мкг / мл). Аспирируйте раствор DAPI после 10 минут инкубации при комнатной температуре в темноте и три раза промывайте PBS.
13. Нанесите масло на образец, накройте его стеклянным колпачком и закрепите лаком для ногтей. Осмотрите секцию под конфокальным микроскопом, используя объектив с масляной линзой 100X.
14. Чтобы обнаружить CM-DiI, включите лазер 543 нм и соберите сигнал при 560-615 нм. Чтобы обнаружить DAPI, включите 405Нм лазер и собирают сигнал при 420-480 нм. Установите значение точечного отверстия примерно 1,4.

Результаты

Ключ к успешной подготовке PMV сильно зависит от правильной сборки блока фильтра ( рис. 1 ), который можно проверить, проталкивая 1 мл PBS через мембрану. Если происходит утечка, вновь соберите узел фильтра и повторите анализ. Тем не менее, утечку можно только надежно проверить, когда клетки проталкиваются через мембрану. Если в обычном микроскопе обнаруживается только несколько PMV, используя объектив 10X, или если размер PMV составляет в основном около 1 мкм, это указы...

Обсуждение

Цитоплазмозаместительная терапия, предложенная в данной рукописи, имеет уникальные преимущества по сравнению с другими описанными подходами, такими как генная, молекулярная и клеточная терапия. PMV, полученные из BMSC, инкапсулируют не только продукты стволовых генов, но и интактные клеточные органеллы, которые необходимы для коррекции фенотипов старения, связанных со старением. Когда молодая цитоплазма доставляется к стареющим клеткам, неправильно функционирующие механизмы могут получить кратковременное облегчение; В то...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Мембраны IsoporeTM	Millipore	TSTP04700	3 мм поры
Одноразовый фильтрующий блок	Xinya, Шанхай, Китай	25 мм	Медицинский полипропилен
Инсулиновый шприц	BD	328446	1 мл
pN1-EGFP	Clontech	6085-1
MitoTracker	Молекулярные зонды	M7514	Green FM, 1 μ M
JC-1	Beyotime, Haimen, China	C2006	10 мг/мл
CM-DiI	Beyotime, Haimen, China	C1036	10 mM
PEI	Sigma	P3143	mn = 75 000
флуоресцентный микроскоп	Nikon	Eclipse TE 2000	с ПЗС-камерой
Конфокол Микроскоп	Carl Zeiss	LSM 510 Meta
PolyJet	SigaGen	SL100688	для клеточной трансфекции