Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

В пробирке Дифференцировка мезенхимальных стволовых клеток человека в функциональных клетки Cardiomyocyte как

10.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/55757

⸱

9 августа 2017 г.

 ,  ,  , 
1Create Fertility Centre, 2Department of Physiology, University of Toronto, 3Department of Obstetrics and Gynecology, University of Toronto, 4Department of Physiology, University of Toronto, 5Department of Obstetrics and Gynecology, Women's College Hospital

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы представляем метод эффективно использовать потенциал сердца дифференциация молодых источников мезенхимальных стволовых клеток человека с целью создания функционального, Договаривающихся, cardiomyocyte подобных клеток в пробирке.

Аннотация

Инфаркт миокарда и последующих ишемического Каскад привести к гибели кардиомиоцитов, приводит к сердечной недостаточности, ведущей причиной смертности во всем мире. Мезенхимальных стволовых клеток (МСК) являются перспективным вариантом для терапии на базе ячеек для замены текущего, инвазивные методы. MSCs могут дифференцироваться в мезенхимальных линий, включая типы клеток сердца, но полная дифференциация в функциональных клетки пока не достигнуто. Предыдущие методы дифференциации были основаны на фармакологических агентов или факторы роста. Однако более физиологически соответствующие стратегии можно также включить MSCs для прохождения cardiomyogenic преобразования. Здесь мы представляем дифференциация метод, с помощью MSC агрегатов на слоях фидер cardiomyocyte производить Договаривающихся клетки cardiomyocyte как.

Человеческой пуповинной периваскулярной клетки (HUCPVCs), было показано, имеют больше потенциал, чем дифференциация обычно расследуются MSC типы, такие как костного MSCs (BMSCs). Как источник онтогенетически младший мы исследовали потенциал cardiomyogenic первого триместра (FTM) HUCPVCs по сравнению с старше источников. FTM HUCPVCs являются роман, богатым источником MSCs, которые сохраняют в утробе матери immunoprivileged свойства когда культивировали в пробирке. Используя этот протокол дифференциации, FTM и срок HUCPVCs достигнуто значительное увеличение cardiomyogenic дифференциации по сравнению с BMSCs, как указано выражением увеличение cardiomyocyte маркеров (то есть, myocyte усилитель фактор 2 C, сердечной тропонина T, тяжелой цепи миозина и сердца, сигнал регламентационный протеин α и connexin 43). Они также поддерживали значительно ниже иммуногенность, как свидетельствует их нижняя выражение HLA-A и выше выражение HLA-G. Применяя дифференциация на основе совокупности, FTM HUCPVCs показал увеличение совокупного формирования потенциал и созданные Договаривающимися кластеры клеток в течение 1 недели совместного культуры на слои сердца фидер, став первый тип MSC сделать это.

Наши результаты показывают, что эта стратегия дифференциации могут эффективно использовать потенциал cardiomyogenic молодых MSCs, таких как HUCPVCs FTM и предполагает, что в vitro предварительно дифференциация может быть потенциальной стратегии увеличить их эффективность регенерации в естественных условиях.

Введение

Застойной сердечной недостаточности (CHF) по-прежнему является основной причиной заболеваемости и смертности во всем мире. CHF часто происходит после гибели кардиомиоцитов и развитие свободных клеток рубцовой ткани в результате патологических инфаркт миокарда (MI)1. В то время как сердце является органом, частично самостоятельного обновления, резидентов стволовых и прогениторных клеток бассейн отвечает за выполнение регенерации тканей значительно уменьшается в изобилии и функции у пожилых больных, часто становится недостаточным для оптимального восстановления после травмы. Таким образом существует большой интерес к разработке экспериментальных методов лечения, включающие трансплантации здоровых доноров клеток в поврежденную миокарда. Важно, что клеток донора не только восстановить структуру ткани, но также достичь функциональное восстановление пострадавших миокарда.

Родной сердце занято сердце ткани резидентов и эндогенных стволовых клеток костного мозга-возникла для после травмы ремонт2,3,4. Регенеративной клетки хост - и доноров получены так должны имеют возможности для получения соответствующих фенотипа и функции в микроокружения ремоделирования миокарда, наряду с возможностью эффективно и безопасно заменить потерянные клеток. В vitro методы дифференциации широко использовались для достижения высокой эффективности, основанные на стволовые клетки cardiomyocyte производства5,6. Профиль выражения сердечной lineage маркеров используется для определения процесса дифференцировки стволовых клеток к сердечной линии7. Ранних дифференциация маркеров, такие как NKX2.5, myocyte усилитель фактор 2 C (Mef2c) и GATA48,9, может быть признаком начала процесса cardiomyogenic. Зрелые cardiomyocyte маркеров широко используется для оценки эффективности дифференциация являются сигнала регламентационный протеин α (СИРПА)10, сердечной тропонина T (cTnT)11, тяжелой цепи миозина сердца (MYH6)8,12,13и connexin 43 (Cx43)14,,1516. Методы с использованием эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) и плюрипотентных стволовых клеток (Чок) были тщательно оптимизированы и обсудили детали индуктивные факторы, кислорода и питательных веществ градиенты, и точные сроки действий5,6,7,17,18. Тем не менее ESC - и PSC-технологий по-прежнему представляют несколько проблемы этики и безопасности, наряду с неоптимальной электрофизиологических и иммунологические особенности19,20. Хозяева, пересаженные с эти клетки часто опыт immunorejection и требуют постоянного иммунодепрессией. Это объясняется главным образом рассогласовывать гистосовместимости (MHC) сложных молекул в принимающих стран и доноров и в результате Т-клеточный ответ21. Хотя отдельные MHC класса I соответствия является одним из возможных решений, более доступным клинической практике потребует ячейку источник, который является универсально immunoprivileged преодолеть беспокойство отказ.

