Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

Summary

Мы сообщаем о двух протоколах синхронизации ячеек, которые предоставляют контекст для изучения событий, связанных с конкретными фазами клеточного цикла. Мы показываем, что этот подход полезен для анализа регуляции специфических генов в невозмущенном клеточном цикле или при воздействии агентов, влияющих на клеточный цикл.

Abstract

Программа экспрессии генов клеточного цикла представляет собой критический шаг для понимания процессов, зависящих от клеточного цикла, и их роли в таких заболеваниях, как рак. Анализ экспрессии генов, регулируемый клеточным циклом, зависит от синхронизации клеток на определенные фазы. Здесь мы описываем метод, использующий два дополнительных протокола синхронизации, которые обычно используются для изучения периодического изменения экспрессии генов во время клеточного цикла. Обе процедуры основаны на временном блокировании клеточного цикла в одной определенной точке. Протокол синхронизации обработкой гидроксимочевиной (HU) приводит к клеточному аресту в поздней фазе G1 / ранней S, а высвобождение из опосредованного HU задержания обеспечивает популяцию клеток, равномерно прогрессирующую через S и G2 / M. Протокол синхронизации лечения тимидином и нокодазолом (Thy-Noc) блокирует клетки в раннем митозе и высвобождение из опосредованного Thy-Noc остановки обеспечивает синхронизированную клеточную популяцию, подходящую для фазы G1 и S-фазыПопробуйте исследования. Применение обеих процедур требует мониторинга профилей распределения клеточного цикла, которые обычно выполняются после окрашивания пропидиум иодидом (PI) клеток и опосредованного потоком цитометрии анализа содержания ДНК. Мы показываем, что совместное использование двух протоколов синхронизации является надежным подходом к четкому определению транскрипционных профилей генов, которые дифференциально регулируются в клеточном цикле ( то есть E2F1 и E2F7) и, следовательно, лучше понимать их роль в клеточном цикле процессы. Кроме того, мы показываем, что этот подход полезен для изучения механизмов, лежащих в основе лекарственной терапии ( то есть митомицина С, противоопухолевого агента), поскольку он позволяет различать гены, которые реагируют на генотоксический агент от тех, на кого воздействуют только возмущения клеточного цикла Наложенных агентом.

Introduction

Переход через все фазы клеточного цикла связан с плотно регулируемой программой экспрессии генов. Считается, что это скоординированное «включение и выключение» транскрипции генов в течение клеточного цикла находится под контролем сложных регуляторных систем транскрипции, регулирующих не только время, но также и уровни экспрессии генов. Известно, что дерегулирование компонентов ключевого клеточного цикла способствует развитию нескольких заболеваний и является хорошо зарекомендовавшим себя признаком опухолевого генеза ^{1 , 2} . Проведенные в клетках дрожжей и млекопитающих широкомасштабные транскриптомические анализы показали, что большое количество генов проявляют периодические образцы экспрессии генов в клеточном цикле, что указывает на то, что флуктуация транскрипции во время клеточного цикла является отражением временного требования к данному продукту гена В точной фазе ^{3 , 4 ,} </suP> ⁵ .

Основная задача изучения экспрессии генов, регулируемых клеточным циклом, – это синхронизация клеток на фазах конкретного клеточного цикла. Синхронизация клеток помогает интерпретировать ассоциацию шаблона экспрессии генов с конкретным фазовым переходом на клеточный цикл, и это привело к лучшему пониманию регуляции и функции многочисленных генов. Синхронизация клеток также важна для изучения механизма действия противораковых лекарств, поскольку известно, что химиотерапевтические агенты влияют как на экспрессию генов, так и на кинетику клеточного цикла ^{6 , 7} . Тем не менее, часто бывает трудно определить, являются ли различия в экспрессии генов, возникающие в результате лечения этими агентами, прямым ответом на лечение или являются просто следствием изменений в профилях клеточного цикла. Чтобы различать эти возможности, экспрессию генов следует анализировать в клетках, которые былиСинхронизируется до добавления химиотерапевтического препарата.

