Method Article

Изучение экспрессии генов, регулируемых клеточным циклом, двумя протоколами синхронизации комплементарных ячеек

DOI:

10.3791/55745

⸱

June 6th, 2017

 ,  , 
1Department of Cell Biology and Histology, University of the Basque Country, UPV/EHU, 2Department of Genetics, Physical Anthropology and Animal Physiology, University of the Basque Country, UPV/EHU, 3Department of Molecular Mechanisms of Disease, University of Zurich

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы сообщаем о двух протоколах синхронизации ячеек, которые предоставляют контекст для изучения событий, связанных с конкретными фазами клеточного цикла. Мы показываем, что этот подход полезен для анализа регуляции специфических генов в невозмущенном клеточном цикле или при воздействии агентов, влияющих на клеточный цикл.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Программа экспрессии генов клеточного цикла представляет собой критический шаг для понимания процессов, зависящих от клеточного цикла, и их роли в таких заболеваниях, как рак. Анализ экспрессии генов, регулируемый клеточным циклом, зависит от синхронизации клеток на определенные фазы. Здесь мы описываем метод, использующий два дополнительных протокола синхронизации, которые обычно используются для изучения периодического изменения экспрессии генов во время клеточного цикла. Обе процедуры основаны на временном блокировании клеточного цикла в одной определенной точке. Протокол синхронизации обработкой гидроксимочевиной (HU) приводит к клеточному аресту в поздней фазе G1 / ранней S, а высвобождение из опосредованного HU задержания обеспечивает популяцию клеток, равномерно прогрессирующую через S и G2 / M. Протокол синхронизации лечения тимидином и нокодазолом (Thy-Noc) блокирует клетки в раннем митозе и высвобождение из опосредованного Thy-Noc остановки обеспечивает синхронизированную клеточную популяцию, подходящую для фазы G1 и S-фазыПопробуйте исследования. Применение обеих процедур требует мониторинга профилей распределения клеточного цикла, которые обычно выполняются после окрашивания пропидиум иодидом (PI) клеток и опосредованного потоком цитометрии анализа содержания ДНК. Мы показываем, что совместное использование двух протоколов синхронизации является надежным подходом к четкому определению транскрипционных профилей генов, которые дифференциально регулируются в клеточном цикле ( то есть E2F1 и E2F7) и, следовательно, лучше понимать их роль в клеточном цикле процессы. Кроме того, мы показываем, что этот подход полезен для изучения механизмов, лежащих в основе лекарственной терапии ( то есть митомицина С, противоопухолевого агента), поскольку он позволяет различать гены, которые реагируют на генотоксический агент от тех, на кого воздействуют только возмущения клеточного цикла Наложенных агентом.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Переход через все фазы клеточного цикла связан с плотно регулируемой программой экспрессии генов. Считается, что это скоординированное «включение и выключение» транскрипции генов в течение клеточного цикла находится под контролем сложных регуляторных систем транскрипции, регулирующих не только время, но также и уровни экспрессии генов. Известно, что дерегулирование компонентов ключевого клеточного цикла способствует развитию нескольких заболеваний и является хорошо зарекомендовавшим себя признаком опухолевого генеза 1 , 2 . Проведенные в клетках дрожжей и млекопитающих широкомасштабные транскриптомические ана....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Сотовая синхронизация, выпуск и мониторинг прогрессирования клеточного цикла

  1. Синтез тимидина и нокодазола (Thy-Noc) и выделение клеток U2OS из митоза
    1. Подготовьте требуемую среду для культивирования клеток. Клетки U2OS обычно выращивают в среде DMEM-глутамина, дополненной 10% (об. / Об.) FBS (необязательно: 1% пенициллин / стрептомицин). Выполните всю подготовку и обработку среды в стерильных условиях и прогрейте дополнительную среду (отныне называемую «полной средой») до 37 ° C перед использованием.
    2. Семена 2 × 10 6 клеток U2OS на 100 мм чашку в 10 мл полной культуральной среды. Чтобы рассчитать количество н....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Схематическое представление протоколов Thy-Noc и HU для синхронизации соты.

На рисунке 1 приведены шаги, необходимые для синхронизации ячеек U2OS и последующего сбора проб, чтобы проверить прогрессирование через клеточный цикл и выполнить анализ экспрессии генов.