Как источник альтернативной клеток для клинического применения, MSCs и в частности, BMSCs, были расследованы для использования в регенерации тканей после их первоначального описания в 1995 году22. MSCs считается резидентом регенерации клеток, которые можно найти в почти любой васкуляризированной ткани23. После изоляции от нужного источника MSCs может быть легко расширена в культуре, имеют обширные паракринными потенциала и часто имеют immunoprivileged или иммуномодулирующих свойств24,25. Их безопасность и эффективность уже были показаны в нескольких доклинические исследования, в частности для сердца регенерации3,26.

Многие стратегии дифференциации MSC используют фармакологических агентов, таких как 5-azacytidine22 и27ДМСО и роста или морфообразующих факторы, такие как BMP5,7,,2829 или ангиотензина II30, с различной эффективности. Однако, эти стратегии, не основаны на тех препятствий, которые наивно регенеративной ячейке может столкнуться после самонаведения или доставляются к месту травмы в vivo. Более физиологически соответствующих стратегий, в то время как более трудно определить и манипулировать, основаны на той предпосылке, что MSC дифференциация может быть вызван через сигналы от микроокружения ткани, сам. Предыдущие исследования показали, что воздействие сердечной клетки лизатов31 или миокарда желудочков32,33, или прямой контакт с первичной кардиомиоцитов в vitro15,34, может увеличить выражения сердечной маркеров в MSCs. Другие продемонстрировали спонтанное cardiomyogenesis после лечения сердца травмы с MSCs35,,3637,38, хотя частично, слияние BMSCs и кардиомиоцитов39,40 сгенерированный зарождающейся миокарда. К нашему знанию функциональных, спонтанно Договаривающихся кардиомиоцитов из человека MSCs (использования) любого источника ткани пока не сообщалось.

Текущий консенсус в том, что все MSCs возникают из клеток периваскулярной23. Молодые MSCs с перицит свойства могут быть изолированы от регионе периваскулярной человеческой пуповинной ткани41,,4243. По сравнению с BMSCs HUCPVCs обладают рост дифференциации потенциал и несколько других восстановительных преимущества, как в vitro41,44 и в естественных условиях45,46,47. Примечательно источник, будучи интерфейсе матери и плода, HUCPVCs имеют значительно ниже иммуногенность, по сравнению с взрослых источники MSCs. Наши исследования посвящена характеристика и доклинические приложений FTM HUCPVCs, младший источник MSCs расследование, который мы показали ранее увеличились пролиферативных и выше multilineage дифференциация потенциала, в том числе в родословной cardiomyogenic41.

Здесь мы представляем протокол, который сочетает в себе совокупного образования и первичной сердечной клетки фидера слои как индукционные силы для достижения полного cardiomyogenic дифференциация агрегатов MSCs. обеспечивают 3D окружающей среды, которая лучше моделирует условия в естественных условиях по сравнению с 2D адэрентных культур. Использование слоев сердца фидер предоставляет среду, которая является представителем конечной трансплантации сайта для MSCs. Мы продемонстрировать, что младший источники MSCs, изолированных от пуповины до или после родов имеют высокий потенциал формы агрегатов и достичь сердца фенотип, по сравнению с взрослых BMSCs, сохраняя при этом их иммунная привилегия. Помимо крутой высоты сердечной линии маркерных генов и индуцированных выражение внутриклеточных (то есть, cTnT и MYH6) и поверхности клетки белки (т.е., СИРПА и Cx43) специфически для кардиомиоцитов, мы показываем, что дифференциация потенциал FTM HUCPVCs могут быть использованы с этим методом, и что они могут привести к спонтанно Договаривающихся клетки cardiomyocyte как.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все исследования с участием животных были проведены и сообщены в соответствии с рекомендациями ARRIVE48. Все исследования были проведены с одобрения Совета по этике институциональных исследований (REB No 454-2011, Научно-исследовательский институт Саннибрук; REB 29889, Университет Торонто, Торонто, Канада). Все процедуры для животных были одобрены Комитетом по уходу за животными Университетской сети здравоохранения (Торонто, Канада), и все животные получили гуманный уход в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных,8-е издание (National Institutes of Health 2011).

1. Культура тканей

  1. Культура FTM HUCPVC, термин HUCPVC (ранее установленные, n ≥ 3 независимые линии для каждой)42 и коммерчески доступные BMSCs в альфа-минимальной эссенциальной среде (MEM) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% коктейля пенициллин/стрептомицин (P/S). Культивирование первичных кардиомиоцитов крыс и МСК-кардиомиоцитов в модифицированной среде Dulbecco: смесь питательных веществ F-12 (DMEM-F12), содержащую 10% FBS и 1% P/S.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Стерилизуйте среду с помощью фильтра размером 0,2 мкм. Приготовленные растворы сред хранить при температуре 4 °С до 3 недель.
  2. Поддерживайте клеточные культуры во увлажненных инкубаторах (относительная влажность 95%, 37 °C и 5%CO2) и пассаж при 70-80% конфлюенции, определяемой с помощью фазово-контрастной микроскопии. Используйте соответствующие объемы среды для размера используемой чашки для тканевых культур (например, 10 мл в чашке диаметром 10 см и 2 мл на лунку в планшете для культуры тканей с 6 лунками). Используйте эти условия культивирования в течение всего срока действия протокола.
  3. Диссоциировать монослои МСК для пассирования или совместного культивирования МСК-кардиомиоцитов с помощью раствора фермента диссоциации (2 мл/лунка в 6-луночном планшете) и инкубировать при 37 °C в течение 4 мин.
  4. Перенесите диссоциированные клетки в пробирку объемом 15 мл и центрифугируйте при давлении 400 x g в течение 5 минут.
  5. Аспирируйте надосадочную жидкость, не нарушая клеточную гранулу, и ресуспендируйте клетки в 1 мл питательной среды, пригодной для подсчета с помощью автоматизированного клеточного счетчика. Засейте клетки, как описано в следующих разделах протокола.