За исключением некоторых первичных клеток, таких как недавно выделенные лимфоидные клетки, которые представляют собой гомогенную популяцию клеток, синхронизированную в G0 ⁸ , in vitro установленные клеточные линии асинхронно растут в культуре. При регулярных условиях роста эти асинхронно циклические клетки находятся во всех фазах клеточного цикла, но предпочтительно в G1 ⁹ . Следовательно, этот контекст не обеспечивает оптимальный сценарий для анализа функциональных или генных экспрессии в конкретной фазе клеточного цикла ( например, G1, S и т. Д.). Не трансформированные иммортализованные клеточные линии ( например, фибробласты) могут быть синхронизированы с так называемыми физиологическими методами ¹⁰ . Эти методы основаны на сохраненных первичных клеточных характеристиках нетрансформированных клеток, таких как ингибирование клеточного контакта и зависимости фактора роста, чтобы продолжить циклирование. УдалениеСыворотки в сочетании с контактным торможением делает нерепрессированные клетки, арестованные в G0 / G1. Однако синхронизированный вход и прогрессирование циклического цикла часто требует субкультуры, которая также включает в себя искусственное отслоение клеток и повторное покрытие ¹⁰ . Самое главное, этот метод не подходит для синхронизации трансформированных клеточных линий, подавляющее большинство установленных клеточных линий, которые в настоящее время используются, характеризуется отсутствием клеточного опосредованного клеточным ингибированием роста или ответа на вывод фактора роста. Таким образом, ясно, что для эффективной синхронизации соты в конкретных фазах клеточного цикла требуются альтернативные методы. В общих чертах наиболее часто используемые методы синхронизации основаны на временном химическом или фармакологическом ингибировании одной определенной точки клеточного цикла, как правило, синтезе ДНК или образовании митотического веретена. Ингибирование синтеза ДНК синхронизирует клетки, останавливая их в поздней фазе G1 или ранней S. Это может быть achiПутем добавления таких соединений, как мимозин, ингибитора биосинтеза нуклеотидов ^{11 , 12} , афидиколина, ингибитора ДНК-полимераз ^{13 , 14} , гидроксимочевины, ингибитора рибонуклеотидредуктазы ^{15 , 16} или избыточных количеств тимидина ^{17 , 18} . С другой стороны, ингибиторы полимеризации микротрубочек, такие как колхицин или нокодазол, способны блокировать образование митотического веретена, приводя к синхронизации клеток на ранней фазе M ^{19 , 20 , 21} .

В этой работе мы описываем метод, включающий два дополнительных протокола синхронизации, основанных на переходном химическом ингибировании для изучения экспрессии генов, регулируемых клеточным циклом, в мРНКуровень. Этот метод является фундаментальным для определения роли генов клеточного цикла в конкретных процессах клеточного цикла. Кроме того, он обеспечивает общую структуру для изучения влияния противоопухолевых обработок, чтобы точно определить гены, чувствительные к лекарственным средствам, и свести к минимуму неверные истолкования, вызванные нарушениями в прогрессировании клеточного цикла, вызванными этими препаратами.

