Method Article

Изучение экспрессии генов, регулируемых клеточным циклом, двумя протоколами синхронизации комплементарных ячеек

DOI:

10.3791/55745

⸱

June 6th, 2017

 ,  , 
1Department of Cell Biology and Histology, University of the Basque Country, UPV/EHU, 2Department of Genetics, Physical Anthropology and Animal Physiology, University of the Basque Country, UPV/EHU, 3Department of Molecular Mechanisms of Disease, University of Zurich

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы сообщаем о двух протоколах синхронизации ячеек, которые предоставляют контекст для изучения событий, связанных с конкретными фазами клеточного цикла. Мы показываем, что этот подход полезен для анализа регуляции специфических генов в невозмущенном клеточном цикле или при воздействии агентов, влияющих на клеточный цикл.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Программа экспрессии генов клеточного цикла представляет собой критический шаг для понимания процессов, зависящих от клеточного цикла, и их роли в таких заболеваниях, как рак. Анализ экспрессии генов, регулируемый клеточным циклом, зависит от синхронизации клеток на определенные фазы. Здесь мы описываем метод, использующий два дополнительных протокола синхронизации, которые обычно используются для изучения периодического изменения экспрессии генов во время клеточного цикла. Обе процедуры основаны на временном блокировании клеточного цикла в одной определенной точке. Протокол синхронизации обработкой гидроксимочевиной (HU) приводит к клеточному аресту в поздней фазе G1 / ранней S, а высвобождение из опосредованного HU задержания обеспечивает популяцию клеток, равномерно прогрессирующую через S и G2 / M. Протокол синхронизации лечения тимидином и нокодазолом (Thy-Noc) блокирует клетки в раннем митозе и высвобождение из опосредованного Thy-Noc остановки обеспечивает синхронизированную клеточную популяцию, подходящую для фазы G1 и S-фазыПопробуйте исследования. Применение обеих процедур требует мониторинга профилей распределения клеточного цикла, которые обычно выполняются после окрашивания пропидиум иодидом (PI) клеток и опосредованного потоком цитометрии анализа содержания ДНК. Мы показываем, что совместное использование двух протоколов синхронизации является надежным подходом к четкому определению транскрипционных профилей генов, которые дифференциально регулируются в клеточном цикле ( то есть E2F1 и E2F7) и, следовательно, лучше понимать их роль в клеточном цикле процессы. Кроме того, мы показываем, что этот подход полезен для изучения механизмов, лежащих в основе лекарственной терапии ( то есть митомицина С, противоопухолевого агента), поскольку он позволяет различать гены, которые реагируют на генотоксический агент от тех, на кого воздействуют только возмущения клеточного цикла Наложенных агентом.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Переход через все фазы клеточного цикла связан с плотно регулируемой программой экспрессии генов. Считается, что это скоординированное «включение и выключение» транскрипции генов в течение клеточного цикла находится под контролем сложных регуляторных систем транскрипции, регулирующих не только время, но также и уровни экспрессии генов. Известно, что дерегулирование компонентов ключевого клеточного цикла способствует развитию нескольких заболеваний и является хорошо зарекомендовавшим себя признаком опухолевого генеза 1 , 2 . Проведенные в клетках дрожжей и млекопитающих широкомасштабные транскриптомические анализы показали, что большое количество генов проявляют периодические образцы экспрессии генов в клеточном цикле, что указывает на то, что флуктуация транскрипции во время клеточного цикла является отражением временного требования к данному продукту гена В точной фазе 3 , 4 , 5 .

Основная задача изучения экспрессии генов, регулируемых клеточным циклом, - это синхронизация клеток на фазах конкретного клеточного цикла. Синхронизация клеток помогает интерпретировать ассоциацию шаблона экспрессии генов с конкретным фазовым переходом на клеточный цикл, и это привело к лучшему пониманию регуляции и функции многочисленных генов. Синхронизация клеток также важна для изучения механизма действия противораковых лекарств, поскольку известно, что химиотерапевтические агенты влияют как на экспрессию генов, так и на кинетику клеточного цикла 6 , 7 . Тем не менее, часто бывает трудно определить, являются ли различия в экспрессии генов, возникающие в результате лечения этими агентами, прямым ответом на лечение или являются просто следствием изменений в профилях клеточного цикла. Чтобы различать эти возможности, экспрессию генов следует анализировать в клетках, которые былиСинхронизируется до добавления химиотерапевтического препарата.