2. Получение первичных кокультур кардиомиоцитов крыс-МСК

  1. Получение сердечной ткани для выделения первичных кардиомиоцитов.
    1. Усыпляйте крысят (через 5-6 дней после рождения) с помощью удушенияСО2. Установите камеры CO2 на замену газа на 20% (расход = 0,2 x объем камеры в минуту). Подтвердите выход по отсутствию защипывающего рефлекса.
    2. Удалите предсердия с соединительными крупными кровеносными сосудами с помощью стерилизованных инструментов (т.е. щипцов и изогнутых ножниц)41. Переложите сердце в трубки объемом 50 мл, содержащие стерильный PBS с 1% P/S (PBS-P/S) на льду.
    3. Разрежьте желудочки пополам и дайте крови вымыться в 10-сантиметровой посуде с 10 мл PBS-P/S на льду. Разрежьте стенки желудочков на небольшие кусочки (диаметр = 2-3 мм) с помощью изогнутых ножниц.
    4. Перенесите кусочки сердца от 10-12 животных в трубку объемом 50 мл с помощью серологической пипетки и дайте им осесть.
    5. Удалите как можно больше PBS-P/S, не удаляя сердечники. Добавьте 10 мл нового PBS-P/S.
  2. Переварите сердечную ткань для выделения кардиомиоцитов.
    1. Дайте кусочкам сердца осесть. Замените PBS-P/S 10 мл 0,15% трипсина в PBS и встряхивайте при 37 °C в течение 10 минут.
    2. Выбросьте надосадочную жидкость. Повторите процесс разложения, описанный в шаге 2.2.1, еще три раза, но сцедите надосадочную жидкость в пробирки для сбора объемом 50 мл, содержащие 10 мл 100% FBS.
  3. Центрифугируйте клетки (400 x g, 5 мин) и отаскайте надосадочную жидкость. Ресуспендируйте клетки в DMEM-F12, содержащем 10% FBS и 1% P/S, и затравите на 6-луночный планшет (1 x 105 клеток/см2, 2 мл среды на лунку).
  4. Через 1 ч перенесите среду, содержащую неприкрепленные клетки, в пробирку объемом 50 мл и выбросьте прикрепленные клетки. Подсчитайте клетки в суспензии и повторно поместите их в новые 6-луночные планшеты (1 x 105 клеток/см2, 2 мл DMEM-F12, содержащего 10% FBS и 1% P/S на лунку).
  5. Ингибирование пролиферации клеток с помощью брмодеоксиуридина (BrdU).
    Внимание: BrdU является сильным тератогеном и подозревается в мутагене. Пожалуйста, убедитесь, что проведено надлежащее обучение, и ознакомьтесь с паспортом безопасности перед использованием.
    1. После присоединения ячеек замените среду в 6-луночном планшете на DMEM-F12, содержащую 10% FBS, 1% P/S (2 мл среды на лунку) и 5 мкМ BrdU. Выдерживать в течение 16 ч (37 °C, 5%CO2).
    2. Удалите среду, содержащую BrdU, и замените ее на DMEM-F12, содержащую 10% FBS и 1% P/S (2 мл среды на лунку).
  6. Подготовьте предварительно окрашенные МСК.
    1. Как только культуры МСК достигнут 70-80% конфлюенции в 10-сантиметровых чашках, удалите питательную среду и добавьте 3 мл раствора для диссоциации клеток. Инкубируйте блюдо при температуре 37 °C и 5%CO2 в течение 5 минут.
    2. Перенесите диссоциированные клетки в пробирку объемом 15 мл и центрифугируйте при давлении 400 x g в течение 5 минут.
    3. Аспирируйте надосадочную жидкость, не нарушая клеточную гранулу, и ресуспендируйте клетки в 1 мл DMEM-F12, содержащего 10% FBS и 1% P/S для подсчета с помощью автоматизированного счетчика клеток.
    4. Разбавьте клетки до концентрации 1 x 106 MSC/мл DMEM-F12, содержащего 10% FBS и 1% P/S.
    5. Инкубируйте МСК с жизнеспособным, непереносимым флуоресцентным красителем (5 мкМ, 30 мин, 37 °C, 5% CO2) в центрифужных пробирках объемом 1,5 мл в течение 1 ч.
    6. Центрифугируйте пробирки при давлении 400 x g в течение 5 мин. Аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулу в DMEM-F12, содержащем 10% FBS и 1% P/S, для получения концентрации клеток 1 x 106 MSC/мл. Повторите это в общей сложности 3 раза.
  7. Перенесите МСК на кардиомиоциты (шаг 2.5.2) в концентрации 10 х 104 клеток на лунку 6-луночного планшета.