Protocol

1. Сотовая синхронизация, выпуск и мониторинг прогрессирования клеточного цикла Синтез тимидина и нокодазола (Thy-Noc) и выделение клеток U2OS из митоза Подготовьте требуемую среду для культивирования клеток. Клетки U2OS обычно выращивают в среде DMEM-глутамина, дополненной 10% (об. / Об.) FBS (необязательно: 1% пенициллин / стрептомицин). Выполните всю подготовку и обработку среды в стерильных условиях и прогрейте дополнительную среду (отныне называемую «полной средой») до 37 ° C перед использованием. Семена 2 × 10 6 клеток U2OS на 100 мм чашку в 10 мл полной культуральной среды. Чтобы рассчитать количество необходимых блюд, учтите, что каждая 100-миллиметровая чашка обычно обеспечивает достаточное количество митотических клеток для повторной тарелки приблизительно 5 лунок 6-луночного планшета (0,2 – 0,25 × 10 6 клеток / лунка) (см . Рис. 1В ). Две лунки за выбранный момент времени являются обязательными(1 лунка для экстракции РНК и 1 лунка для мониторинга клеточного цикла). Кроме того, третья лунка может собираться в течение времени для анализа белка. ПРИМЕЧАНИЕ. Пластинчатые ячейки вечером (около 7 вечера), чтобы последующие шаги можно было выполнить в рабочее время в следующие дни. Включите 2 дополнительных лунки асинхронно растущих клеток, чтобы определить параметры компенсации анализа FACS. Позвольте клеткам присоединить, инкубируя 100 мм посуду при 37 ° C в увлажненной атмосфере с 5% CO 2 в течение 24 часов. Для тимидинового блока готовят 200 мМ раствора тимидина путем растворения 145,2 мг тимидинового порошка в 3 мл H 2 O (или эквивалентных количеств) и стерилизуют раствор фильтрованием через фильтр размера пор 0,2 мкм. Небольшое потепление может помочь растворить тимидин. Добавьте 100 мкл свежеприготовленного 200 мМ штока в каждую 100-миллилитровую культуральную чашку (конечная концентрация 2 мМ). Инкубировать клетки с тимидином в течение 20 ч при 3776; C в увлажненной атмосфере с 5% CO 2 . ПРИМЕЧАНИЕ. Обработайте клетки вечером (около 7 часов вечера), чтобы успеть выполнить как высвобождение тимидина, так и блок-нокодазол на следующий день. Чтобы высвободить из блока тимидина, удалите тимидин, содержащий среду для роста, во второй половине дня следующего дня (15:00); Дважды промывайте клетки предварительно нагретым 1 × PBS и добавьте 10 мл полной среды к каждой 100-миллиметровой чашке. Инкубируйте клетки в течение 5 ч при 37 ° С в увлажненной атмосфере с 5% СО 2 . Для остановки митотических клеток добавьте нокодазол до конечной концентрации 50 нг / мл (8 часов). Подготовьте исходный раствор путем растворения порошка нокодазола в ДМСО ( например, 5 мг / мл) и хранить в замороженном состоянии при -20 ° С. Инкубируйте клетки с нокодазолом не более 10-11 часов при 37 ° C в увлажненной атмосфере с 5% CO 2 . Освобождение от опосредованного нокодазолом ареста в ранней М-фазе (митотическая встряска) и сбор проб в несколько раз поиNts (начиная с 6-7 утра). Отсоедините округлые (митотические) клетки, встряхивая каждую пластинку и аккуратно пипетируя среду, содержащую нокодазол. Собирайте среду с отдельными ячейками из каждой 100-миллиметровой пластины в 50 мл стерильных пробирок, центрифугируйте (300 xg, 5 минут, комнатную температуру (RT)) и промывайте клетки дважды добавлением 1 × PBS с последующим центрифугированием. Рекомендуется использовать холодный PBS или PBS плюс нокодазол, чтобы избежать митотического проскальзывания (см. Раздел «Обсуждение»). Ресуспендируют митотические клетки, собранные с каждой 100-миллиметровой пластины в 10 мл полной среды. Сохраните 2 мл для экстракции РНК и 2 мл для анализа FACS для 0-часовой точки (приблизительно 