Очистка биотинилированных клеточных поверхностных белков от Ripicephalus microplus Эпителиальные кишечные клетки

Summary

Методика, основанная на модифицированном градиенте плотности центрифугирования, была использована для выделения эпителиальных клеток из ткани кишечника Ripicephalus microplus . Поверхностные белки биотинилировали и очищали с помощью стрептовидиновых магнитных гранул для использования в нисходящих приложениях.

Abstract

Rhipicephalus microplus - клещ крупного рогатого скота - является самым значительным эктопаразитом с точки зрения экономического воздействия на скот в качестве вектора нескольких патогенов. Усилия были направлены на контроль клеща крупного рогатого скота, чтобы уменьшить его пагубные последствия, с упором на открытие кандидатов на вакцины, таких как BM86, расположенных на поверхности эпителиальных клеток кишечника. В текущих исследованиях основное внимание уделяется использованию кДНК и геномных библиотек для скрининга других кандидатов на вакцины. Выделение клеток клещей кишки является важным преимуществом при исследовании состава поверхностных белков на мембране клеток клещей. Эта статья представляет собой новый и осуществимый метод выделения эпителиальных клеток, из содержимого кишечника в виде полупоглощенного R. microplus. В этом протоколе используются TCEP и EDTA для высвобождения эпителиальных клеток из субэпителиальных опорных тканей и градиента дискретной плотности центрифугированияNt для отделения эпителиальных клеток от других типов клеток. Белки клеточной поверхности были биотинилированы и выделены из эпителиальных клеток тикового кишечника, используя магнитные гранулы, связанные с стрептавидином, что позволяет использовать последующие приложения в FACS или LC-MS / MS-анализе.

Introduction

Rhipicephalus microplus , крупный рогатый скот, является самым значительным эктопаразитом с точки зрения экономического воздействия на крупный рогатый скот в тропических и субтропических регионах, поскольку он переносит лихорадку крупного рогатого скота (бабезиоз), анаплазмоз и конский пироплазмоз ^{1 , 2 , 3 , 4} . Усилия были направлены на контроль крупного рогатого скота, чтобы уменьшить пагубный эффект, однако обычные методы, такие как использование химических акарицидов, имеют скрытые недостатки, такие как наличие химических оста....

Protocol

1. Рассечение кишечного эпителия от R. microplus

1. Собирайте полупоглощенные клещи от крупного рогатого скота в день эксперимента. Просеивать тики в течение 24 часов после удаления с хозяина.
2. Прикрепите полоску клейкой ленты к нижней части чашки Петри размером 92 мм x 16 мм. Добавьте каплю супер клея на ленту. Поместите тик, вентральную сторону вниз на супер клей, дайте высохнуть в течение 2 мин.
3. Налейте 100 мл фосфатно-буферного солевого раствора (PBS) в чашку Петри или до тех пор, пока тик не будет полностью погружен в воду.
4. С помощью скальпеля размером 11, вырезанного с верхней части глаз до нижнего фес....

Results

Эпителиальные клетки были выделены из тканей кишечника R. microplus в соответствии с схемой, представленной на рисунке 1 . Репрезентативные снимки флуоресцентной микроскопии эпителиальных клеток кишечника, полученные с использованием этого протокола, показаны на фиг.2А И 2В. Поскольку изоляция клеток проводится на полупоглощенном R. microplus,.......