3. Подготовка агрегированных сокультур

  1. Приготовьте одноклеточную суспензию МСК (2 x 104 клеток/мл среды, пассаж # ≤ 6) в альфа-МЕМ с добавлением 10% FBS и 1% P/S (см. шаг 2.6).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обратитесь к разделу 1 протокола о прохождении клеток. В качестве альтернативы, предварительно окрашивайте МСК в соответствии с шагом 2.6.
  2. Инициируйте образование агрегатов, поместив капли 25-мл клеточной суспензии (500 клеток) на внутреннюю поверхность крышек 10-сантиметровых чашек для культуры тканей (до 50 капель на крышку). Установите крышки на их нижние аналоги, содержащие PBS-P/S. Инкубируйте при 37 °C и 5% CO2,
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поместите 5-7 мл PBS-P/S в чашку для культивирования ниже висящих капель, чтобы избежать испарения капель.
  3. Наблюдайте за образованием агрегатов в каплях через 3 дня с помощью стереомикроскопа. Если более 40 из 50 капель содержат образовавшиеся агрегаты, соберите капли с крышек с помощью микропипетки объемом 1 мл и перенесите агрегаты непосредственно на первичные монослои кардиомиоцитов крысы (приготовленные с шагом 2.1-2.7; 10 капель/лунка). Избегайте интенсивного пипетирования для сохранения целостности заполнителя.
  4. Агрегатные сокультуры выдерживают в инкубаторах до 2 недель, меняя полный объем среды (2 мл DMEM-F12, содержащего 10% FBS и 1% P/S на лунку) каждые 72 ч.
    1. Ежедневно наблюдайте за прикреплением агрегатов к слоям питающих клеток с помощью светлопольной микроскопии. Записывайте сжатые агрегаты при наблюдении.
  5. Подготовка агрегатов к анализу.
    1. Удалите среду и добавьте 2 мл PBS на лунку 6-луночной чашки для культивирования тканей. Удалите PBS и добавьте 2 мл диссоциационного раствора на лунку. Инкубировать в течение 3 минут при 37 °C и 5% CO2.
    2. Центрифугируйте при 400 х г в течение 5 мин для получения клеточной гранулы. Повторно суспендируйте в среду, как указано для применений, описанных на последующих этапах (см. шаги 4.1, 5.1 и 6.1), и пропустите через сетчатый фильтр с длиной 70 мкм.

4. Проточная цитометрия (FC) и флуоресцентно-активируемая сортировка клеток (FACS)

  1. Инкубируют клеточные суспензии (1 x 105 клеток в 200 мкл PBS, содержащих 3% FBS) с флуорофор-конъюгированными (FITC или APC) первичными антителами (т.е. CD49f, Cx43, TRA-1-85, HLA-A, HLA-G и SIRPA для FC или TRA-1-85 для FACS; 1:40) при 4 °C в течение 30 мин, защищенных от света.
  2. Центрифугируйте (400 x g, 5 мин) и ресуспендируйте клетки в 1 мл PBS с 3% FBS для FC или PBS с 0,5% FBS для FACS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: ФК МСК была оптимизирована Hong et al.41.
  3. Поддерживайте ячейки при температуре 4 °C в темноте до тех пор, пока они не будут готовы к анализу с помощью FC (не менее 1 x 10,4 события) или FACS. Отсортируйте ячейки так, как описано в описании41. Перетарка TRA-1-85 высокоположительными отсортированными клетками в 6-луночные планшеты (1 x 104 ячейки/лунка, 2 мл DMEM-F12, содержащего 10% FBS и 1% P/S) в течение 1 ч.<бр/> ПРИМЕЧАНИЕ: Стратегию гейтирования поверхностного антигена клетки человека TRA-1-85 см. на дополнительном рисунке.

5. Иммуноцитохимия (ИКХ) и микроскопия

  1. Клеточные суспензии, полученные из сокультур (шаг 3.5.2) или FACS (раздел 4), повторно помещают на предметные стекла камеры (1 x 104 клеток/лунку, 2 мл DMEM-F12, содержащего 10% FBS и 1% P/S на лунку). Дайте клеткам прикрепиться на ночь в инкубаторе для тканевых культур (условия см. в разделе 1).
  2. Зафиксируйте клетки с помощью 3 мл 4% параформальдегида (PFA) в PBS на 15 минут при комнатной температуре. Умыться 3 раза 3 мл PBS, содержащей 1% бычьего сывороточного альбумина (BSA; PBS-BSA) в течение 5 мин за промывку.<бр/> Внимание: При работе с PFA надевайте соответствующие средства индивидуальной защиты.
  3. Проникните клетки в 3 мл PBS-BSA с 0,1% Triton X-100. Инкубировать при комнатной температуре в течение 10 минут для внутриклеточных антигенов (т.е. альфа-саркомерного актинина (aSarc) и Cx43) или 25 мин для внутриядерных антигенов (т.е. Mef2c и ядерного антигена человека (HuNu)). Простирайте 3 раза 3 мл PBS-BSA в течение 5 минут за одну стирку.
  4. Блокируйте образцы против реакций на неспецифические антитела с помощью 3 мл PBS, содержащего 5% нормальной козьей сыворотки (NGS) и 1% BSA в течение 15 минут при комнатной температуре. Простирайте 3 раза 3 мл PBS-BSA в течение 5 минут за одну стирку.
  5. Инкубируйте клетки первичных антител (т.е. Mef2c, aSarc, Cx43 и HuNu), разведенных в соотношении 1:200 в 3 мл PBS-BSA при 4 °C в течение ночи.
  6. Промыть 3 раза 3 мл PBS-BSA в течение 5 мин за промывку и инкубировать со вторичными антителами в течение 30 мин при комнатной температуре. Простирайте 3 раза 3 мл PBS-BSA в течение 5 минут за одну стирку.
  7. Храните окрашенные образцы в 3 мл монтажного носителя.
  8. Получение изображений с помощью флуоресцентного микроскопа. Используйте 10-кратный объектив (NA = 0,3) и 20-кратный объектив (NA = 0,45) для получения изображений с меньшим увеличением. Используйте кубы флуоресцентного фильтра и длины волн для GFP (ex = 470/22 нм, em = 525/50 нм) и RFP (ex = 531/40 нм, em = 593/40 нм) для используемых вторичных антител (см. Таблицу материалов и оборудования).
  9. Количественная оценка изображений с помощью программного обеспечения для обработки изображений (рекомендуемое программное обеспечение см. в таблице материалов и оборудования). Нормализуйте показания интенсивности флуоресценции в соответствии с данными вторичного контроля.