0,2-0,25 × 10 6 клеток на образец). Остатки митотических клеток с повторной тарелкой для последующих временных точек в 6-луночных планшетах (2 мл / лунка, 0,2-0,25 × 10 6 клеток / лунка). ПРИМЕЧАНИЕ. Помните, что для выбранного момента времени требуется 2 лунки (1 для РНК и 1 для анализа FACS). Собирать образцы на selВремени. Каждые 1,5-3 часа рекомендуется для получения адекватного профиля прогрессирования клеточного цикла. Для экстракции РНК удалите среду, хорошо промойте 2 мл предварительно нагретого 1x PBS и добавьте 1 мл подходящего реагента для выделения РНК ( например, TRIzol) в лунку (выполните эту последнюю операцию в шкафу безопасности для химических веществ). Пипеткой вверх и вниз, чтобы отсоединить и лизировать клетки, перенести лизат клеток в 1,5 мл микроцентрифужную пробирку, инкубировать 5 минут при комнатной температуре и хранить пробирку при -80 ° C до дальнейшего использования. Для анализа FACS хорошо промыть 2 мл предварительно нагретого 1x PBS, добавить предварительно нагретый раствор трипсина-ЭДТА (0,3 мл / лунку) для отделения клеток, блокировать трипсин-ЭДТА путем добавления 1 мл полной среды и собирать каждый образец в отдельном 15 мл. Центрифужные клетки (300 xg, 5 минут, RT), сохраняют клеточный осадок и отбрасывают супернатант. Для того, чтобы фиксировать клетки, повторно суспендировать клетки в 1 мл охлажденного 70% (об. / Об.) Этанола в 1x PBS мягкими вортексирующими трубками и размещать их на льду для приложенияПримерно за 15 мин до хранения при 4 ° С или окрашиванию для дальнейшего анализа с помощью FACS (описано в шагах 1.4-1.5). HU-синхронизация и выпуск U2OS-клеток из границы G1 / S Подготовьте полную среду для культивирования клеток, как описано в шаге 1.1. Семена 0,25 × 10 6 клеток U2OS на лунку в 6-луночных планшетах (2 мл полной культуральной среды на лунку). Чтобы рассчитать количество скважин, необходимых для эксперимента, учтите, что в выбранный момент времени потребуется 1 лунка (1 скважина для извлечения РНК и 1 лунка для мониторинга клеточного цикла), и что 2 дополнительных лунки асинхронно растущих клеток Необходимо определить параметры компенсации анализа FACS. Позвольте клеткам присоединить, инкубируя 6-луночные планшеты в течение ночи (O / N) при 37 ° C в увлажненной атмосфере с 5% CO 2 . Удалите всю среду из лунок следующим утром и добавьте 2 млПредварительно нагретой свободной от FBS среды DMEM-глутамина на лунку. Инкубируйте клетки еще 24 часа при 37 ° C в увлажненной атмосфере с 5% CO 2 . ПРИМЕЧАНИЕ. Выполните этот шаг во всех лунках, кроме 2 (сохраненных для определения настроек FACS). Шаг снятия сыворотки может быть опущен, если эффективная синхронизация достигается путем простой инкубации клеток с HU. Остановка клеточного цикла G1 / S с помощью HU. Перед каждым использованием подготовьте свежий раствор HU (500 мМ). Добавьте 2 мл H 2 O до 76,06 мг порошка HU и перемешайте до полного растворения. Стерилизуют раствор фильтрованием через фильтр размера пор 0,2 мкм. Смешайте 50 мл полной среды с 400 мкл фильтрованного стерилизованного исходного раствора HU для конечной концентрации HU 4 мМ. Удалите среду из всех лунок, за исключением 2 лунок, необходимых для определения настроек FACS, и замените свежеприготовленной 4 мМ HU-содержащей полной средой (2 мл / лунку). Инкубируйте клетки в течение 24 ч вHU-среде при 37 ° C в увлажненной атмосфере с 5% CO 2 . Выделение клеток из HU-опосредованного ареста. Удалите HU-содержащую среду из лунок и дважды промывайте лунки предварительно разогретым 1x PBS (по 2 мл каждый раз). Добавьте 2 мл полной среды на лунку. Соберите 2 образца для 0-часовой временной точки (1 для экстракции