Method Article

Оптимизированный протокол для извлечения белков из митрального клапана человека

DOI:

10.3791/55762

⸱

June 14th, 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Centro Cardiologico Monzino IRCCS, 2Cardiovascular Tissue Bank of Milan, Centro Cardiologico Monzino IRCCS, 3Department of Clinical Sciences and Community Health, Cardiovascular Section, University of Milan, 4Department of Cardiovascular Disease, Development and Innovation Cardiac Surgery Unit, Centro Cardiologico Monzino IRCCS

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Белковый состав митрального клапана человека все еще частично неизвестен, поскольку его анализ осложняется низкой клеточностью и, следовательно, низким биосинтезом белка. Эта работа обеспечивает протокол для эффективного извлечения белка для анализа протеома митрального клапана.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Анализ клеточного протеома может помочь выявить молекулярные механизмы, лежащие в основе болезней, из-за развития технологий, которые позволяют широкомасштабную идентификацию и количественную оценку белков, присутствующих в сложных биологических системах. Знания, полученные из протеомического подхода, могут потенциально привести к Лучшее понимание патогенных механизмов, лежащих в основе болезней, позволяющих идентифицировать новые диагностические и прогностические маркеры болезни и, надеюсь, терапевтических целей. Однако сердечный митральный клапан представляет собой очень сложный образец для протеомического анализа из-за низкой клеточности в протеогликане и обогащенном коллагеном внеклеточном матриксе. Это затрудняет извлечение белков для глобального протеомического анализа. Эта работа описывает протокол, который совместим с последующим анализом белка, таким как количественная протеомика и иммуноблоттинг. Это может обеспечить корреляцию данных вГ белка с данными о количественной экспрессии мРНК и не количественном иммуногистохимическом анализе. Действительно, эти подходы, когда они выполняются вместе, приведут к более полному пониманию молекулярных механизмов, лежащих в основе болезней, от мРНК до посттрансляционной модификации белка. Таким образом, этот метод может иметь отношение к исследователям, заинтересованным в изучении физиопатологии сердечного клапана.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Недавние данные изменили понимание роли многих регуляторных механизмов, которые возникают после синтеза мРНК. Действительно, трансляционные, посттранскрипционные и протеолитические процессы могут регулировать количество и функцию белка. Догма - в которой говорится, что концентрации мРНК являются проксимидами, соответствующими концентрациям соответствующих белков, предполагая, что уровни транскрипции являются основным фактором, определяющим количество белков, - были частично пересмотрены. В результате уровни транскрипции лишь частично предсказывают обилие белка, предполагая, что посттранскрипционные события Происходят для регулирования белков в клетках 1 , 2 .

Кроме того, белки в конечном счете диктуют функцию клетки и, следовательно, диктуют ее фенотип, который может подвергаться динамическим изменениям в ответ на аутокринную, паракринную и эндокринную факторы; Кровные посредники; температура; Лечение наркозависимости; И болезни развиваютсяМент. Таким образом, анализ экспрессии, сфокусированный на уровне белка, полезен для характеристики протеома и разгадать критические изменения, которые происходят с ним как часть патогенеза болезни 3 .

Таким образом, возможности, которые протеомика представляет для выяснения состояния здоровья и болезней, являются грозными, несмотря на существующие технологические проблемы. Особенно перспективные области исследований, к которым могут вносить протеомики: идентификация измененной экспрессии белка на любом уровне ( т . Е. Целые клетки или ткань, субклеточные клетки и биологические жидкости); Идентификация, верификация и валидация новых биомаркеров, полезных для диагностики и прогнозирования болезни; И, мы надеемся, идентификация новых белковых мишеней, которые могут быть использованы в терапевтических целях, а также для оценки эффективности и токсичности препарата 4 .