За исключением некоторых первичных клеток, таких как недавно выделенные лимфоидные клетки, которые представляют собой гомогенную популяцию клеток, синхронизированную в G0 8 , in vitro установленные клеточные линии асинхронно растут в культуре. При регулярных условиях роста эти асинхронно циклические клетки находятся во всех фазах клеточного цикла, но предпочтительно в G1 9 . Следовательно, этот контекст не обеспечивает оптимальный сценарий для анализа функциональных или генных экспрессии в конкретной фазе клеточного цикла ( например, G1, S и т. Д.). Не трансформированные иммортализованные клеточные линии ( например, фибробласты) могут быть синхронизированы с так называемыми физиологическими методами 10 . Эти методы основаны на сохраненных первичных клеточных характеристиках нетрансформированных клеток, таких как ингибирование клеточного контакта и зависимости фактора роста, чтобы продолжить циклирование. УдалениеСыворотки в сочетании с контактным торможением делает нерепрессированные клетки, арестованные в G0 / G1. Однако синхронизированный вход и прогрессирование циклического цикла часто требует субкультуры, которая также включает в себя искусственное отслоение клеток и повторное покрытие 10 . Самое главное, этот метод не подходит для синхронизации трансформированных клеточных линий, подавляющее большинство установленных клеточных линий, которые в настоящее время используются, характеризуется отсутствием клеточного опосредованного клеточным ингибированием роста или ответа на вывод фактора роста. Таким образом, ясно, что для эффективной синхронизации соты в конкретных фазах клеточного цикла требуются альтернативные методы. В общих чертах наиболее часто используемые методы синхронизации основаны на временном химическом или фармакологическом ингибировании одной определенной точки клеточного цикла, как правило, синтезе ДНК или образовании митотического веретена. Ингибирование синтеза ДНК синхронизирует клетки, останавливая их в поздней фазе G1 или ранней S. Это может быть achiПутем добавления таких соединений, как мимозин, ингибитора биосинтеза нуклеотидов 11 , 12 , афидиколина, ингибитора ДНК-полимераз 13 , 14 , гидроксимочевины, ингибитора рибонуклеотидредуктазы 15 , 16 или избыточных количеств тимидина 17 , 18 . С другой стороны, ингибиторы полимеризации микротрубочек, такие как колхицин или нокодазол, способны блокировать образование митотического веретена, приводя к синхронизации клеток на ранней фазе M 19 , 20 , 21 .

В этой работе мы описываем метод, включающий два дополнительных протокола синхронизации, основанных на переходном химическом ингибировании для изучения экспрессии генов, регулируемых клеточным циклом, в мРНКуровень. Этот метод является фундаментальным для определения роли генов клеточного цикла в конкретных процессах клеточного цикла. Кроме того, он обеспечивает общую структуру для изучения влияния противоопухолевых обработок, чтобы точно определить гены, чувствительные к лекарственным средствам, и свести к минимуму неверные истолкования, вызванные нарушениями в прогрессировании клеточного цикла, вызванными этими препаратами.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Сотовая синхронизация, выпуск и мониторинг прогрессирования клеточного цикла