РНК и 1 для проверки остановки клеточного цикла FACS), а также 2 сэмпла, сохраненные для настроек FACS. Поместите оставшиеся лунки в инкубатор. Собирайте образцы каждые 1,5-3 часа, чтобы получить адекватное распределение прогрессии клеточного цикла. В каждый момент времени выполняйте обработку образца (для экстракции РНК и для анализа FACS), как описано в 1.1.8.1-1.1.8.2. Лечение повреждающими ДНК агентами ПРИМЕЧАНИЕ. Всякий раз, когда целью является выяснение влияния соединения ( например, повреждающих ДНК агентов) в событиях клеточного цикла, любой из ранее описанных способов синхронизации может бытьВ сочетании с обработкой клеток генотоксическим агентом. Чтобы выбрать метод синхронизации, важно рассмотреть фазу клеточного цикла, которую мы хотели бы проанализировать. В общем, процедура Thy-Noc может быть подходящей для изучения влияния соединения в фазе G1 или S-фазы, тогда как HU-опосредованная синхронизация может быть более подходящей для изучения воздействия в фазах S-G2 или при входе в митоз. Анализ влияния генотоксических агентов на фазу G1 или S-фазы Синхронизировать ячейки, как описано в 1.1.2. До 1.1.6. Выделите клетки из нокодазола и повторно залейте их, как описано в 1.1.7. Инкубируйте их при 37 ° C в увлажненной атмосфере с 5% CO 2 в течение 3 часов, чтобы они прикреплялись до добавления агента (требуемый период инкубации может варьироваться в зависимости от клеточной линии). Добавьте агента и собирайте образцы, как описано выше в 1.1.8. Анализ влияния генотоксических агентов в SG2 фазы или вход M Синхронизировать ячейки, как описано в 1.2.2. До 1.2.5. Выпускайте ячейки из HU, как описано в 1.2.6. И немедленно добавить агент. Соберите образцы, как описано выше в 1.8. Мониторинг клеточной синхронизации и прогрессирования через клеточный цикл путем окрашивания пропидиум иодидом (PI) и анализа FACS ПРИМЕЧАНИЕ. Образцы, собранные во все моменты времени вместе с параметрами, необходимыми для определения настроек FACS, могут храниться при 4 ° C после их исправления (как указано в 1.1.8.2). Выполните окрашивание раствором PI, а затем анализ FACS для всех образцов эксперимента одновременно. PI интеркалирует в основную канавку двухцепочечной ДНК, получая высоко флуоресцентный сигнал при возбуждении при 535 нм с широким пиком излучения около 600 нм. Поскольку PI может также связываться с двухцепочечной РНК, необходимо обработать клетки РНКазой для оптимального разрешения ДНК. Подготовьте свежеприготовленный раствор для окрашивания PI. Базовый раствор PI может быть получен путем растворения порошка PI в PBS ( например, 5 мг / мл). Храните исходный раствор при 4 ° C (в темноте). Окрашивающий раствор состоит из PI (140 мкМ), цитрата натрия (38 мМ) и Triton X-100 (0,01% об. / Об.). Разогрейте соответствующую поверхность ( например, духовку) до 37 ° C. Центрифужные фиксированные клетки (450 xg, 5 минут, RT), декантирующий супернатант (этанол) и промывают один раз 1x PBS. Центрифужные клетки снова удалите PBS и добавьте 300 мкл PI-окрашивающего раствора на образец (кроме одного из образцов для настроек FACS, вместо этого добавьте PBS к этому образцу). Перенесите клетки в FACS Tubes (5 мл круглодонные полистирольные трубки). Добавьте 1 мкл РНКазы А в каждый образец, смешайте и инкубируйте образцы в течение 30 мин в темноте при 37 ° С. Образцы могут храниться защищенными от света при температуре 4 ° C в течение максимум 2 – 3 дней. Анализ содержания ДНК в образцах по потокуцитометрии. Определите параметры компенсации анализа FACS с асинхронным образцом, окрашенным PI. Используйте пустой образец (без раствора для окрашивания PI), чтобы проверить наличие аутофлуоресценции. Ранее