Захват сложностиПротеом представляет собой технологическую проблему. Существующие протеомические инструменты дают возможность проводить крупномасштабный высокопроизводительный анализ для идентификации, количественной оценки и проверки измененных уровней белка. Кроме того, внедрение методов фракционирования и обогащения, направленных на предотвращение интерференции, вызванной наиболее распространенными белками, также улучшило идентификацию белка путем включения наименее распространенных белков. Наконец, протеомика дополнена анализом посттрансляционных модификаций, которые постепенно появляются как важные модуляторы функции белка.

Однако подготовка проб и восстановление белка в анализируемых биологических образцах по-прежнему остаются предельными стадиями протеомического рабочего процесса и увеличивают потенциал возможных ловушек 5 . Действительно, в большинстве методов молекулярной биологии, которые необходимо оптимизировать, первыми шагами являются гомогенизация тканиИон и клеточный лизис, особенно при анализе белков с низким уровнем обилия, для которых методов амплификации не существует. Кроме того, химическая природа белков может влиять на их собственное выздоровление. Например, анализ высокогидрофобных белков очень сложный, поскольку они легко осаждаются во время изоэлектрической фокусировки, тогда как транс-мембранные белки почти нерастворимы (см. Ссылку 5). Кроме того, изменчивость состава ткани создает значительный барьер для разработки универсального метода экстракции. Наконец, поскольку почти все клинические образцы имеют ограниченное количество, необходимо обеспечить подготовку белка с максимальным восстановлением и воспроизводимостью из минимальных количеств проб 6 .

В этой работе описывается оптимизированный протокол экстракции белка из нормального митрального клапана сердца человека, который представляет собой очень сложный образец для протеомического анализа. Нормальный митральный клапан представляет собой компLex, лежащей между левым предсердием и левым желудочком сердца ( рис. 1 ). Он играет важную роль в контроле кровотока из атриума в желудочек, предотвращении обратного потока и обеспечении надлежащего уровня подачи кислорода всему телу, что обеспечивает адекватный сердечный выброс. Однако он часто считается «неактивной» тканью с низкой клеточностью и несколькими компонентами, главным образом в внеклеточной матрице. Это связано с тем, что в нормальных условиях резидентные клапанные интерстициальные клетки (VIC) представляют собой покоящийся фенотип с низкой скоростью биосинтеза белка 7 .

Однако было продемонстрировано, что в патологическом состоянии количество VIC в спонгиозе увеличивается, а их синтез белка активируется вместе с другими функциональными и фенотипическими изменениями 8 . Поэтому неудивительно, что минимальные данные, имеющиеся вВ литературе основное внимание уделяется анализу патологических митральных клапанов 9 , 10 , в которых увеличение числа активированных ВИП может объяснить относительно большое количество идентифицированных белков.

В заключение, настоящий протокол может служить для развития понимания патогенных механизмов, ответственных за болезни митрального клапана, путем изучения компонентов белка митрального клапана. Действительно, более глубокое понимание лежащих в основе патологических процессов могло бы помочь улучшить клиническое лечение клапанных заболеваний, чьи текущие показания к вмешательству в основном основаны на гемодинамических соображениях.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом протоколе человеческие сердца собираются во время мультиорганной эксплантации (время холодной ишемии 4-12 ч, в среднем 6 ± 2 ч) от доноров многих органов, исключенных из трансплантации органов по техническим или функциональным причинам, несмотря на нормальные эхокардиографические параметры. Они отправляются в сердечно-сосудистый тканевый банк Милана, Кардиологический центр Монзино (Милан, Италия) для лечения аортальных и легочных клапанов. Митральные задние листочки не используются в клинических целях, поэтому они собираются во время выделения аорты и легочного клапана после получения информированного согласия от родственников доноров. Ткань для трансплантации и исследований собирается только после согласия родителей; На листе согласия они разрешают (или не) использование сердечной ткани для исследования только в том случае, если оно не подходит для клинического применения ( т.е. микробиологических, функциональных и серологических проблем), следуя руководящим принципам комитета по этикеМонзино-кардиологический центр.