  1. Синтез тимидина и нокодазола (Thy-Noc) и выделение клеток U2OS из митоза
    1. Подготовьте требуемую среду для культивирования клеток. Клетки U2OS обычно выращивают в среде DMEM-глутамина, дополненной 10% (об. / Об.) FBS (необязательно: 1% пенициллин / стрептомицин). Выполните всю подготовку и обработку среды в стерильных условиях и прогрейте дополнительную среду (отныне называемую «полной средой») до 37 ° C перед использованием.
    2. Семена 2 × 10 6 клеток U2OS на 100 мм чашку в 10 мл полной культуральной среды. Чтобы рассчитать количество необходимых блюд, учтите, что каждая 100-миллиметровая чашка обычно обеспечивает достаточное количество митотических клеток для повторной тарелки приблизительно 5 лунок 6-луночного планшета (0,2 - 0,25 × 10 6 клеток / лунка) (см . Рис. 1В ). Две лунки за выбранный момент времени являются обязательными(1 лунка для экстракции РНК и 1 лунка для мониторинга клеточного цикла). Кроме того, третья лунка может собираться в течение времени для анализа белка.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Пластинчатые ячейки вечером (около 7 вечера), чтобы последующие шаги можно было выполнить в рабочее время в следующие дни. Включите 2 дополнительных лунки асинхронно растущих клеток, чтобы определить параметры компенсации анализа FACS.
    3. Позвольте клеткам присоединить, инкубируя 100 мм посуду при 37 ° C в увлажненной атмосфере с 5% CO 2 в течение 24 часов.
    4. Для тимидинового блока готовят 200 мМ раствора тимидина путем растворения 145,2 мг тимидинового порошка в 3 мл H 2 O (или эквивалентных количеств) и стерилизуют раствор фильтрованием через фильтр размера пор 0,2 мкм. Небольшое потепление может помочь растворить тимидин. Добавьте 100 мкл свежеприготовленного 200 мМ штока в каждую 100-миллилитровую культуральную чашку (конечная концентрация 2 мМ). Инкубировать клетки с тимидином в течение 20 ч при 3776; C в увлажненной атмосфере с 5% CO 2 .
      ПРИМЕЧАНИЕ. Обработайте клетки вечером (около 7 часов вечера), чтобы успеть выполнить как высвобождение тимидина, так и блок-нокодазол на следующий день.
    5. Чтобы высвободить из блока тимидина, удалите тимидин, содержащий среду для роста, во второй половине дня следующего дня (15:00); Дважды промывайте клетки предварительно нагретым 1 × PBS и добавьте 10 мл полной среды к каждой 100-миллиметровой чашке. Инкубируйте клетки в течение 5 ч при 37 ° С в увлажненной атмосфере с 5% СО 2 .
    6. Для остановки митотических клеток добавьте нокодазол до конечной концентрации 50 нг / мл (8 часов). Подготовьте исходный раствор путем растворения порошка нокодазола в ДМСО ( например, 5 мг / мл) и хранить в замороженном состоянии при -20 ° С. Инкубируйте клетки с нокодазолом не более 10-11 часов при 37 ° C в увлажненной атмосфере с 5% CO 2 .
    7. Освобождение от опосредованного нокодазолом ареста в ранней М-фазе (митотическая встряска) и сбор проб в несколько раз поиNts (начиная с 6-7 утра).
      1. Отсоедините округлые (митотические) клетки, встряхивая каждую пластинку и аккуратно пипетируя среду, содержащую нокодазол. Собирайте среду с отдельными ячейками из каждой 100-миллиметровой пластины в 50 мл стерильных пробирок, центрифугируйте (300 xg, 5 минут, комнатную температуру (RT)) и промывайте клетки дважды добавлением 1 × PBS с последующим центрифугированием. Рекомендуется использовать холодный PBS или PBS плюс нокодазол, чтобы избежать митотического проскальзывания (см. Раздел «Обсуждение»).
      2. Ресуспендируют митотические клетки, собранные с каждой 100-миллиметровой пластины в 10 мл полной среды. Сохраните 2 мл для экстракции РНК и 2 мл для анализа FACS для 0-часовой точки (приблизительно 0,2-0,25 × 10 6 клеток на образец).
      3. Остатки митотических клеток с повторной тарелкой для последующих временных точек в 6-луночных планшетах (2 мл / лунка, 0,2-0,25 × 10 6 клеток / лунка).
        ПРИМЕЧАНИЕ. Помните, что для выбранного момента времени требуется 2 лунки (1 для РНК и 1 для анализа FACS).
    8. Собирать образцы на selВремени. Каждые 1,5-3 часа рекомендуется для получения адекватного профиля прогрессирования клеточного цикла.