6. Выделение РНК и количественная ОТ-ПЦР

  1. Подготовьте образцы РНК из недифференцированных культур МСК или МСК, отсортированных из сокультур, с использованием выделения РНК на основе столбцов, в соответствии с инструкциями производителя. Приготовьте 1 x 104 до 1 x 106 клеток в 0,7 мл буфера для лизиса клеток (входит в комплект для выделения РНК) для каждого образца.
  2. Получите кДНК из концентрации до 2 мкг РНК на 100-л RT-реакции.
  3. Проведите кПЦР с использованием 10 нг кДНК за реакцию (40 циклов, 60 °C при температуре отжига/удлинения).
    1. Используйте праймеры для MY6H и cTnT человека в концентрации 500 нМ и 1-100 нг кДНК на реакцию (см. Таблицу материалов и оборудования). Используйте GAPDH, ACTB и HPRT в качестве внутренних нормализаторов уборки. Используйте коммерчески доступные кардиомиоциты, полученные из индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток, в качестве положительного контроля.
      Примечание: Экспрессируйте изменение экспрессии в несколько раз по сравнению с недифференцированными образцами кДНК, полученными из MSC.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

HUCPVCs демонстрируют более высокий потенциал к образованию агрегатов и уровни экспрессии CD49f по сравнению с BMSCs:

Для индукции дифференцировки hMSC (т. е. FTM HUCPVC, term HUCPVC и BMSC) суспензии одиночных недифференцированных MSC или висячие капли, содержащие MSC (Таблица 1), переносили на монослои первичных кардиомиоцитов крысы для создания прямых кокультур или агрегатных кокульт...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Сердца дифференцировки стволовых клеток был стадии разработки более 2 десятилетий, с несколько различных стратегий, которые используются для создания клетки cardiomyocyte как из источников MSC. Многие из этих стратегий, однако, являются неэффективными, и условия, используемые часто не являются репрезентативными окружающей среды пересаженные клетки встреча в естественных условиях.

В отличие от существующих методов протокола, представленные здесь использует комбинацию первичных сердца ф...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Доктор Клиффорд л Librach является совместное держателем патента: методы изоляции и использования клеток, полученных от первого триместра ткани пуповины, предоставлены в Канаде и Австралии.

Благодарности

Авторы поблагодарить следующих сотрудников и исследования сотрудников за их вклад: Мэтью Librach, Лейла Maghen, Таня A. Baretto, Шломит Кенигсберг и Andrée Готье-Фишер. Эта работа была поддержана Онтарио исследовательский фонд - передовых научных исследований (ORF-ре, раунд #7) и создать программы инк