1. Подготовка митрального клапана

  1. Убирайте человеческий митральный клапан как можно скорее после эксплантации органа (время холодной ишемии 4-12 часов).
  2. В чистой комнате удалите сердце из транспортной сумки, содержащей холодный (4 ° C) раствор ( т. Е. Солевой раствор или сбалансированную среду Eurocollins или Wisconsin). Поместите его в ведро и поместите его в шкаф для биобезопасности (биологическая защита от вертикального воздушного потока, класс A, классификация надлежащей производственной практики (GMP)), чтобы продолжить подготовку клапана.
  3. Поместите сердце на стерильную одноразовую драпировку в шкафу. Используя стерильный одноразовый скальпель, полностью отрежьте сердце, перпендикулярно его главной оси, на уровне левого и правого желудочков, примерно на расстоянии 4 см от вершины.
  4. Переместите восходящую аорту и легочную артерию, чтобы отобразить левую предсердную крышу.
  5. С помощью стерильных автоклавируемых щипцов и кирков обрезать левое предсердие наЛевая предсердная крыша, делая видимым митральный клапан и позволяя идентифицировать большой митральный листок (передний) и маленький митральный листок (задний).
    ПРИМЕЧАНИЕ. Антеро-латеральные и задние медиальные комиссуры определяют границу передней листочки и задней области.
  6. Используя стерильные автоклавируемые ножницы и невращающиеся щипцы, рассекайте левый предсердие и толщину стенки желудочка по всей окружности всего митрального клапана .
  7. Определите непрерывность мито-аортального клапана.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Левый желудочек содержит весь митральный клапан и аккорды.
  8. Отделите лист переднего митрального клапана от листочка нижнего митрального клапана, отрежьте задний лист по вставке с желудочком (комиссурой).
  9. Промойте задний лист в физиологическом растворе. Отрежьте листовку на мелкие кусочки (<1 см 2 ) и индивидуально оберните их алюминиевой фольгой. Заморозить их жидким азотом,
    Осторожно: соблюдайте организационные правила безопасности при использовании жидкого азота.
    1. Санифицируйте таблицу шкафа раствором 70% изопропилового спирта и 6% раствором перекиси водорода в конце процедуры.

2. Выделение белка

  1. Используйте пинцет для забора образца, хранящегося в жидком азоте, и немедленно поместите его на сухой лед, все еще обернув в алюминиевую фольгу. Не оставляйте образец для оттаивания во время любых передач.
  2. Перед шлифованием охладите фарфоровый / циркониевый раствор и пестик системы измельчителя ( например, CryoGrinder) вместе с образцом, помещая их в колбу Дьюара, содержащую жидкий азот (~ 500 мл).
    Осторожно: соблюдайте организационные правила безопасности при использовании жидкого азота.