      1. Для экстракции РНК удалите среду, хорошо промойте 2 мл предварительно нагретого 1x PBS и добавьте 1 мл подходящего реагента для выделения РНК ( например, TRIzol) в лунку (выполните эту последнюю операцию в шкафу безопасности для химических веществ). Пипеткой вверх и вниз, чтобы отсоединить и лизировать клетки, перенести лизат клеток в 1,5 мл микроцентрифужную пробирку, инкубировать 5 минут при комнатной температуре и хранить пробирку при -80 ° C до дальнейшего использования.
      2. Для анализа FACS хорошо промыть 2 мл предварительно нагретого 1x PBS, добавить предварительно нагретый раствор трипсина-ЭДТА (0,3 мл / лунку) для отделения клеток, блокировать трипсин-ЭДТА путем добавления 1 мл полной среды и собирать каждый образец в отдельном 15 мл.
        1. Центрифужные клетки (300 xg, 5 минут, RT), сохраняют клеточный осадок и отбрасывают супернатант. Для того, чтобы фиксировать клетки, повторно суспендировать клетки в 1 мл охлажденного 70% (об. / Об.) Этанола в 1x PBS мягкими вортексирующими трубками и размещать их на льду для приложенияПримерно за 15 мин до хранения при 4 ° С или окрашиванию для дальнейшего анализа с помощью FACS (описано в шагах 1.4-1.5).
  2. HU-синхронизация и выпуск U2OS-клеток из границы G1 / S
    1. Подготовьте полную среду для культивирования клеток, как описано в шаге 1.1.
    2. Семена 0,25 × 10 6 клеток U2OS на лунку в 6-луночных планшетах (2 мл полной культуральной среды на лунку). Чтобы рассчитать количество скважин, необходимых для эксперимента, учтите, что в выбранный момент времени потребуется 1 лунка (1 скважина для извлечения РНК и 1 лунка для мониторинга клеточного цикла), и что 2 дополнительных лунки асинхронно растущих клеток Необходимо определить параметры компенсации анализа FACS.
    3. Позвольте клеткам присоединить, инкубируя 6-луночные планшеты в течение ночи (O / N) при 37 ° C в увлажненной атмосфере с 5% CO 2 .
    4. Удалите всю среду из лунок следующим утром и добавьте 2 млПредварительно нагретой свободной от FBS среды DMEM-глутамина на лунку. Инкубируйте клетки еще 24 часа при 37 ° C в увлажненной атмосфере с 5% CO 2 .
      ПРИМЕЧАНИЕ. Выполните этот шаг во всех лунках, кроме 2 (сохраненных для определения настроек FACS). Шаг снятия сыворотки может быть опущен, если эффективная синхронизация достигается путем простой инкубации клеток с HU.
    5. Остановка клеточного цикла G1 / S с помощью HU.
      1. Перед каждым использованием подготовьте свежий раствор HU (500 мМ). Добавьте 2 мл H 2 O до 76,06 мг порошка HU и перемешайте до полного растворения. Стерилизуют раствор фильтрованием через фильтр размера пор 0,2 мкм. Смешайте 50 мл полной среды с 400 мкл фильтрованного стерилизованного исходного раствора HU для конечной концентрации HU 4 мМ.
      2. Удалите среду из всех лунок, за исключением 2 лунок, необходимых для определения настроек FACS, и замените свежеприготовленной 4 мМ HU-содержащей полной средой (2 мл / лунку).
      3. Инкубируйте клетки в течение 24 ч вHU-среде при 37 ° C в увлажненной атмосфере с 5% CO 2 .
    6. Выделение клеток из HU-опосредованного ареста. Удалите HU-содержащую среду из лунок и дважды промывайте лунки предварительно разогретым 1x PBS (по 2 мл каждый раз). Добавьте 2 мл полной среды на лунку. Соберите 2 образца для 0-часовой временной точки (1 для экстракции РНК и 1 для проверки остановки клеточного цикла FACS), а также 2 сэмпла, сохраненные для настроек FACS. Поместите оставшиеся лунки в инкубатор.
    7. Собирайте образцы каждые 1,5-3 часа, чтобы получить адекватное распределение прогрессии клеточного цикла. В каждый момент времени выполняйте обработку образца (для экстракции РНК и для анализа FACS), как описано в 1.1.8.1-1.1.8.2.
  3. Лечение повреждающими ДНК агентами
    ПРИМЕЧАНИЕ. Всякий раз, когда целью является выяснение влияния соединения ( например, повреждающих ДНК агентов) в событиях клеточного цикла, любой из ранее описанных способов синхронизации может бытьВ сочетании с обработкой клеток генотоксическим агентом. Чтобы выбрать метод синхронизации, важно рассмотреть фазу клеточного цикла, которую мы хотели бы проанализировать. В общем, процедура Thy-Noc может быть подходящей для изучения влияния соединения в фазе G1 или S-фазы, тогда как HU-опосредованная синхронизация может быть более подходящей для изучения воздействия в фазах S-G2 или при входе в митоз.
    1. Анализ влияния генотоксических агентов на фазу G1 или S-фазы
      1. Синхронизировать ячейки, как описано в 1.1.2. До 1.1.6.