Discussion

Население крупного рогатого скота представляет собой серьезную проблему для крупного рогатого скота в тропических и субтропических регионах мира, причем наиболее распространенный метод контроля зависит от использования акарицидов ^{1 , 4} . Bm86 ранее был идентифицирован в эпителиальной поверхности кишечника тика в качестве защитного антигена против заражения R. microplus ¹⁰ с ограниченным успехом в качестве стратегии вакцинации из-.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,4% Trypan Blue	ThermoFisher Scientific	15250061
1,5 мл микроцентрифужная пробирка	Eppendorf	3322
100mM Карбонатный буфер			3,03 г Na2CO3, 6,0 г NaHCO3 1000 мл дистиллированная вода pH 9,6
16 мл центрифужные пробирки с уплотнительным колпачком	Thermo Scientific	3138-0016	Охладить во льду перед градиентом
250 & микро; Ситечко для клеток M	Thermo Fisher	87791
3,3′,5,5′-тетраметилбензидина (TMB) Жидкая субстрат для ИФА	Sigma	T0440	хранится при 4C
30% перекись водорода	Labscene	BSPA5.500
4-20% Tris-MOPS Gel	Gen Script	M42015
4-хлор-1-нафтол таблетка	Sigma-Aldrich	C6788
50 мл Falcon Tube	Corning Blue		30 x 115 мм стиль. Полипропиленовая коническая трубка.
70 &микро; Ситечко для клеток М	BD Falcon	352350
AP15 фильтровальная бумага	Миллипор	AO1504200
биотина (тип А) Набор для конъюгации Abcam	Ab102865
Микроскоп для рассечения	Olympus	SZX7
DP Manager	Olympus	2.2.1.195	Программное обеспечение для съемок ячеек
Клейкая лента	Home Handyman		48 мм x 25 мм Клейкая лента
Dulbecco' s Модифицированный Eagle Medium	Gibco	11995-065	DMEM - ледяной для протокола
EDTA	Amresco	0105-500G
F96 Maxisorp Immuno Plate	Nunc	439454
фетальной бычьей сывороткой	Sigma-Aldrich	12003C
FCS Флуоресцентный микроскоп	Олимп	BX51
Флюорощит с DAPI	Sigma-Aldrich	F6057-20ML
DAPI Щипцы	Dumont		#9 Dumont - Switerzland
Glycerin	Sigma-Aldrich	G5516	Глицерин для молекулярной биологии >99%
Глицин	Sigma-Aldrich	410225
ручной прилавок	Officeworks	JA0376230
Хэнк s Сбалансированный солевой раствор	Sigma Life Sciences	H9394	HBSS – ледяной для протокола
Гемацитометр	Optik Lakor	-
-L-L-глутатион окисленный	Sigma-Aldrich	G4376
Стенд для магнитной сепарации	Novagen-4-Tube		Магнитный сепарационный штатив
Метанол	Sigma-Aldrich	179337
Milli-Q Water	Millipore	ZRXQ003WW	Встроенная система очистки воды для сверхчистой воды
Нитроцеллюлозная мембрана	Life Sciences	66485	30 см x 3 м чистая нитроцеллюлозная мембрана
PageRuler Prestained protein Ladder	Thermo-Fisher	SM0671
PBS			1,16 г Na2HPO4, 0,1 г KCl, 0,1 г K3PO4, 4,0 г NaCl (500 мл дистиллированной воды) pH 7,4
Percoll	Sigma-Aldrich	P1644-500ML
Перистальтический насос	Masterflex	7518-10
Фосфорная кислота	Sigma-Aldrich	P6560
Pierce Безбелковый T20 PBS Блокирующий буфер	Thermo-Scientific	37573	Хранится при 4C. Блокирующий буфер
Ингибитор протеазы Коктейль	Sigma-Aldrich	P8215-5ML	PIC – хранилось при -20 ° C
Быстрый старт Bradford Dye Reagent 1x	Biorad	500-0205	Для Bradford Assay
Быстрый старт Стандарты BSA	Biorad	500-0207	Стандарты BSA для Bradford Assay
	Scalpel Lab. Co		Size 11 Scalpel
SilverQuest TM Набор для окрашивания	Invitrogen	LC6070
Simply Blue TM Safe Stain	Invitrogen	LC6060
Sorvall C6+ Ультрацентрифуга	Thermo Scientific	46910
Стрептавидин (HRP)	Abcam	AB7403
Стрептавидин Магнитные шарики	New England Biolabs	S1420S
Суперклей - Ультра Быстрый Мини	UHU		Супер Клей 1 мг. Ультра Быстрая мини
Настольная Центрифуга	Eppendorf	22331
TCEP	Thermo Fisher	20490
Triton X-100	Biorad	161-0407
Tween-20	Sigma	P2287-500ML
Вихревой смеситель	Ratek	VM1
Водяная баня	Грант	GD100