  3. Поместите раствор и пестик в полистирол, содержащий сухой лед. Удалите образец из алюминиевой фольги и положите ее в раствор.
  4. Измельчить tОн образец с большим пестиком против раствора 15-20 раз, используя отвертку для вращения пестика. Смешайте образец с кончиком предварительно охлажденного шпателя во время процесса измельчения.
    1. Повторите с маленьким пестиком.
  5. Перенесите образец почвы в предварительно взвешенную трубку ( например, пробирку с центрифугой на 15 мл), повернув трубку, поместив ее поверх раствора и перевернув вместе, чтобы переместить образец в трубку. Используйте предварительно охлажденный шпатель для извлечения всего материала из раствора.
    1. Держите трубку с образцом на сухом льду, чтобы избежать оттаивания образца во время переноса.
  6. Рассчитайте чистый вес образца.
  7. Очистите ступку и пестик после каждого образца и дезактивируйте их автоклавированием или нагрейте их при 200 ° C в течение 2 часов.
  8. Перенесите порошкообразный образец из центрифужной трубки в стеклянную трубку гомогенизатора путем инверсии.
  9. Добавить фильтрованный буфер мочевиныR (8 М мочевина, 2 М тиомочевины, 4% мас. / Об. CHAPS, 20 мМ Трис и 55 мМ дитиотреитола) в стеклянную трубку, 200 мкл мочевинного буфера для каждых 10 мг порошкообразной ткани.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Остаточный порошкообразный образец, оставшийся в пробирке для центрифуги, может быть восстановлен с использованием части расчетного объема буфера мочевины.
  10. Гомогенизируйте образец, используя мешалку, оборудованную боросиликатным стеклянным раствором и пептидом из политетрафторэтилена (ПТФЭ). Медленно нажмите пестик на образец с крутящим движением (1500 об / мин) 10 раз.
  11. Восстановите супернатант и перенесите его в чистую 1,7 мл центрифужную пробирку. Снова извлеките оставшийся образец свежим буфером мочевины, добавив половину объема, используемого во время первой экстракции.
  12. Повторите шаг 2.10.
  13. Восстановить супернатант и объединить его с супернатантом с шага 2.11. Поместите объединенный супернатант на ротатор трубки в течение 30 мин.
  14. Центрифугируйте пробирку в течение 30 минут при 13000 xg и 4 ° C.
  15. Восстановить супернатантD измерьте концентрацию белка, используя анализ белка Bradford, согласно инструкциям производителя. Храните образец при температуре -80 ° C до использования.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Экстракция и растворение белков в мочевиновом буфере непосредственно совместимы с протеомными методами, основанными на изоэлектрофокусировке (двумерный электрофорез (2-DE) 11 и жидкофазная изоэлектрическая фокусировка (IEF) 12 ) и с иммуноблоттингом после разбавления в буфере Лаэмми 13 Содержащий коктейль ингибитора протеазы 14 .