      2. Выделите клетки из нокодазола и повторно залейте их, как описано в 1.1.7. Инкубируйте их при 37 ° C в увлажненной атмосфере с 5% CO 2 в течение 3 часов, чтобы они прикреплялись до добавления агента (требуемый период инкубации может варьироваться в зависимости от клеточной линии).
      3. Добавьте агента и собирайте образцы, как описано выше в 1.1.8.
    2. Анализ влияния генотоксических агентов в SG2 фазы или вход M
      1. Синхронизировать ячейки, как описано в 1.2.2. До 1.2.5.
      2. Выпускайте ячейки из HU, как описано в 1.2.6. И немедленно добавить агент.
      3. Соберите образцы, как описано выше в 1.8.
  4. Мониторинг клеточной синхронизации и прогрессирования через клеточный цикл путем окрашивания пропидиум иодидом (PI) и анализа FACS
    ПРИМЕЧАНИЕ. Образцы, собранные во все моменты времени вместе с параметрами, необходимыми для определения настроек FACS, могут храниться при 4 ° C после их исправления (как указано в 1.1.8.2). Выполните окрашивание раствором PI, а затем анализ FACS для всех образцов эксперимента одновременно. PI интеркалирует в основную канавку двухцепочечной ДНК, получая высоко флуоресцентный сигнал при возбуждении при 535 нм с широким пиком излучения около 600 нм. Поскольку PI может также связываться с двухцепочечной РНК, необходимо обработать клетки РНКазой для оптимального разрешения ДНК.
    1. Подготовьте свежеприготовленный раствор для окрашивания PI. Базовый раствор PI может быть получен путем растворения порошка PI в PBS ( например, 5 мг / мл). Храните исходный раствор при 4 ° C (в темноте). Окрашивающий раствор состоит из PI (140 мкМ), цитрата натрия (38 мМ) и Triton X-100 (0,01% об. / Об.).
    2. Разогрейте соответствующую поверхность ( например, духовку) до 37 ° C.
    3. Центрифужные фиксированные клетки (450 xg, 5 минут, RT), декантирующий супернатант (этанол) и промывают один раз 1x PBS.
    4. Центрифужные клетки снова удалите PBS и добавьте 300 мкл PI-окрашивающего раствора на образец (кроме одного из образцов для настроек FACS, вместо этого добавьте PBS к этому образцу).
    5. Перенесите клетки в FACS Tubes (5 мл круглодонные полистирольные трубки).
    6. Добавьте 1 мкл РНКазы А в каждый образец, смешайте и инкубируйте образцы в течение 30 мин в темноте при 37 ° С. Образцы могут храниться защищенными от света при температуре 4 ° C в течение максимум 2 - 3 дней.
    7. Анализ содержания ДНК в образцах по потокуцитометрии. Определите параметры компенсации анализа FACS с асинхронным образцом, окрашенным PI. Используйте пустой образец (без раствора для окрашивания PI), чтобы проверить наличие аутофлуоресценции. Ранее описывался основанный на PI-опосредованный анализ содержания ДНК по проточной цитометрии 9 .
  5. Определение митотического индекса двойным фосфо-H3 (Ser 10) / PI-окрашиванием
    ПРИМЕЧАНИЕ. Клетки, подвергающиеся митозу, могут быть легко обнаружены проточной цитометрией с антителами, специфичными для фосфогистона H3 в серине 10 (pH3). Сопутствующее окрашивание PI полезно для определения распределения популяции клеток на основе содержания ДНК. Для оптимальных конфигураций настроек FACS требуются 5 образцов: пустая, только PI, только pH3, только вторичное антитело и двойное окрашивание.
    1. Центрифужные фиксированные клетки (450 xg, 5 мин, 4 ° C) и отбрасывают супернатант. Следующие этапы описаны для окрашивания в 15 мл пробирках.
    2. Вымойте ячейки, добавив 1Мл PBS-T (PBS + 0,05% Tween-20) в осадок и центрифугу (450 × g, 5 мин, 4 ° C). Удалите супернатант.
    3. Добавить антитело против pH3 (1: 500) в 100-200 мкл PBS-T + 3% BSA и инкубировать с качанием в течение 2 часов при RT (или O / N при 4 ° C).
    4. Добавляют 2 мл PBS-T (PBS + 0,05% Tween-20) и центрифугируют (450 xg, 5 минут, 4 ° C). Удалите супернатант.
    5. Вымойте еще раз, добавив 2 мл PBS-T в гранулу, центрифугируйте и удалите супернатант.
    6. Добавьте вторичное антитело (антитело против кролика AlexaFluor 488 в случае выбранного антитела pH3), разбавленное (1: 500) в 100-200 мкл PBS-T + 3% BSA и инкубируйте с качанием в течение 1 часа при RT (или O / N При 4 ° С). Защитите образцы от света.
    7. Промывают дважды PBS-T (2 мл) центрифугированием, как описано на этапе 1.5.4.
    8. Выполните окрашивание PI, как описано (шаги с 1.4.1 по 1.4.6).