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,25% Трипсин/ЭДТАGibco25200056Для диссоциации клеток
Alpha-MEMGibco12571071Для культуральных сред HUCPVC и BMSC.
ПЭ-конъюгированное антитело к человеку/мыши CD49fBiolegend313612Интегрин маркер для FC
APC-конъюгированного антитела человека Cx43/GJA1R& D SystemsFAB7737Aмаркер Connexin 43 для FC
FITC-конъюгированного антитела HLA-A2Genway Biotech Inc.GWB-66FBD2Маркер иммуногенности для FC
FITC-конъюгированных антител против HLA-G [MEM-G/9]Abcamab7904Маркер иммуногенности для FC
FITC-конъюгированных мышиных антител против человека SIRPA/CD172aAbD Serotec/Bio-RadMCA2518FСердечный маркер для FC
APC-конъюгированных антител человека TRA-1-85/CD147R& D SystemsFAB3195AМаркер клеток человека для FC и FACS
FITC-конъюгированных антител человека TRA-1-85/CD147R& D SystemsFAB3195Fмаркер клеток человека для FC и FACS
Anti-connexin 43/GJA1 антителаAbcamab1370Cx43. Для
козьего анти-кроличьего IgG (H+L) перекрестно абсорбированного вторичного антитела, Alexa Fluor 555Life TechnologiesA-21428Для ICC
антисаркомерного альфа-актинина [EA-53] антителаAbcamab9465aSARC. Для
Goat против мышей IgM тяжелой цепи перекрестно абсорбированного вторичного антитела, Alexa Fluor 555Life TechnologiesA-21426Для ICC
Mef2C (D80C1) XP антитела к кроликуNew England BioLabs Ltd.5030SДля
ICC Donkey Anti-rabbit IgG (H+L) вторичное антитело, Alexa Fluor 488Life TechnologiesA-21206Для ICC
Anti-nuclei (HuNu) (клон 235-1) антителоEMD MilliporeMAB1281для
ICC MZ9.5 StereomicroscopeLeicaДля визуализации агрегатов.
1,5 мл центрифужная микропробиркаAxygenMCT-150-Cдля окрашивания МСК флуоресцентным красителем.
ImageJПрограммное обеспечение для обработки изображений с открытым исходным кодом.
Ария II Объект BDUHN SickKids FC. Для сортировки ячеек.
Месехимальные стромальные клетки костного мозгаLonzaPT-2501BMSCs
Бычий сывороточный альбуминSigma-AldrichA7030-100GBSA. Для приготовления растворов для ICC
BrdUEMD MilliporeMAB3424внимание: BrdU является сильным тератогеном и подозревается в мутагене. Пожалуйста, убедитесь в надлежащем обучении и обратитесь к паспорту безопасности перед использованием.
Объект Canto IIBDUHN SickKids FC. Для проточной цитометрии.
cDNA EcoDry PremixClontech/Takara639570Для получения кДНК для qPCR
CellTracker Green CMFDA DyeLife TechnologiesC7025Флуоресцентная визуализация цитоплазмы клетки
Countess автоматизированный счетчик клетокInvitrogen Inc.C10227Для подсчета клеток
DMEM-F12Sigma-AldrichD6421Для среды для культивирования первичных кардиомиоцитов крыс.
Фосфатно-солевой буферныйраствор GibcoотD-PBS, без Ca2+, Mg2+
EVOSLife TechnologiesСобственный флуоресцентный микроскоп
FACSCaliburBDIn-house. Для проточной цитометрии.
Фетальная бычья сыворотка (Hyclone)GE HealthcareSH3039603FBS. Компонент среды для культивирования клеток.
Зонды IDT Prime Time qPCRIntegrated Data TechnologiesFAM флуорофорhttp://www.idtdna.com/pages/products/gene-expression/primetime-qpcr-assays-and-primers
Lab Vision PermaFluor Водная монтажная средаThermoScientificTA-030-FMДля хранения клеток, проходящих ICC
LSR II Объект BDUHN SickKids FC. Для проточной цитометрии.
MoFlo AstriosBeckman CoulterUHN SickKids FC Facility. Для сортировки ячеек.
Нормальная козья сыворотка Технологияклеточной сигнализации5425SNGS. Используется в блокирующем растворе для ICC
Nunc Lab-Tek II Chamber Coverglass, 8-луночныйThermo Scientific Nunc155409Для подготовки образцов для ICC
OmniPur Triton X-100 SurfactantEMD Millipore9410-OPВ качестве компонента проникающего раствора при подготовке клеток для ICC
Paraformaldehyde, 16% Solution, EM GradeElectron Microscopy Sciences15710Для фиксации клеток для ICC.
Пенициллин/стрептомицинGibco15140122компонент клеточной питательной среды.
ПраймерыSigmaCustom Standard DNA Oligos, обессоленные, 0,2 μ molCTnT_F: GGC AGC GGA AGA GGA TGC TGA A; CTnT_R: GAG GCA CCA AGT TGG GCA TGA A; MYH6 F: GCA AAG TAC TGG ATG ACA CGC T; MYH6 R: GTC ATT GCT GAA ACC GAG AAT
G Quorum Spinning Disk ConfocalZeissSickKids Imaging Facility
ReproCardio Кардиомиоциты, полученные из клеток hiPSReproCellRCD001NПоложительный контроль для количественной ПЦР
RNeasy mini kitQiagen74106Для выделения РНК для количественной ПЦР
Rotor-Gene SYBR Green PCR KitQiagen204074Для количественной ПЦР с мастер-миксом
RPMI 1640GibcoA1049101Для МСК, моноцитарная кокультуральная среда.
TaqMan qPCR праймерные анализыThermo Fisher Scientific4444556Для количественной ПЦР
Trypan BlueLife TechnologiesT10282Окрашивание клеток на жизнеспособность и подсчет
TrypsinGibco272500108Для диссоциации клеток
VolocityPerkin-ElmerVolocity 6.3Программное обеспечение для визуализации
0,2 μ m поровый фильтрThermo Fisher Scientific566-0020Для стерилизации питательных сред тканей
HERAcell 150i CO2 ИнкубаторThermo Fisher Scientific51026410Для инкубации
клеток фосфатно-солевой буферный раствор DulbeccoSigma-AldrichD8537PBS. 1X, без хлорида кальция и хлорида магния
щипцыAlmedic7727- А10-704Для передачи крысиного сердца. Можно использовать любые подобные щипцы.
НожницыFine Science Tools14059-11Для измельчения крысиного сердца. Рекомендуется использовать изогнутые ножницы.
Туба 50 млBD Falcon352070Для сбора во время сбора кардиомиоцитов и процедур общей культуры тканей
15 мл тубаBD Falcon352096Для процедур общей культуры тканей
6-луночные планшетыThermo Scientific NuncCA73520-906Для культуры тканей
10 см чашки для культуры тканейCorning25382-428Для образования агрегатов
Axiovert 40C МикроскопZeissДля визуализации в светлом поле на протяжении всей культуры тканей и остальной части протокола
70 и мкм; m клеточное сетчатое фильтрFisherbrand22363548Для обеспечения суспензии одной клетки перед проточной цитометрией или сортировкой
Triton X-100EMD Millipore9410-1LИспользуется в растворе для пермеабилизации ICC
Hoechst 33342Thermo Fisher ScientificH1399Окрашивание используется при визуализации локализации Cx43
ICC ICC Dulbecco 10010023