описывался основанный на PI-опосредованный анализ содержания ДНК по проточной цитометрии 9 . Определение митотического индекса двойным фосфо-H3 (Ser 10) / PI-окрашиванием ПРИМЕЧАНИЕ. Клетки, подвергающиеся митозу, могут быть легко обнаружены проточной цитометрией с антителами, специфичными для фосфогистона H3 в серине 10 (pH3). Сопутствующее окрашивание PI полезно для определения распределения популяции клеток на основе содержания ДНК. Для оптимальных конфигураций настроек FACS требуются 5 образцов: пустая, только PI, только pH3, только вторичное антитело и двойное окрашивание. Центрифужные фиксированные клетки (450 xg, 5 мин, 4 ° C) и отбрасывают супернатант. Следующие этапы описаны для окрашивания в 15 мл пробирках. Вымойте ячейки, добавив 1Мл PBS-T (PBS + 0,05% Tween-20) в осадок и центрифугу (450 × g, 5 мин, 4 ° C). Удалите супернатант. Добавить антитело против pH3 (1: 500) в 100-200 мкл PBS-T + 3% BSA и инкубировать с качанием в течение 2 часов при RT (или O / N при 4 ° C). Добавляют 2 мл PBS-T (PBS + 0,05% Tween-20) и центрифугируют (450 xg, 5 минут, 4 ° C). Удалите супернатант. Вымойте еще раз, добавив 2 мл PBS-T в гранулу, центрифугируйте и удалите супернатант. Добавьте вторичное антитело (антитело против кролика AlexaFluor 488 в случае выбранного антитела pH3), разбавленное (1: 500) в 100-200 мкл PBS-T + 3% BSA и инкубируйте с качанием в течение 1 часа при RT (или O / N При 4 ° С). Защитите образцы от света. Промывают дважды PBS-T (2 мл) центрифугированием, как описано на этапе 1.5.4. Выполните окрашивание PI, как описано (шаги с 1.4.1 по 1.4.6). 2. Сбор и обработка образцов для анализа экспрессии генов принимать1,5 мл микроцентрифужных образцов в реакторе изоляции РНК из морозильной камеры и позволяют им оттаивать RT внутри шкафа безопасности для химических веществ. Добавьте 400 мкл хлороформа в каждый образец и энергично встряхните (но не вихрь) до полного смешивания. Инкубируйте образцы в течение 5 мин при комнатной температуре. Центрифужные пробирки в течение 15 мин (≥8000 xg, 4 ° C) в настольной микроцентрифуге. Перенесите водную (верхнюю) фазу в новую 1,5 мл микроцентрифужную пробирку и зарегистрируйте перенесенный объем (для упрощения процедуры рекомендуется собрать равные объемы во всех образцах эксперимента). Добавьте 1 объем 100% этанола медленно (по каплям) к водной фазе при перемешивании. Не центрифугируйте. Выполните следующие шаги с помощью коммерческого набора RNA mini prep. Пипетируйте до 700 мкл каждого образца, включая любой осадок, который может образоваться, в спиновую колонку в сборной трубке объемом 2 мл (предоставляется изготовителем). ЗакройКрышкой и центрифугой (≥ 8000 г, RT) в течение 15 с. Отбросьте поток. Повторите предыдущий шаг с оставшимся образцом (если есть). Следуйте инструкциям изготовителей для промывки и элюирования РНК (элюируйте каждый образец в 30-40 мкл нуклеазы без H 2 O для достижения соответствующей концентрации РНК для следующей стадии). Определить концентрацию РНК и чистоту образцов по измерениям поглощения (отношение A 260/280 2,0-2,1 указывает на хорошую чистоту образца РНК). Храните образцы РНК при -80 ° C до использования для анализа RT-qPCR. Для превращения РНК в кДНК и последующую количественную ПЦР возьмите 1 мкг РНК на образец и подготовьте реакцию ретротранскрипзы согласно инструкциям производителя. Полученные образцы кДНК можно хранить при 4 ° C (в течение нескольких дней) или при -20 ° C (в течение более длительных периодов времени). ПРИМЕЧАНИЕ. Подготовка образца, дизайн праймера и другие соображения для ПЦР в реальном времени были выполненыНапряженно описанных в литературе 22 , 23 .