2. Сбор и обработка образцов для анализа экспрессии генов

  1. принимать1,5 мл микроцентрифужных образцов в реакторе изоляции РНК из морозильной камеры и позволяют им оттаивать RT внутри шкафа безопасности для химических веществ.
  2. Добавьте 400 мкл хлороформа в каждый образец и энергично встряхните (но не вихрь) до полного смешивания. Инкубируйте образцы в течение 5 мин при комнатной температуре.
  3. Центрифужные пробирки в течение 15 мин (≥8000 xg, 4 ° C) в настольной микроцентрифуге.
  4. Перенесите водную (верхнюю) фазу в новую 1,5 мл микроцентрифужную пробирку и зарегистрируйте перенесенный объем (для упрощения процедуры рекомендуется собрать равные объемы во всех образцах эксперимента).
  5. Добавьте 1 объем 100% этанола медленно (по каплям) к водной фазе при перемешивании. Не центрифугируйте.
  6. Выполните следующие шаги с помощью коммерческого набора RNA mini prep. Пипетируйте до 700 мкл каждого образца, включая любой осадок, который может образоваться, в спиновую колонку в сборной трубке объемом 2 мл (предоставляется изготовителем).
  7. ЗакройКрышкой и центрифугой (≥ 8000 г, RT) в течение 15 с. Отбросьте поток. Повторите предыдущий шаг с оставшимся образцом (если есть).
  8. Следуйте инструкциям изготовителей для промывки и элюирования РНК (элюируйте каждый образец в 30-40 мкл нуклеазы без H 2 O для достижения соответствующей концентрации РНК для следующей стадии).
  9. Определить концентрацию РНК и чистоту образцов по измерениям поглощения (отношение A 260/280 2,0-2,1 указывает на хорошую чистоту образца РНК). Храните образцы РНК при -80 ° C до использования для анализа RT-qPCR.
  10. Для превращения РНК в кДНК и последующую количественную ПЦР возьмите 1 мкг РНК на образец и подготовьте реакцию ретротранскрипзы согласно инструкциям производителя. Полученные образцы кДНК можно хранить при 4 ° C (в течение нескольких дней) или при -20 ° C (в течение более длительных периодов времени).
    ПРИМЕЧАНИЕ. Подготовка образца, дизайн праймера и другие соображения для ПЦР в реальном времени были выполненыНапряженно описанных в литературе 22 , 23 .