Ссылки

  1. Badano, L. P., et al. Prevalence, clinical characteristics, quality of life, and prognosis of patients with congestive heart failure and isolated left ventricular diastolic dysfunction. J Am Soc Echocardiogr. 17 (3), 253-261 (2004).
  2. Leri, A., Kajstura, J., Anversa, P. Cardiac stem cells and mechanisms of myocardial regeneration. Physiol Rev. 85 (4), 1373-1416 (2005).
  3. Orlic, D., et al. Mobilized bone marrow cells repair the infarcted heart, improving function and survival. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (18), 10344-10349 (2001).
  4. Schuster, M. D., et al. Myocardial neovascularization by bone marrow angioblasts results in cardiomyocyte regeneration. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 287 (2), 525-532 (2004).
  5. Zandstra, P. W., et al. Scalable production of embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Tissue Eng. 9 (4), 767-778 (2003).
  6. Boheler, K. R., et al. Differentiation of pluripotent embryonic stem cells into cardiomyocytes. Circ Res. 91 (3), 189-201 (2002).
  7. Kattman, S. J., et al. Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines. Cell Stem Cell. 8 (2), 228-240 (2011).
  8. Dixon, J. E., Dick, E., Rajamohan, D., Shakesheff, K. M., Denning, C. Directed differentiation of human embryonic stem cells to interrogate the cardiac gene regulatory network. Mol Ther. 19 (9), 1695-1703 (2011).
  9. Stennard, F. A., et al. Cardiac T-box factor Tbx20 directly interacts with Nkx2-5, GATA4, and GATA5 in regulation of gene expression in the developing heart. Dev Biol. 262 (2), 206-224 (2003).
  10. Dubois, N. C., et al. SIRPA is a specific cell-surface marker for isolating cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 29 (11), 1011-1018 (2011).
  11. Panteghini, M. Present issues in the determination of troponins and other markers of cardiac damage. Clin Biochem. 33 (3), 161-166 (2000).
  12. Burridge, P. W., et al. Improved human embryonic stem cell embryoid body homogeneity and cardiomyocyte differentiation from a novel V-96 plate aggregation system highlights interline variability. Stem Cells. 25 (4), 929-938 (2007).
  13. Ovchinnikov, D. A., et al. Isolation of contractile cardiomyocytes from human pluripotent stem-cell-derived cardiomyogenic cultures using a human NCX1-EGFP reporter. Stem Cells Dev. 24 (1), 11-20 (2015).
  14. Moscoso, I., et al. Differentiation "in vitro" of primary and immortalized porcine mesenchymal stem cells into cardiomyocytes for cell transplantation. Transplant Proc. 37 (1), 481-482 (2005).
  15. Ramkisoensing, A. A., et al. Gap junctional coupling with cardiomyocytes is necessary but not sufficient for cardiomyogenic differentiation of cocultured human mesenchymal stem cells. Stem Cells. 30 (6), 1236-1245 (2012).
  16. van Kempen, M., et al. Expression of the electrophysiological system during murine embryonic stem cell cardiac differentiation. Cell Physiol Biochem. 13 (5), 263-270 (2003).
  17. Mummery, C. L., et al. Differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells to cardiomyocytes: a methods overview. Circ Res. 111 (3), 344-358 (2012).
  18. Puceat, M. Protocols for cardiac differentiation of embryonic stem cells. Methods. 45 (2), 168-171 (2008).
  19. Naito, H., et al. Optimizing engineered heart tissue for therapeutic applications as surrogate heart muscle. Circulation. 114, 1 Suppl 72-78 (2006).
  20. Zimmermann, W. H., et al. Heart muscle engineering: an update on cardiac muscle replacement therapy. Cardiovasc Res. 71 (3), 419-429 (2006).
  21. Hulot, J. S., et al. Considerations for pre-clinical models and clinical trials of pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cell Res Ther. 5 (1), 1(2014).
  22. Wakitani, S., Saito, T., Caplan, A. I. Myogenic cells derived from rat bone marrow mesenchymal stem cells exposed to 5-azacytidine. Muscle Nerve. 18 (12), 1417-1426 (1995).
  23. Caplan, A. I. Adult Mesenchymal Stem Cells: When, Where, and How. Stem Cells Int. 2015, 628767(2015).
  24. Burchfield, J. S., Dimmeler, S. Role of paracrine factors in stem and progenitor cell mediated cardiac repair and tissue fibrosis. Fibrogenesis Tissue Repair. 1 (1), 4(2008).
  25. Hsiao, S. T., et al. Comparative analysis of paracrine factor expression in human adult mesenchymal stem cells derived from bone marrow, adipose, and dermal tissue. Stem Cells Dev. 21 (12), 2189-2203 (2012).
  26. Tomita, S., et al. Autologous transplantation of bone marrow cells improves damaged heart function. Circulation. 100, 19 Suppl 247-256 (1999).
  27. Skerjanc, I. S. Cardiac and skeletal muscle development in P19 embryonal carcinoma cells. Trends Cardiovasc Med. 9 (5), 139-143 (1999).
  28. Hou, J., et al. Combination of BMP-2 and 5-AZA is advantageous in rat bone marrow-derived mesenchymal stem cells differentiation into cardiomyocytes. Cell Biol Int. 37 (12), 1291-1299 (2013).
  29. Yoon, J., et al. Differentiation, engraftment and functional effects of pre-treated mesenchymal stem cells in a rat myocardial infarct model. Acta Cardiol. 60 (3), 277-284 (2005).
  30. Xing, Y., Lv, A., Wang, L., Yan, X. The combination of angiotensin II and 5-azacytidine promotes cardiomyocyte differentiation of rat bone marrow mesenchymal stem cells. Mol Cell Biochem. 360 (1-2), 279-287 (2012).
  31. Yuan, Y., et al. Differentiation of mesenchymal stem cells into cardio myogenic cells under the induction of myocardial cell lysate. Zhonghua Xin Xue Guan Bing Za Zhi. 33 (2), 170-173 (2005).