Дл...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Одним из важных шагов этого протокола является использование жидкого азота для замораживания образца и охлаждения системы измельчителя. Использование жидкого азота предотвращает биологическую деградацию и позволяет эффективно напылять, но требует специальной подготовки для безопасного обращения.

В этом протоколе представлена ​​система измельчителя для шлифования образцов, поскольку небольшие образцы трудно восстановить из стандартных растворов и пестиков. В этом случае небольшие образцы расп...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Министерство здравоохранения Италии поддержало это исследование (RC 2013-BIO 15). Мы благодарим Барбару Мишели за ее отличную техническую помощь.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Солевой раствор0,9 % NaCl
Eurocollins ASALF30874046Сбалансированная транспортная среда органов. Соедините 400 мл Eurocollins A со 100 мл Eurocollins B для получения сбалансированной среды Eurocollins
BSALF30874022Balanced organ's transport medium. Соедините 400 мл Eurocollins A со 100 мл Eurocollins B для получения сбалансированной среды Eurocollins
WisconsinBridge lifeRM/N 4081Сбалансированная среда для транспортировки органов
Biohazard вертикальный поток воздухаBurdinolaClass A GMP классификация
Dewar FlaskThermo Scientific Nalgene4150-1000
Система криогриндераOPS диагностикаCG 08-01Система шлифовальных машин, содержащая ступки, пестики и отвертку
Щипцы
Шпатель из нержавеющей стали Одноразовый
стерильный скальпельMedisafeMS-10
НожницыАвтоклавируемые
медиаторы МедиаторыАвтоклавируемые
Одноразовая стерильная простыняMon& Tex3.307.08
Стерилизующий раствор изопропиловым спиртом70% изопропиловый спирт
Стерилизующий раствор перекисьюводорода 6% перекисью водорода
Микропипетка, 1 мл, с наконечниками
15 мл центрифужные пробиркиVWR international9278
1,7 мл центрифужные пробиркиVWR международныйPIER90410
Буфер8 М мочевины, 2 М тиомочевина, 4 % в/в CHAPS, 20 мМ Тризма, 55 мМ Дитиотрейтол
МочевинаSigma aldrichU6504-1KGДля использования в буфере мочевины
Тиомочевина SigmaaldrichT8656Для использования в буфере
CHAPSSigma aldrichC3023-5GRДля использования в буфере
для мочевиныDithiotreitolSigma aldrichD0632-5GДля использования для буфера мочевины
Шприц 50 млPICДля использования для фильтрации буфера мочевины
0,22 &; m фильтрMilliporeSLGP033RBДля использования для фильтрации Буфер мочевины
PFTE Pestle, 2 млKartell6302Часть гомогенизатора Potter-Elvehjem
Раствор из боросиликатного стеклаKartell6102Часть гомогенизатора Potter-Elvehjem
МешалкаVELP scientificaМешалка DLHИспользуется для гомогенизации методом анализа белка Potter-Elvehjem
BradfordЛаборатории Bio-Rad5000006
Вращатель трубокPbi InternationalF205
Жидкий азот
Алюминиевая фольга
Лед
Полистирольный бокс Сухой
Для центрифугирования центрифужных пробирок объемом 1,7 мл при весе 13 000 x
g Морозильная камера -80&dg; C
Прецизионные весы
АвтоклавДля стерилизации
Криогенные перчатки для жидкого азота
Перчатки
Профессиональная печьвоздуха Для стерилизации
Коктейль ингибиторов протеазыSigma aldrichP8340-5ML100X solution
ProteoExtract Protein Precipitation KitCalbiochem539180
RapiGestWaters186001861
Cytoscapewww.cytoscape.orgверсии 2.7Программная платформа для анализа онтологии генов
BiNGOhttp://apps.cytoscape.org/apps/bingoверсии 3.0.3Плагин для анализа онтологии
генов AlphaB Crystallin/CRYAB AntibodyNovus BiologicalsNBP1-97494Мышиное моноклональное антитело против CryAB
Septin-11 AntibodyNovus BiologicalsNBP1-83824Rabbit поликлональное антитело против септина-11
FHL1 АнтителоNovus BiologicalsNBP-188745Rabbit поликлональное антитело против FHL-1
Dermatopontin AntibodyNovus BiologicalsNB110-68135Кролик поликлональное антитело против дерматопонтина
Козий Против мышиного IgG HRPSigma aldrichA4416-0,5MLВторичное антитело для иммуноблоттинга
Козий Антикролик IgG HRPBio-Rad laboratories170-5046Вторичное антитело для иммуноблоттинга
из нержавеющей стали из нержавеющей стали из нержавеющей стали мочевины мочевины лед Центрифуга для сухого льда с принудительной вентиляцией и естественной конвекцией