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Схематическое представление протоколов Thy-Noc и HU для синхронизации соты.

На рисунке 1 приведены шаги, необходимые для синхронизации ячеек U2OS и последующего сбора проб, чтобы проверить прогрессирование через клеточный цикл и выполнить анализ экспрессии генов.

Фосфо-H3 и окрашивание PI являются хорошими параметрами оценки для выбора методов синхронизац...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Анализ тонкоизмельченных регулируемых генов, участвующих в переходных и специфических ролях в клеточном цикле, требует однородной клеточной популяции. Многие исследователи обычно используют длинные линии опухолевых клеток для этих целей, и были разработаны различные методы для получения синхронных (или частично синхронных) клеточных популяций с целью накопления как можно большего количества клеток в определенных фазах клеточного цикла. Кроме того, были предприняты активные усилия для улучшения и оптимизации хорошо устан...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим членов лабораторий Zubiaga и Altmeyer за полезные обсуждения и техническую поддержку. Эта работа была поддержана грантами испанского министерства (SAF2015-67562-R, MINECO / FEDER, UE), правительством Басков (IT634-13 и KK-2015/89) и Университетом Страны Басков UPV / EHU ( UFI11 / 20).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
DMEM, с высоким содержанием глюкозы, добавка GutaMAXThermo Fisher Scientific61965-059
FBS, квалифицированный, одобренный ЕС, происхождениеиз Южной Америки Thermo Fisher Scientific10270-106
Пенициллин-стрептомицин (10 000 ЕД/мл)Thermo Fisher Scientific15140-122
0,25% трипсин-ЭДТА (1 шт.), феноловый красныйThermo Fisher Scientific25200-072
ТимидинSIGMAT1895-5GСвежеприготовленный. Небольшое нагревание может помочь растворить тимидин.
НокодазолСИГМАМ-1404Стоковый раствор в ДМСО, хранящийся при -20 &ордм; С в малых аликвотах
ГидроксимочевинаSIGMAH8627Свежеприготовленный
Митомицин С из Streptomyces caespitosusSIGMAM42871,5 мМ стоковый раствор в стерильном H<суб>2О защищен от света и хранится при 4&ордм; C
ДиметилсульфоксидSIGMAD2650
Пропидия йодидSIGMAP4170Стоковый раствор в стерильном PBS по дозе 5 мг/мл, хранят при 4 °ordm; C в защищенном от света месте.
PBS pH 7,6Домашний
этанолPANREACA3678,2500
ХлороформSIGMAC2432
Цитрат натрияPANREAC131655
Triton X-100SIGMAT8787
РНКаза AThermo Fisher ScientificEN0531
TRIzol ReagentLifeTechnologies15596018
RNeasy Mini kitQIAGEN74106
High-Capacity cDNA Reverse Transcription KitThermo Fisher Scientific4368814
Anti-Cyclin E1 антителаCell Signaling41291:1000 разведение в 5% молоке, o/n, 4 º C
Антициклин В1 антителоCell Signaling41351:1000 разведение в 5% молоке, о/н, 4 º C
Анти-&бета;-актинSIGMAA-54411:3000 разведение в 5 % молоке, 1 ч, RT
Anti-pH3 (Ser 10) антиботияMillipore06-570Указано в протоколе
Вторичное антитело против кролика AlexaFluor 488InvitrogenR37116Указано в протоколе
Вторичное антитело против мыши - HRP SantaCruz Biotechnologysc-36971:3000 разведение в 5 % молоке, 1 ч,
антитело RT Forward E2F1 (человек)                                      TGACATCACCAACGTCCTTGABiolegioРазработано инструментом PrimerQuest (https://eu.idtdna.com/site)
Обратное антитело к E2F1 (человек)                                      CTGTGCGAGGTCCTGGGTCBiolegioРазработано инструментом PrimerQuest (https://eu.idtdna.com/site)
Антитело Forward E2F7 (человек)                                      GGAAAGGCAACAGCAAACTCTBiolegioРазработано инструментом PrimerQuest (https://eu.idtdna.com/site)
Обратное антитело E2F7 (человек)                                      TGGGAGAGCACCAAGAGTAGAAGABiolegioРазработано с помощью инструмента PrimerQuest (https://eu.idtdna.com/site)
Forward p21Cip1 антитела (человеческие)                                      AGCAGAGGAAGACCATGTGGACBiolegioРазработано инструментом PrimerQuest (https://eu.idtdna.com/site)
Reverse p21Cip1 антитела (человеческие)                                      TTTCGACCCTGAGAGTCTCCAGBiolegioРазработано инструментом PrimerQuest (https://eu.idtdna.com/site)
Референсный ген антитела Forward TBP (человек)                                       BiolegioРазработано инструментом PrimerQuest (https://eu.idtdna.com/site)
Антитела обратного TBP (человека)                                       BiolegioРазработано с помощью инструмента PrimerQuest (https://eu.idtdna.com/site)
Референсный ген антитела Forward Oxa1L (человек)    CACTTGCCAGAGATCCAGAAG                                 BiolegioРазработано с помощью PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)
Reverse Oxa1L   антитела (человеческие)      CACAGGGAGAATGAGAGGTTTATAG                               BiolegioРазработано PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)
Power SYBRGreen PCR Master MixThermo Fisher Scientific4368702
FACS Tubes Sarstedt551578
MicroAmp Оптический 96-луночный реакционный планшетThermo Fisher ScientificN8010560
Corning 100 мм Чашка для обработанных TCCorning Corning
Corning Costar для клеточных культур 6 лунокCorning3506
Охлаждаемая настольная микроцентрифугаEppendorf5415 R
Охлаждаемая настольная центрифуга Jouan CR3.12Спектрофотометр Jouan743205604
NanoDrop LiteThermoScientific ND-LITE-PR
BD FACSКалибурный проточный цитометрBD Bioscience
QuantStudio 3 Система ПЦР в реальном времениThermo Fisher ScientificA28567
культур