  32. Toma, C., Pittenger, M. F., Cahill, K. S., Byrne, B. J., Kessler, P. D. Human mesenchymal stem cells differentiate to a cardiomyocyte phenotype in the adult murine heart. Circulation. 105 (1), 93-98 (2002).
  33. Yannarelli, G., et al. Donor mesenchymal stromal cells (MSCs) undergo variable cardiac reprogramming in vivo and predominantly co-express cardiac and stromal determinants after experimental acute myocardial infarction. Stem Cell Rev. 10 (2), 304-315 (2014).
  34. Rangappa, S., Entwistle, J. W., Wechsler, A. S., Kresh, J. Y. Cardiomyocyte-mediated contact programs human mesenchymal stem cells to express cardiogenic phenotype. J Thorac Cardiovasc Surg. 126 (1), 124-132 (2003).
  35. Bakogiannis, C., et al. Circulating endothelial progenitor cells as biomarkers for prediction of cardiovascular outcomes. Curr Med Chem. 19 (16), 2597-2604 (2012).
  36. Deb, A., et al. Bone marrow-derived cardiomyocytes are present in adult human heart: A study of gender-mismatched bone marrow transplantation patients. Circulation. 107 (9), 1247-1249 (2003).
  37. Laflamme, M. A., Myerson, D., Saffitz, J. E., Murry, C. E. Evidence for cardiomyocyte repopulation by extracardiac progenitors in transplanted human hearts. Circ Res. 90 (6), 634-640 (2002).
  38. Quaini, F., et al. Chimerism of the transplanted heart. N Engl J Med. 346 (1), 5-15 (2002).
  39. Alvarez-Dolado, M., et al. Fusion of bone-marrow-derived cells with Purkinje neurons, cardiomyocytes and hepatocytes. Nature. 425 (6961), 968-973 (2003).
  40. Nygren, J. M., et al. Bone marrow-derived hematopoietic cells generate cardiomyocytes at a low frequency through cell fusion, but not transdifferentiation. Nat Med. 10 (5), 494-501 (2004).
  41. Hong, S. H., et al. Ontogeny of human umbilical cord perivascular cells: molecular and fate potential changes during gestation. Stem Cells Dev. 22 (17), 2425-2439 (2013).
  42. Sarugaser, R., Ennis, J., Stanford, W. L., Davies, J. E. Isolation, propagation, and characterization of human umbilical cord perivascular cells (HUCPVCs). Methods Mol Biol. 482, 269-279 (2009).
  43. Sarugaser, R., Lickorish, D., Baksh, D., Hosseini, M. M., Davies, J. E. Human umbilical cord perivascular (HUCPV) cells: a source of mesenchymal progenitors. Stem Cells. 23 (2), 220-229 (2005).
  44. Kadivar, M., et al. In vitro cardiomyogenic potential of human umbilical vein-derived mesenchymal stem cells. Biochem Biophys Res Commun. 340 (2), 639-647 (2006).
  45. Baksh, D., Yao, R., Tuan, R. S. Comparison of proliferative and multilineage differentiation potential of human mesenchymal stem cells derived from umbilical cord and bone marrow. Stem Cells. 25 (6), 1384-1392 (2007).
  46. Wu, K. H., et al. Cardiac potential of stem cells from whole human umbilical cord tissue. J Cell Biochem. 107 (5), 926-932 (2009).
  47. Yannarelli, G., et al. Human umbilical cord perivascular cells exhibit enhanced cardiomyocyte reprogramming and cardiac function after experimental acute myocardial infarction. Cell Transplant. 22 (9), 1651-1666 (2013).
  48. Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: The ARRIVE guidelines for reporting animal research. J Pharmacol Pharmacother. 1 (2), 94-99 (2010).
  49. Yu, K. R., et al. CD49f enhances multipotency and maintains stemness through the direct regulation of OCT4 and SOX2. Stem Cells. 30 (5), 876-887 (2012).
  50. Lee, R. H., et al. The CD34-like protein PODXL and alpha6-integrin (CD49f) identify early progenitor MSCs with increased clonogenicity and migration to infarcted heart in mice. Blood. 113 (4), 816-826 (2009).
  51. Szaraz, P., et al. In Vitro Differentiation of First Trimester Human Umbilical Cord Perivascular Cells into Contracting Cardiomyocyte-Like Cells. Stem Cells Int. 2016, 7513252(2016).
  52. Bauwens, C., Yin, T., Dang, S., Peerani, R., Zandstra, P. W. Development of a perfusion fed bioreactor for embryonic stem cell-derived cardiomyocyte generation: oxygen-mediated enhancement of cardiomyocyte output. Biotechnol Bioeng. 90 (4), 452-461 (2005).
  53. Jing, D., Parikh, A., Tzanakakis, E. S. Cardiac cell generation from encapsulated embryonic stem cells in static and scalable culture systems. Cell Transplant. 19 (11), 1397-1412 (2010).
  54. Hare, J. M., et al. Comparison of allogeneic vs autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cells delivered by transendocardial injection in patients with ischemic cardiomyopathy: the POSEIDON randomized trial. JAMA. 308 (22), 2369-2379 (2012).
  55. Huang, X. P., et al. Differentiation of allogeneic mesenchymal stem cells induces immunogenicity and limits their long-term benefits for myocardial repair. Circulation. 122 (23), 2419-2429 (2010).
  56. Hare, J. M., et al. A randomized, double-blind, placebo-controlled, dose-escalation study of intravenous adult human mesenchymal stem cells (prochymal) after acute myocardial infarction. J Am Coll Cardiol. 54 (24), 2277-2286 (2009).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Дифференцировка кардиомиоцитовформирование агрегатовкардиальные фидерные слоипроточная цитометрияфлуоресцентная микроскопиямаркеры кардиомиоцитовдифференцировка HUCPVCоценка иммуногенностисокращающиеся клеточные кластеры
В пробирке Дифференцировка мезенхимальных стволовых клеток человека в функциональных клетки Cardiomyocyte как
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.