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Vogel, C., Marcotte, E. M. Insights into the regulation of protein abundance from proteomic and transcriptomic analyses. Nat Rev Genet. 13 (4), 227-232 (2012).
  2. de Sousa Abreu, R., Penalva, L. O., Marcotte, E. M., Vogel, C. Global signatures of protein and mRNA expression levels. Mol Biosyst. 5 (12), 1512-1526 (2009).
  3. Hanash, S. Disease proteomics. Nature. 422 (6928), 226-232 (2003).
  4. Ahram, M., Petricoin, E. F. Proteomics Discovery of Disease Biomarkers. Biomark Insights. 3, 325-333 (2008).
  5. Chandramouli, K., Qian, P. Y. Proteomics: challenges, techniques and possibilities to overcome biological sample complexity. Hum Genomics Proteomics. 2009, (2009).
  6. Singleton, C. Recent advances in bioanalytical sample preparation for LC-MS analysis. Bioanalysis. 4 (9), 1123-1140 (2012).
  7. Williams, T. H., Jew, J. Y. Is the mitral valve passive flap theory overstated? An active valve is hypothesized. Med Hypotheses. 62 (4), 605-611 (2004).
  8. Rabkin, E., et al. Activated interstitial myofibroblasts express catabolic enzymes and mediate matrix remodeling in myxomatous heart valves. Circulation. 104 (21), 2525-2532 (2001).
  9. Martins Cde, O., et al. Distinct mitral valve proteomic profiles in rheumatic heart disease and myxomatous degeneration. Clin Med Insights Cardiol. 8, 79-86 (2014).
  10. Tan, H. T., et al. Unravelling the proteome of degenerative human mitral valves. Proteomics. 15 (17), 2934-2944 (2015).
  11. Banfi, C., et al. Proteome of platelets in patients with coronary artery disease. Exp Hematol. 38 (5), 341-350 (2010).
  12. Banfi, C., et al. Proteomic analysis of human low-density lipoprotein reveals the presence of prenylcysteine lyase, a hydrogen peroxide-generating enzyme. Proteomics. 9 (5), 1344-1352 (2009).
  13. Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J Biol Chem. 193 (1), 265-275 (1951).
  14. Banfi, C., et al. Very low density lipoprotein-mediated signal transduction and plasminogen activator inhibitor type 1 in cultured HepG2 cells. Circ Res. 85 (2), 208-217 (1999).
  15. Brioschi, M., et al. Normal human mitral valve proteome: A preliminary investigation by gel-based and gel-free proteomic approaches. Electrophoresis. 37 (20), 2633-2643 (2016).
  16. Brioschi, M., Lento, S., Tremoli, E., Banfi, C. Proteomic analysis of endothelial cell secretome: a means of studying the pleiotropic effects of Hmg-CoA reductase inhibitors. J Proteomics. 78, 346-361 (2013).
  17. Sun, S., Zhou, J. Y., Yang, W., Zhang, H. Inhibition of protein carbamylation in urea solution using ammonium-containing buffers. Anal Biochem. 446, 76-81 (2014).
  18. Rabilloud, T., Adessi, C., Giraudel, A., Lunardi, J. Improvement of the solubilization of proteins in two-dimensional electrophoresis with immobilized pH gradients. Electrophoresis. 18 (3-4), 307-316 (1997).
  19. Santoni, V., Molloy, M., Rabilloud, T. Membrane proteins and proteomics: un amour impossible? Electrophoresis. 21 (6), 1054-1070 (2000).
  20. Shechter, D., Dormann, H. L., Allis, C. D., Hake, S. B. Extraction, purification and analysis of histones. Nat Protoc. 2 (6), 1445-1457 (2007).
  21. Fujiki, Y., Hubbard, A. L., Fowler, S., Lazarow, P. B. Isolation of intracellular membranes by means of sodium carbonate treatment: application to endoplasmic reticulum. J Cell Biol. 93 (1), 97-102 (1982).
  22. Gorg, A., Weiss, W., Dunn, M. J. Current two-dimensional electrophoresis technology for proteomics. Proteomics. 4 (12), 3665-3685 (2004).
  23. Mann, M., Kelleher, N. L. Precision proteomics: the case for high resolution and high mass accuracy. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (47), 18132-18138 (2008).
  24. Thakur, S. S., et al. Deep and highly sensitive proteome coverage by LC-MS/MS without prefractionation. Mol Cell Proteomics. 10 (8), M110.003699(2011).
  25. Loardi, C., et al. Biology of mitral valve prolapse: the harvest is big, but the workers are few. Int J Cardiol. 151 (2), 129-135 (2011).
  26. Schoen, F. J. Evolving concepts of cardiac valve dynamics: the continuum of development, functional structure, pathobiology, and tissue engineering. Circulation. 118 (18), 1864-1880 (2008).
  27. Lelovas, P. P., Kostomitsopoulos, N. G., Xanthos, T. T. A comparative anatomic and physiologic overview of the porcine heart. J Am Assoc Lab Anim Sci. 53 (5), 432-438 (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Protein ExtractionMitral ValveProteomic AnalysisUrea BufferLiquid Nitrogen GrindingBradford AssayTwo Dimensional ElectrophoresisLiquid Chromatography Mass SpectrometryGene Ontology AnalysisCardiac Valve Disease

Related Articles