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Beato, M., Sánchez-Aguilera, A., Piris, M. A. Cell cycle deregulation in B-cell lymphomas. Blood. 101 (4), 1220-1235 (2003).
  2. Chen, H. Z., Tsai, S. Y., Leone, G. Emerging roles of E2Fs in cancer: an exit from cell cycle control. Nat Rev Cancer. 9 (11), 785-797 (2009).
  3. Cho, R. J., et al. Transcriptional regulation and function during the human cell cycle. Nat Genet. 27 (1), 48-54 (2001).
  4. Peña-Diaz, J., et al. Transcription profiling during the cell cycle shows that a subset of Polycomb-targeted genes is upregulated during DNA replication. Nucleic Acids Res. 41 (5), 2846-2856 (2013).
  5. Grant, G. D., et al. Identification of cell cycle-regulated genes periodically expressed in U2OS cells and their regulation by FOXM1 and E2F transcription factors. Mol Biol Cell. 24 (23), 3634-3650 (2013).
  6. Minderman, H., et al. In vitro and in vivo irinotecan-induced changes in expression profiles of cell cycle and apoptosis-associated genes in acute myeloid leukemia cells. Mol Cancer Ther. 4 (6), 885-900 (2005).
  7. McKenna, E., Traganos, F., Zhao, H., Darzynkiewicz, Z. Persistent DNA damage caused by low levels of mitomycin C induces irreversible cell senescence. Cell Cycle. 11 (16), 3132-3140 (2012).
  8. Infante, A., et al. E2F2 represses cell cycle regulators to maintain quiescence. Cell Cycle. 7 (24), 3915-3927 (2008).
  9. Cecchini, M. J., Amiri, M., Dick, F. A. Analysis of cell cycle position in mammalian cells. J Vis Exp. (59), (2012).
  10. Schorl, C., Sedivy, J. M. Analysis of cell cycle phases and progression in cultured mammalian cells. Methods. 41 (2), 143-150 (2007).
  11. Lalande, M. A reversible arrest point in the late G1 phase of the mammalian cell cycle. Exp Cell Res. 186 (2), 332-339 (1990).
  12. Park, S. Y., et al. Mimosine arrests the cell cycle prior to the onset of DNA replication by preventing the binding of human Ctf4/And-1 to chromatin via Hif-1α activation in HeLa cells. Cell Cycle. 11 (4), 761-766 (2012).
  13. Ikegami, S., et al. Aphidicolin prevents mitotic cell division by interfering with the activity of DNA polymerase-alpha. Nature. 275 (5679), 458-460 (1978).
  14. Baranovskiy, A. G., et al. Structural basis for inhibition of DNA replication by aphidicolin. Nucleic Acids Res. 42 (22), 14013-14021 (2014).
  15. Adams, R. L., Lindsay, J. G. Hydroxyurea reversal of inhibition and use as a cell-synchronizing agent. J Biol Chem. 242 (6), 1314-1317 (1967).
  16. Mitxelena, J., Apraiz, A., Vallejo-Rodríguez, J., Malumbres, M., Zubiaga, A. M. E2F7 regulates transcription and maturation of multiple microRNAs to restrain cell proliferation. Nucleic Acids Res. , (2016).
  17. Bootsma, D., Budke, L., Vos, O. Studies on synchronous division of tissue culture cells initiated by excess thymidinE. Exp Cell Res. 33, 301-309 (1964).
  18. Galgano, P. J., Schildkraut, C. L. G1/S Phase Synchronization using Double Thymidine Synchronization. CSH Protoc. (2), (2006).
  19. Edwin Taylor, W. Kinetics of inhibition and the binding of h3-colchicine. J Cell Biol. 25, 145-160 (1965).
  20. Zieve, G. W., Turnbull, D., Mullins, J. M., McIntosh, J. R. Production of large numbers of mitotic mammalian cells by use of the reversible microtubule inhibitor nocodazole. Nocodazole accumulated mitotic cells. Exp Cell Res. 126 (2), 397-405 (1980).
  21. Matsui, Y., Nakayama, Y., Okamoto, M., Fukumoto, Y., Yamaguchi, N. Enrichment of cell populations in metaphase, anaphase, and telophase by synchronization using nocodazole and blebbistatin: a novel method suitable for examining dynamic changes in proteins during mitotic progression. Eur J Cell Biol. 91 (5), 413-419 (2012).
  22. Nolan, T., Hands, R. E., Bustin, S. A. Quantification of mRNA using real-time RT-PCR. Nat Protoc. 1 (3), 1559-1582 (2006).
  23. Thornton, B., Basu, C. Real-time PCR (qPCR) primer design using free online software. Biochem Mol Biol Educ. 39 (2), 145-154 (2011).
  24. Abbas, T., Dutta, A. p21 in cancer: intricate networks and multiple activities. Nat Rev Cancer. 9 (6), 400-414 (2009).
  25. Kung, A. L., Sherwood, S. W., Schimke, R. T. Cell line-specific differences in the control of cell cycle progression in the absence of mitosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 87 (24), 9553-9557 (1990).
  26. Borel, F., Lacroix, F. B., Margolis, R. L. Prolonged arrest of mammalian cells at the G1/S boundary results in permanent S phase stasis. J Cell Sci. 115 (Pt. 14, 2829-2838 (2002).
  27. Knehr, M., et al. A critical appraisal of synchronization methods applied to achieve maximal enrichment of HeLa cells in specific cell cycle phases). Exp Cell Res. 217 (2), 546-553 (1995).
  28. Zhu, W., Giangrande, P. H., Nevins, J. R. E2Fs link the control of G1/S and G2/M transcription. EMBO J. 23 (23), 4615-4626 (2004).
  29. Whitcomb, E. A., Dudek, E. J., Liu, Q., Taylor, A. Novel control of S phase of the cell cycle by ubiquitin-conjugating enzyme H7. Mol Biol Cell. 20 (1), 1-9 (2009).
  30. Bruinsma, W., Macurek, L., Freire, R., Lindqvist, A., Medema, R. H. Bora and Aurora-A continue to activate Plk1 in mitosis. J Cell Sci. 127, 801-811 (2014).
  31. Thomas, D. B., Lingwood, C. A. A model of cell cycle control: effects of thymidine on synchronous cell cultures. Cell. 5 (1), 37-42 (1975).
  32. Whitfield, M. L., et al. Identification of genes periodically expressed in the human cell cycle and their expression in tumors. Mol Biol Cell. 13 (6), 1977-2000 (2002).
  33. Lim, S., Cdks Kaldis, P. cyclins and CKIs: roles beyond cell cycle regulation. Development. 140 (15), 3079-3093 (2013).
  34. Tapia, C., et al. Two mitosis-specific antibodies, MPM-2 and phospho-histone H3 (Ser28), allow rapid and precise determination of mitotic activity. Am J Surg Pathol. 30 (1), 83-89 (2006).
  35. Andreassen, P. R., Martineau, S. N., Margolis, R. L. Chemical induction of mitotic checkpoint override in mammalian cells results in aneuploidy following a transient tetraploid state. Mutat Res. 372 (2), 181-194 (1996).
  36. Wei, F., Xie, Y., He, L., Tao, L., Tang, D. ERK1 and ERK2 kinases activate hydroxyurea-induced S-phase checkpoint in MCF7 cells by mediating ATR activation. Cell Signal. 23 (1), 259-268 (2011).
  37. Kubota, S., et al. Activation of the prereplication complex is blocked by mimosine through reactive oxygen species-activated ataxia telangiectasia mutated (ATM) protein without DNA damage. J Biol Chem. 289 (9), 5730-5746 (2014).
  38. Hartwell, L. H., Weinert, T. A. Checkpoints: controls that ensure the order of cell cycle events. Science. 246 (4930), 629-634 (1989).
  39. St-Denis, N. A., Derksen, D. R., Litchfield, D. W. Evidence for regulation of mitotic progression through temporal phosphorylation and dephosphorylation of CK2alpha. Mol Cell Biol. 29 (8), 2068-2081 (2009).
  40. Min, A., et al. RAD51C-deficient cancer cells are highly sensitive to the PARP inhibitor olaparib. Mol Cancer Ther. 12 (6), 865-877 (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cell Cycle SynchronizationHydroxyurea TreatmentThymidine NocodazoleFlow Cytometry AnalysisGene Expression AnalysisRNA Extraction ProtocolPropidium Iodide StainingU2OS CellsMitotic Cell ArrestG1 S Boundary

Related Articles