Representative Results

Схематическое представление протоколов Thy-Noc и HU для синхронизации соты. На рисунке 1 приведены шаги, необходимые для синхронизации ячеек U2OS и последующего сбора проб, чтобы проверить прогрессирование через клеточный цикл и вы?…

Discussion

Анализ тонкоизмельченных регулируемых генов, участвующих в переходных и специфических ролях в клеточном цикле, требует однородной клеточной популяции. Многие исследователи обычно используют длинные линии опухолевых клеток для этих целей, и были разработаны различные методы для пол?…

Materials

DMEM, high glucose, GutaMAX supplement	Thermo Fisher Scientific	61965-059
FBS, qualified, E.U.-approved, South America origin	Thermo Fisher Scientific	10270-106
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	15140-122
0.25% Trypsin-EDTA (1X), phenol red	Thermo Fisher Scientific	25200-072
Thymidine	SIGMA	T1895-5G	Freshly prepared. Slight warming might help dissolve thymidine.
Nocodazole	SIGMA	M-1404	Stock solution in DMSO stored at -20 ºC in small aliquots
Hydroxyurea	SIGMA	H8627	Freshly prepared
Mitomycin C from Streptomyces caespitosus	SIGMA	M4287	1.5mM stock solution in sterile H2O protected from light and stored at 4ºC
Dimethyl sulfoxide	SIGMA	D2650
Propidium iodide	SIGMA	P4170	Stock solution in sterile PBS at 5 mg/ml, stored at 4º C protected from light.
PBS pH 7.6			Home made
Ethanol	PANREAC	A3678,2500
Chloroform	SIGMA	C2432
Sodium Citrate	PANREAC	131655
Triton X-100	SIGMA	T8787
RNAse A	Thermo Fisher Scientific	EN0531
TRIzol Reagent	LifeTechnologies	15596018
RNeasy Mini kit	QIAGEN	74106
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit	Thermo Fisher Scientific	4368814
Anti-Cyclin E1 antibody	Cell Signaling	4129	1:1000 dilution in 5% milk, o/n, 4 ºC
Anti-Cyclin B1 antibody	Cell Signaling	4135	1:1000 dilution in 5% milk, o/n, 4 ºC
Anti-β-actin	SIGMA	A-5441	1:3000 dilution in 5 % milk, 1 hr, RT
Anti-pH3 (Ser 10) antiboty	Millipore	06-570	Specified in the protocol
Secondary anti-rabbit AlexaFluor 488 antibody	Invitrogen	R37116	Specified in the protocol
Secondary anti-mouse-HRP antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-3697	1:3000 dilution in 5 % milk, 1 hr, RT
Forward E2F1 antibody (human)                    TGACATCACCAACGTCCTTGA	Biolegio		Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)
Reverse E2F1 antibody (human)                    CTGTGCGAGGTCCTGGGTC	Biolegio		Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)
Forward E2F7 antibody (human)                    GGAAAGGCAACAGCAAACTCT	Biolegio		Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)
Reverse E2F7 antibody (human)                    TGGGAGAGCACCAAGAGTAGAAGA	Biolegio		Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)
Forward p21Cip1 antibody (human)                    AGCAGAGGAAGACCATGTGGAC	Biolegio		Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)
Reverse p21Cip1 antibody (human)                    TTTCGACCCTGAGAGTCTCCAG	Biolegio		Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)
Forward TBP antibody (human) reference gene	Biolegio		Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)
Reverse TBP antibody (human)	Biolegio		Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)
Forward Oxa1L antibody (human) reference gene   CACTTGCCAGAGATCCAGAAG	Biolegio		Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)
Reverse Oxa1L  antibody (human)    CACAGGGAGAATGAGAGGTTTATAG	Biolegio		Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)
Power SYBRGreen PCR Master Mix	Thermo Fisher Scientific	4368702
FACS Tubes	Sarstedt	551578
MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate	Thermo Fisher Scientific	N8010560
Corning 100mm TC-Treated Culture Dish	Corning
Corning Costar cell culture plates 6 well	Corning	3506
Refrigerated Bench-Top Microcentrifuge	Eppendorf	5415 R
Refrigerated Bench-Top Centrifuge Jouan CR3.12	Jouan	743205604
NanoDrop Lite Spectrophotometer	Thermo Scientific	ND-LITE-PR
BD FACSCalibur Flow Cytometer	BD Bioscience
QuantStudio 3 Real-Time PCR System	Thermo Fisher Scientific	A28567