Фосфо-H3 и окрашивание PI являются хорошими параметрами оценки для выбора методов синхронизац.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Анализ тонкоизмельченных регулируемых генов, участвующих в переходных и специфических ролях в клеточном цикле, требует однородной клеточной популяции. Многие исследователи обычно используют длинные линии опухолевых клеток для этих целей, и были разработаны различные методы для получения синхронных (или частично синхронных) клеточных популяций с целью накопления как можно большего количества клеток в определенных фазах клеточного цикла. Кроме того, были предприняты активные усилия для улучшения и оптимизации хорошо устан.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим членов лабораторий Zubiaga и Altmeyer за полезные обсуждения и техническую поддержку. Эта работа была поддержана грантами испанского министерства (SAF2015-67562-R, MINECO / FEDER, UE), правительством Басков (IT634-13 и KK-2015/89) и Университетом Страны Басков UPV / EHU ( UFI11 / 20).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
DMEM, с высоким содержанием глюкозы, добавка GutaMAXThermo Fisher Scientific61965-059
FBS, квалифицированный, одобренный ЕС, происхождениеиз Южной Америки Thermo Fisher Scientific10270-106
Пенициллин-стрептомицин (10 000 ЕД/мл)Thermo Fisher Scientific15140-122
0,25% трипсин-ЭДТА (1 шт.), феноловый красныйThermo Fisher Scientific25200-072
ТимидинSIGMAT1895-5GСвежеприготовленный. Небольшое нагревание может помочь растворить тимидин.
НокодазолСИГМАМ-1404Стоковый раствор в ДМСО, хранящийся при -20 &ордм; С в малых аликвотах
ГидроксимочевинаSIGMAH8627Свежеприготовленный
Митомицин С из Streptomyces caespitosusSIGMAM42871,5 мМ стоковый раствор в стерильном H<суб>2О защищен от света и хранится при 4&ордм; C
ДиметилсульфоксидSIGMAD2650
Пропидия йодидSIGMAP4170Стоковый раствор в стерильном PBS по дозе 5 мг/мл, хранят при 4 °ordm; C в защищенном от света месте.
PBS pH 7,6Домашний
этанолPANREACA3678,2500
ХлороформSIGMAC2432
Цитрат натрияPANREAC131655
Triton X-100SIGMAT8787
РНКаза AThermo Fisher ScientificEN0531
TRIzol ReagentLifeTechnologies15596018
RNeasy Mini kitQIAGEN74106
High-Capacity cDNA Reverse Transcription KitThermo Fisher Scientific4368814
Anti-Cyclin E1 антителаCell Signaling41291:1000 разведение в 5% молоке, o/n, 4 º C
Антициклин В1 антителоCell Signaling41351:1000 разведение в 5% молоке, о/н, 4 º C
Анти-&бета;-актинSIGMAA-54411:3000 разведение в 5 % молоке, 1 ч, RT
Anti-pH3 (Ser 10) антиботияMillipore06-570Указано в протоколе
Вторичное антитело против кролика AlexaFluor 488InvitrogenR37116Указано в протоколе
Вторичное антитело против мыши - HRP SantaCruz Biotechnologysc-36971:3000 разведение в 5 % молоке, 1 ч,
антитело RT Forward E2F1 (человек)                                      TGACATCACCAACGTCCTTGABiolegioРазработано инструментом PrimerQuest (https://eu.idtdna.com/site)
Обратное антитело к E2F1 (человек)                                      CTGTGCGAGGTCCTGGGTCBiolegioРазработано инструментом PrimerQuest (https://eu.idtdna.com/site)
Антитело Forward E2F7 (человек)                                      GGAAAGGCAACAGCAAACTCTBiolegioРазработано инструментом PrimerQuest (https://eu.idtdna.com/site)
Обратное антитело E2F7 (человек)                                      TGGGAGAGCACCAAGAGTAGAAGABiolegioРазработано с помощью инструмента PrimerQuest (https://eu.idtdna.com/site)
Forward p21Cip1 антитела (человеческие)                                      AGCAGAGGAAGACCATGTGGACBiolegioРазработано инструментом PrimerQuest (https://eu.idtdna.com/site)
Reverse p21Cip1 антитела (человеческие)                                      TTTCGACCCTGAGAGTCTCCAGBiolegioРазработано инструментом PrimerQuest (https://eu.idtdna.com/site)
Референсный ген антитела Forward TBP (человек)                                       BiolegioРазработано инструментом PrimerQuest (https://eu.idtdna.com/site)
Антитела обратного TBP (человека)                                       BiolegioРазработано с помощью инструмента PrimerQuest (https://eu.idtdna.com/site)
Референсный ген антитела Forward Oxa1L (человек)    CACTTGCCAGAGATCCAGAAG                                 BiolegioРазработано с помощью PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)
Reverse Oxa1L   антитела (человеческие)      CACAGGGAGAATGAGAGGTTTATAG                               BiolegioРазработано PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)
Power SYBRGreen PCR Master MixThermo Fisher Scientific4368702
FACS Tubes Sarstedt551578
MicroAmp Оптический 96-луночный реакционный планшетThermo Fisher ScientificN8010560
Corning 100 мм Чашка для обработанных TCCorning Corning
Corning Costar для клеточных культур 6 лунокCorning3506
Охлаждаемая настольная микроцентрифугаEppendorf5415 R
Охлаждаемая настольная центрифуга Jouan CR3.12Спектрофотометр Jouan743205604
NanoDrop LiteThermoScientific ND-LITE-PR
BD FACSКалибурный проточный цитометрBD Bioscience
QuantStudio 3 Система ПЦР в реальном времениThermo Fisher ScientificA28567
культур

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Beato, M., Sánchez-Aguilera, A., Piris, M. A. Cell cycle deregulation in B-cell lymphomas. Blood. 101 (4), 1220-1235 (2003).
  2. Chen, H. Z., Tsai, S. Y., Leone, G. Emerging roles of E2Fs in cancer: an exit from cell cycle control. Nat Rev Cancer. 9 (11), 785-797 (2009).
  3. Cho, ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cell Cycle SynchronizationHydroxyurea TreatmentThymidine NocodazoleFlow Cytometry AnalysisGene Expression AnalysisRNA Extraction ProtocolPropidium Iodide StainingU2OS CellsMitotic Cell ArrestG1 S Boundary

Related Articles